謝平 ，魏海峰 ，溫仁華 ，沈金海 ，郝春莉 ，陳良華

1.廈門華廈學院環(huán)境與公共健康學院，福建 廈門 361024；2.生化制藥福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361024；3.廈門市食品藥品安全重點實驗室，福建 廈門 361024；4.福建省亞熱帶植物研究所，福建 廈門 361006

涼粉草Benth.為唇形科涼粉草屬多年生草本植物，性涼，味甘淡澀，嚼之有膠性，可治中暑、糖尿病、高血壓、急性腎炎、牙痛、關節(jié)疼痛及黃疸等。研究表明，涼粉草富含多糖、黃酮、酚類及萜類等成分，具有抗氧化、降血壓、降血脂、降血糖及抗菌等藥理作用。涼粉草在福建各地種植歷史悠久，武平、建甌等地有 70多年的栽培歷史，屬傳統(tǒng)主產(chǎn)區(qū)，資源豐富，價格低廉，具有長期食用、炮制配伍的歷史，具有廣闊的產(chǎn)品開發(fā)利用前景。

在提取工藝優(yōu)化過程中，為彌補多指標成分優(yōu)化在確定權重系數(shù)時主觀賦值的不足，引入信息熵理論，可使權重系數(shù)的確定更具客觀性，某個屬性變異程度越大，系統(tǒng)越有序，則其權重系數(shù)越大。構建BP神經(jīng)網(wǎng)絡，模擬生物神經(jīng)結構，可在不知曉具體數(shù)學模型的情況下，通過自學與訓練解決實際問題。結合遺傳算法，模仿自然界生物進化思想進行全局尋優(yōu)，可解決BP神經(jīng)網(wǎng)絡收斂速度慢、容易陷入局部最小值的問題。

本研究以咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B、總黃酮含量及干膏收率為評價指標，采用L（3）正交試驗，結合信息熵理論確定權重系數(shù)計算綜合評分，并將數(shù)據(jù)用于訓練BP神經(jīng)網(wǎng)絡，通過遺傳算法進行尋優(yōu)，并與正交試驗結果比較，驗證其可行性，以提高工藝優(yōu)化的客觀性，從而優(yōu)化涼粉草的煎煮提取工藝，為其進一步開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試藥

UV-2450型紫外可見分光光度計（日本島津公司），LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司），XS205十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），ME55/02萬分之一電子天平（賽多利斯上海有限公司），JB/T5374-1991電子天平（奧豪斯國際貿易上海有限公司），CT15RT型臺式高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

涼粉草藥材，產(chǎn)地福建龍巖武平，經(jīng)廈門華廈學院環(huán)境與公共健康學院賴源發(fā)副教授鑒定為唇形科植物涼粉草Benth.的干燥全草。迷迭香酸對照品（批號RP180607，純度≥98%），成都麥德生科技有限公司；咖啡酸對照品（批號D18121724，純度≥98%）、紫草酸對照品（批號D19041017，純度≥98%）、紫云英苷對照品（批號 D19012403，純度≥98%），南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司；蘆丁對照品（批號 JZ15052601，純度≥98%），南京景竹生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 干膏收率測定

精密量取煎煮提取液25 mL，置已恒定質量（M）的蒸發(fā)皿中，于105 ℃干燥至恒重，置于干燥器中冷卻30 min，精密稱定質量（M），計算干膏收率。干膏收率（%）＝（M－M）/m×100%，式中，m為待測樣品中藥材總質量。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液制備

精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇溶解，制成濃度為0.206 0 mg/mL的對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液制備

精密稱取涼粉草藥材約20 g，加一定倍數(shù)水，浸泡0.5 h，根據(jù)試驗安排進行煎煮，四層濾布趁熱過濾，合并，得涼粉草煎煮提取液，濃縮，放置室溫，置于100 mL量瓶中，定容，搖勻，精密吸取2.0 mL，置于10 mL量瓶中，20%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，4 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.2.3 顯色方法及測定波長選擇

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各1.0 mL，置25 mL量瓶中，精密加入7.5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，精密加入7.5%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，精密加入4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，放置10 min，以缺供試品的顯色體系為空白，于200～800 nm波長范圍掃描。結果表明，對照品溶液及供試品溶液均在500 nm波長處有最大吸收峰，故確定測定波長為500 nm。

