周嘉寶，劉秋玉，王傳旭，陸黎黎，徐黎，高建東

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腎病研究所，上海中醫(yī)藥大學(xué)肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

高尿酸血癥是由血尿酸（SUA）生成增加或排泄減少引起的代謝性疾病。SUA穩(wěn)態(tài)改變與腎損傷密切相關(guān)。研究表明，治療高尿酸血癥可延緩慢性腎臟?。–KD）的進(jìn)展。高水平尿酸使腎臟抗凋亡和促凋亡蛋白表達(dá)失衡，釋放趨化因子和細(xì)胞因子，引起慢性炎癥和腎纖維化，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。目前，臨床常用降尿酸藥物如別嘌醇、非布司他等被作為腎臟保護(hù)劑，但其引起的過敏、心血管風(fēng)險(xiǎn)等不良反應(yīng)不可忽視。

表觀遺傳修飾主要包括DNA的共價(jià)修飾和組蛋白的翻譯后修飾，與腎臟疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2（EZH2）是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，通過催化組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化（H3K27me3），抑制靶基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，EZH2和H3K27me3在體外培養(yǎng)的腎成纖維細(xì)胞、單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠和CKD患者腎組織中高表達(dá)，抑制EZH2可阻斷高尿酸血癥小鼠腎組織H3K27me3和Cleaved Caspase-3表達(dá)，還可降低SUA，減輕腎損傷和纖維化。

降尿酸方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腎病科根據(jù)“活血通絡(luò)、化痰降濁”治法總結(jié)創(chuàng)立的經(jīng)驗(yàn)方，該方在減輕尿酸性腎病患者腰酸乏力等不適癥狀、降低血尿酸、抑制腎纖維化、保護(hù)腎功能等方面有一定作用，但具體作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過制備高尿酸血癥大鼠模型，觀察降尿酸方對高尿酸血癥大鼠腎損傷及組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2表達(dá)的影響，為高尿酸血癥及其腎損傷的中醫(yī)藥治療提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物許可證號SYXK（滬）2018-0016。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心室溫25 ℃、相對濕度45%環(huán)境，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批（SZY201604006）。

1.2 藥物

降尿酸方（酒大黃10 g，粉萆薢10 g，炒王不留行10 g，威靈仙15 g，鹽車前子15 g，炒芥子10 g，山楂10 g），免煎顆粒購自江陰天江藥業(yè)有限公司，蒸餾水加熱溶解，制成濃度為1.6 g/mL藥液。別嘌醇緩釋膠囊，規(guī)格0.25 g/粒，黑龍江澳利達(dá)奈德制藥有限公司，批號18030901，取內(nèi)容物，蒸餾水溶解，制成濃度為2.5 mg/mL藥液。

1.3 主要試劑與儀器

氧嗪酸鉀，山東中科泰斗有限公司，批號080601；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），上海麥克林生化科技有限公司，批號C10097951；Cleaved Caspase-3抗體，美國CST公司，貨號9661S；Bax抗體，英國Abcam公司，貨號ab182733；Bcl-2抗體，美國ABclonal公司，貨號A0208；GAPDH抗體，美國Proteintech公司，貨號60004-1-Ig；EZH2抗體，美國CST公司，貨號5246；H3K27me3抗體，美國CST公司，貨號9733；Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）抗體，美國Affinity公司，貨號AF7001；Ⅳ型膠原蛋白（ColⅣ）抗體，美國Affinity公司，貨號AF0510；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號分別為A0216、A0208；細(xì)胞凋亡試劑盒，瑞士Roche公司，貨號11684817910；PVDF膜，美國 Millipore公司，貨號 IPVH00005。離心機(jī)（美國Beckman公司，型號Avanti J-E），電泳及轉(zhuǎn)膜電源儀（美國 Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號 Tanon-5200），生物組織冷凍包埋機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號KD-BM），攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號KD-P），烘片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號KD-H）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及給藥

40只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、降尿酸方組和別嘌醇組，每組10只。實(shí)驗(yàn)第1日起，除正常組外，其余各組大鼠予氧嗪酸鉀溶液 1 500 mg/kg灌胃，6 h后降尿酸方組和別嘌醇組分別按16 g/kg、25 mg/kg予降尿酸方和別嘌醇灌胃（相當(dāng)于60 kg成人臨床用藥量6倍），給藥體積10 mL/kg，正常組和模型組予生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)12周。