2.2.4 線性關系考察

分別精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、8.0 mL，置25 mL量瓶中，按“2.2.3”項下方法操作，以空白的顯色體系為參比，在500 nm波長處測定吸光度，以濃度 C（μg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。結果蘆丁的回歸方程為＝1.18×10－1.43×10（＝0.999 6），表明在8.24～65.92 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液3.0 mL，按“2.2.3”項下方法操作，于500 nm波長處重復測定6次吸光度并計算RSD，結果吸光度RSD＝0.24%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液3.0 mL，按“2.2.3”項下方法操作，分別于室溫放置0、5、10、15、20、25、30 min，于500 nm波長處測定吸光度，結果吸光度RSD＝2.48%，表明供試品溶液在顯色后30 min內穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗

取藥材約20 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下方法操作，于500 nm波長處測定吸光度并計算樣品中蘆丁的含量，結果總黃酮的平均含量為 28.23 mg/g，RSD＝2.53%，表明方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

分別精密量取已知含量的煎煮湯劑1.0 mL，分別精密加入蘆丁對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備，按“2.2.3”項下方法操作，于500 nm波長處測定吸光度并計算加樣回收率，結果平均回收率為 98.21%（RSD＝2.43%），表明方法準確度良好，見表1。

表1 總黃酮加樣回收率試驗結果

2.3 咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸 B含量測定

2.3.1 混合對照品溶液制備

精密稱取咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B對照品適量，加甲醇溶解，制成濃度分別為咖啡酸0.104 mg/mL、紫云英苷 0.118 mg/mL、迷迭香酸0.120 mg/mL、丹酚酸B 0.096 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備

同“2.2.2”項下方法。

2.3.3 陰性對照溶液制備

同“2.2.3”項下方法。

2.3.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

采用中譜紅RD-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～9.5 min，18%A；9.5～18.5 min，18%A→19%A；18.5～20 min，19%A→20%A；20～25 min，20%→22%A；25～35 min，22%A→24%A；35～42 min，24%A→30%A；42～50 min，30%A→18%A），流速1.0 mL/min，檢測波長320 nm，柱溫25 ℃，進樣量10 μL。在上述色譜條件下，各色譜峰分離效果良好，R＞1.5。

2.3.5 專屬性試驗

分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀進行測定。結果表明，色譜峰分離良好，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 涼粉草煎煮液HPLC圖

2.3.6 線性關系考察

精密量取“2.3.1”項下混合對照品溶液0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取系列對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀中，以濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線，結果見表2。

表2 4種成分線性關系考察結果

2.3.7 精密度試驗

取“2.3.1”項下混合對照品溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，按“2.3.4”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積，結果咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為 0.59%、1.28%、1.29%、2.88%，表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗

取“2.3.2”項下供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h，按“2.3.4”項下色譜條件測定，記錄峰面積，結果咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.23%、2.01%、2.64%、2.58%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.9 重復性試驗

稱取涼粉草藥材20 g，共6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.4”項下色譜條件測定并計算含量，結果咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B平均含量為0.11、0.07、0.16、0.12 mg/g，RSD分別為 2.54%、2.32%、2.32%、2.50%，表明該方法重復性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗

分別精密量取已知含量的涼粉草煎煮湯劑1.0 mL，分別精密加入混合對照品溶液，按“2.3.2”項下方法制備并按“2.3.4”項下色譜條件測定，計算咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸 B的回收率及RSD，結果見表3，表明該方法準確性良好。

表3 4種成分加樣回收率試驗結果

2.4 提取工藝單因素考察

采用煎煮提取方法，以干膏收率、總黃酮含量、咖啡酸含量、紫云英苷含量、迷迭香酸含量及丹酚酸B含量為指標，進行單因素考察。

2.4.1 煎煮時間

稱取涼粉草藥材約20 g，加入16倍量水，浸泡0.5 h，提取2次，每次分別提取0.5、1.0、1.5、2.0 h，取煎煮提取液，按“2.1”“2.2”“2.3”項下方法測定各指標。結果表明，隨著煎煮時間的延長，提取液中各指標含量逐漸上升，煎煮時間為2.0 h與1.5 h比較無明顯變化，故選擇煎煮時間為0.5、1.0、1.5 h進行后續(xù)研究。

2.4.2 加水倍數(shù)

稱取涼粉草藥材約20 g，分別加入10、12、14、16、18、20倍量的水，提取2次，每次提取1.5 h。取煎煮提取液，按“2.1”“2.2”“2.3”項下方法測定各指標。結果表明，隨著加水倍數(shù)的增加，提取液中各指標含量逐漸上升，加 18、20倍量水提取的各指標差異不大，故選擇加水倍數(shù)為 14、16、18倍進行后續(xù)研究。

2.4.3 提取次數(shù)

稱取涼粉草藥材約20 g，分別加入16倍量水，單次提取時間為1.5 h，分別提取1、2、3、4次，取煎煮提取液，按“2.1”“2.2”“2.3”項下方法測定各指標。結果表明，隨著提取次數(shù)的增加，提取液中各指標含量逐漸上升，提取3、4次后各指標差異不大，故選擇提取次數(shù)為1、2、3次進行后續(xù)研究。

2.5 提取工藝正交試驗

基于單因素考察結果，確定藥材浸泡時間為30 min；選擇加水倍數(shù)（A）、煎煮時間（B）、提取次數(shù)（C）為考察因素，以4種指標成分含量、總黃酮含量及干膏收率為綜合得分指標，建立三因素三水平正交試驗設計，采用L（3）正交試驗，因素水平見表4。按“2.2.2”項下方法制備9份供試品溶液，測定各指標，結果見表5，方差分析見表6。

表4 涼粉草煎煮提取工藝正交試驗因素水平

表5 涼粉草煎煮提取工藝L9（34）正交試驗結果

表6 涼粉草煎煮提取工藝正交試驗結果方差分析

由方差分析結果可知，各因素對綜合指標的影響順序為 C＞B＞A，即提取次數(shù)＞煎煮時間＞加水倍數(shù)，其中因素B、C有顯著影響（＜0.05）。正交試驗最佳工藝為ABC，即加16倍量水，煎煮3次，每次1.5 h。

2.6 基于信息熵賦權

計算得H＝[0.990 2，0.982 4，0.987 4，0.990 7，0.988 7，0.991 0]，W＝[0.090 6，0.163 5，0.451 7，0.105 7，0.105 0，0.083 5]，即總黃酮、咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B含量及干膏收率權重系數(shù)依次為 0.090 6、0.163 5、0.451 7、0.105 7、0.105 0、0.083 5，則＝（X/X×0.090 6＋X/×0.163 5＋/×0.451 7＋/×0.105 7＋丹酚酸B/丹酚酸B×0.105 0＋/×0.083 5）。

2.7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡與遺傳算法優(yōu)選

2.7.1 神經(jīng)網(wǎng)絡建模

采用Matlab R2018b軟件進行BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型建模及遺傳算法尋優(yōu)。以影響提取工藝的3個條件為輸入變量，各指標賦權后計算得到的綜合得分作為輸出變量，在每組數(shù)據(jù)基礎上增加△±i值（i＝±0.1%），使L（3）正交試驗每組數(shù)據(jù)產(chǎn)生8個虛擬樣本，增加訓練空間內的樣本密度。

當隱層節(jié)點數(shù)為 7時，訓練數(shù)據(jù)平均絕對誤差（MAE）、測試數(shù)據(jù)平均絕對誤差（MAE）、數(shù)據(jù)整體均方誤差（MSE）最小，見表7。最終確定為3個輸入層、1個輸出層、7個隱藏層節(jié)點的遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡模型，設定BP神經(jīng)網(wǎng)絡訓練循環(huán)次數(shù)為1 000，學習速率為默認值0.01，訓練誤差目標為0.000 01，對神經(jīng)網(wǎng)絡進行訓練。

表7 涼粉草煎煮提取工藝BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型神經(jīng)元數(shù)目優(yōu)化

為了檢驗模型的準確性，將檢驗樣本的自變量輸入模型，經(jīng)模型預測，得到預測值，將預測值與實際值進行比較，結果見圖2。預測值與實際值間誤差很小（正負誤差在1.0%以內），吻合度很高，表明所建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型穩(wěn)定且泛化能力強，可用于估算不同提取條件下的涼粉草提取效果。

圖2 涼粉草提取工藝BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型可靠性驗證試驗

2.7.2 遺傳算法尋優(yōu)