2.2 樣本收集

給藥結(jié)束后，使用代謝籠收集大鼠24 h尿液檢測24 h尿蛋白（UTP），目內(nèi)眥采血檢測大鼠血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、SUA，樣品送至上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測。2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，摘取雙側(cè)腎臟，分別進(jìn)行病理觀察、免疫組化染色和Western blot檢測。

2.3 病理觀察

取大鼠腎組織，90%乙醇固定24 h，梯度乙醇脫水，浸蠟、石蠟包埋、切片（3 μm），脫蠟后行HE、Masson染色，中性樹脂封片，光鏡下觀察大鼠腎組織病理形態(tài)。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測

腎組織石蠟切片脫蠟至水，加入 Proteinase K，室溫孵育30 min，TUNEL染色，滴加converter-POD，室溫避光孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片，光鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，以細(xì)胞核黃褐色為陽性結(jié)果。

2.5 免疫組化染色

腎組織石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，3%BSA室溫封閉30 min，加入ColⅠ（1∶50）、ColⅣ（1∶50）、Cleaved Caspase-3（1∶400）、EZH2（1∶50）一抗，4 ℃孵育過夜，加二抗室溫孵育50 min，DAB顯色，中性樹脂封片，光鏡下觀察，以棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。使用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)陽性表達(dá)的積分光密度（IOD）和陽性染色面積（Area），計(jì)算平均光密度（MOD）。MOD＝IOD/Area。

2.6 Western blot檢測

RIPA裂解液裂解大鼠腎組織，BCA法測定蛋白濃度，等量蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)至 PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉40 min，分別加入Cleaved Caspase-3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、EZH2（1∶1 000）、H3K27me3（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜，加入HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶1 000）、山羊抗兔IgG（1∶1 000）二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 降尿酸方對模型大鼠腎功能的影響

與正常組比較，模型組大鼠SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠 SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平比較（±s）

4.2 降尿酸方對模型大鼠腎組織病理形態(tài)的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管管腔擴(kuò)張、管壁變薄，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、纖維化明顯，細(xì)胞外基質(zhì)增多；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠腎小管管腔擴(kuò)張、炎性細(xì)胞浸潤、纖維組織增生明顯減輕。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)（HE染色，×200）

圖2 各組大鼠腎組織形態(tài)（Masson染色，×200）

4.3 降尿酸方對模型大鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎組織凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，凋亡細(xì)胞主要為腎小管細(xì)胞；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠腎組織凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少。見圖3。

圖3 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)（TUNEL染色，×400）

4.4 降尿酸方對模型大鼠腎組織Ⅰ、Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)的影響

免疫組化染色顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織ColⅠ、ColⅣ蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠腎組織ColⅠ、ColⅣ蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.05，＜0.01）。見圖4、圖5、表2。

表2 各組大鼠腎組織ColⅠ和ColⅣ蛋白表達(dá)比較（±s，MOD）

圖4 各組大鼠腎組織ColⅠ蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖5 各組大鼠腎組織ColⅣ蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

4.5 降尿酸方對模型大鼠腎組織Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、EZH2和H3K27me3蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎組織 Cleaved Caspase-3、Bax、EZH2、H3K27me3蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠腎組織Cleaved Caspase-3、Bax、EZH2、H3K27me3蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。見圖6、表3。Cleaved Caspase-3和EZH2免疫組化結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。見表4、圖7、圖8。

圖6 各組大鼠腎組織Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、EZH2和H3K27me3蛋白免疫印跡

表3 各組大鼠腎組織Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、EZH2、H3K27me3蛋白表達(dá)比較（±s，相對表達(dá)量）

表4 各組大鼠腎組織 Cleaved Caspase-3、EZH2蛋白表達(dá)比較（±s，MOD）

圖7 各組大鼠腎組織Cleaved Caspase-3蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖8 各組大鼠腎組織EZH2蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

5 討論

高尿酸血癥是CKD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高水平尿酸可觸發(fā)腎臟內(nèi)細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、內(nèi)皮損傷、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活。體外實(shí)驗(yàn)顯示，尿酸能刺激腎小管上皮細(xì)胞凋亡和間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，直接或間接誘導(dǎo)腎臟成纖維細(xì)胞活化，促進(jìn)腎纖維化進(jìn)展。對于動物模型建立，研究顯示，大鼠予氧嗪酸鉀750 mg/kg灌胃5周后出現(xiàn)腎臟動脈病變、腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化等病理變化。Cristóbal-García 等給予大鼠氧嗪酸鉀 750 mg/kg連續(xù)灌胃 11～12周后，大鼠出現(xiàn)高血壓、腎血管收縮、腎小管損傷、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等變化。Liu等通過給予腺嘌呤和氧嗪酸鉀1 500 mg/kg混合液灌胃建立高尿酸血癥大鼠模型，實(shí)驗(yàn)第4周大鼠腎組織ColⅠ表達(dá)升高。本實(shí)驗(yàn)以氧嗪酸鉀1 500 mg/kg灌胃作為高尿酸血癥大鼠的造模方法，實(shí)驗(yàn)第 12周模型大鼠SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平明顯升高（＜0.05），腎組織出現(xiàn)纖維化病理特征，纖維化指標(biāo)ColⅠ、ColⅣ蛋白表達(dá)升高，凋亡細(xì)胞明顯增多，促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，提示大鼠出現(xiàn)腎功能下降和早期腎纖維化表現(xiàn)。給予降尿酸方干預(yù)后，大鼠SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平顯著降低（＜0.05），腎組織纖維化程度減輕，ColⅠ、ColⅣ蛋白表達(dá)降低，凋亡細(xì)胞明顯減少，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高，提示降尿酸方在治療大鼠高尿酸血癥同時(shí)可減輕高尿酸誘導(dǎo)的腎纖維化。

表觀遺傳修飾通過調(diào)控基因表達(dá)影響細(xì)胞生長、增殖等，在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。組蛋白修飾與多梳抑制復(fù)合物 2（PRC2）密切相關(guān)，EZH2是重要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶之一，作為 PRC2的催化亞基，在H3K27處觸發(fā)組蛋白H3甲基化，在促纖維化基因表達(dá)和調(diào)節(jié)腎纖維化中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，CKD患者腎組織EZH2表達(dá)升高，表明EZH2升高與腎臟疾病發(fā)生發(fā)展具有臨床相關(guān)性，并且可能與腎纖維化發(fā)病機(jī)制有關(guān)。Barrera-Chimal等發(fā)現(xiàn)，EZH2抑制劑或EZH2 siRNA可抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞激活、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，且抑制EZH2能緩解高尿酸血癥小鼠腎小管細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)。還有研究顯示，抑制EZH2能阻止 TGF-β1/Smad3信號通路和 EGFR/ERK1/2信號通路激活，抑制多種促腎纖維化趨化因子和細(xì)胞因子分泌。Shi等在高尿酸誘導(dǎo)的腎損傷小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，抑制EZH2可降低EZH2、Cleaved Caspase-3水平，減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡，降低SUA、黃嘌呤氧化酶活性，減輕腎間質(zhì)纖維化。本研究建立高尿酸血癥伴腎損傷、早期腎纖維化大鼠模型，觀察其EZH2水平，結(jié)果顯示，降尿酸方可降低模型大鼠腎組織EZH2蛋白表達(dá)，減輕腎組織病理損傷。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痰濕、血瘀在高尿酸血癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。病程初期飲食不節(jié)或先天不足，致痰濕內(nèi)生，阻滯中焦；中期久病入絡(luò)或臟氣衰退，痰瘀互結(jié)；后期邪傷臟腑，腎元衰竭。治宜活血化瘀、化痰降濁，據(jù)此創(chuàng)立降尿酸方，方中炒芥子、鹽車前子為君，利氣豁痰、溫中散寒、利小便、通腎氣；炒王不留行為臣，祛痰行血通絡(luò)；佐以粉萆薢、威靈仙祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛，山楂消食健胃、行氣散瘀，酒大黃瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)。

綜上所述，降尿酸方可減輕高尿酸血癥大鼠腎損傷，抑制早期腎纖維化發(fā)展，改善腎功能，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞凋亡、降低腎組織EZH2表達(dá)有關(guān)。