初始化神經(jīng)網(wǎng)絡，對輸入數(shù)據(jù)進行訓練，運用適應度函數(shù)，模擬生物遺傳過程，通過選擇、交叉和變異3個步驟形成新群體并篩選出優(yōu)秀的個體，當個體的適應度趨于收斂，達到最優(yōu)狀態(tài)。

遺傳算法中設置的參數(shù)為迭代進化次數(shù) 1 000次，種群規(guī)模10，交叉概率0.8，變異概率0.2，得到適應度曲線，見圖3。隨著迭代次數(shù)增加，適應度曲線逐漸上升并逐漸成一條直線時，表明該種群已達到最優(yōu)狀態(tài)，適應度較高的個體競爭勝出?？梢钥闯觯?jīng)300次迭代后達到最佳適應度，綜合得分的預測最大值為93.753 1，最佳提取工藝為加17.037 5倍量水、提取時間1.497 8 h、提取2.999 4次。

圖3 涼粉草提取工藝遺傳算法適應度曲線

2.8 提取工藝驗證

分別稱取3批涼粉草藥材各500 g，按正交試驗及BP神經(jīng)網(wǎng)絡-遺傳算法優(yōu)選得到的最佳提取工藝進行驗證試驗，結果RSD＜5%，綜合得分穩(wěn)定，見表8。表明優(yōu)化得到的工藝可行性較高，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

表8 涼粉草提取工藝驗證試驗結果（n＝3）

3 討論

涼粉草體積較大，吸水較多，故以吸水率為指標，單獨考察浸泡時間。精密稱取涼粉草藥材25 g，共8份，分別加水500 mL，浸沒藥材，密封，室溫放置，分別于10、20、30、40、50、60、90 min取樣，用四層紗布過濾，擰干，測定濾出水量，計算各時間點的吸水率。結果表明，涼粉草浸泡0.5 h后，吸水率已無明顯變化，基本達到飽和，故確定浸泡時間為0.5 h。

本試驗比較了流動相分別為甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液和甲醇-0.1%磷酸水溶液的等度洗脫及不同比例梯度洗脫程序，結果表明，以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫時，涼粉草中各成分的色譜峰分離效果良好且基線平穩(wěn)。

通過 HPLC-PDA分析，比較色譜圖，結果在波長320 nm處，涼粉草藥材中咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸及丹酚酸 B的色譜峰峰面積最大，且基線平穩(wěn)，故選擇檢測波長為320 nm。

中藥材含諸多有效成分，采用單一評價指標難以科學評價提取工藝，因此，本研究選擇多指標評價體系對涼粉草煎煮提取工藝進行優(yōu)選。在多指標評價體系中，各指標的權重分配顯得尤其重要。與BP神經(jīng)網(wǎng)絡結合遺傳算法等相關研究比較，本研究引入信息熵理論，通過信息熵處理復雜多量數(shù)據(jù)，對權重系數(shù)進行客觀賦權。權重系數(shù)完全來自正交試驗所得多指標數(shù)據(jù)，反映了指標成分在不同煎煮提取條件下變化的客觀規(guī)律，避免了數(shù)據(jù)間的相互影響，減少主觀因素對試驗結果的干擾。

采用正交試驗，只能在已知的水平下對涼粉草煎煮提取工藝進行優(yōu)化，不具有全局性，且提取工藝屬于多維非線性系統(tǒng)優(yōu)化問題，無明確數(shù)學模型；運用BP神經(jīng)網(wǎng)絡建立黑箱模型，彌補了正交試驗優(yōu)化在非線性關系中的不足，在構建BP神經(jīng)網(wǎng)絡的同時，引入 MAE、MAE、MSE及決定系數(shù)用于確定神經(jīng)元的數(shù)目，避免神經(jīng)元數(shù)目較多時可能出現(xiàn)過度擬合的情況；同時結合遺傳算法迭代進化，直至個體適應度達到最佳狀態(tài)，進行尋優(yōu)，使其成為一種全局優(yōu)選的算法。

本研究在單因素試驗基礎上，基于信息熵理論確定各指標權重系數(shù)，計算綜合得分，采用正交試驗并建立結構為3-7-1的三層BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡，結合遺傳算法進行尋優(yōu)，顯示該模型的可靠性，且能有效預測涼粉草的最佳煎煮提取工藝。驗證試驗結果表明，優(yōu)化所得的提取工藝重復性好、穩(wěn)定性高，可用于煎煮提取工藝的優(yōu)化。