劉成倩,李 紅,劉惠莉,梁洪宇,孫鳳萍,高 駿,易建中

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106)

貓泛白細(xì)胞減少癥(Feline panleukopenia,FP)也稱(chēng)貓瘟熱、貓細(xì)小病毒病,是由貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)引起的一種高度接觸性急性傳染病。FPV 在1928年首次被發(fā)現(xiàn),1935年正式命名為貓泛白細(xì)胞減少癥病毒[1-2]。FPV 可引起患病動(dòng)物高熱、嘔吐、腹瀉和白細(xì)胞明顯減少等癥狀,是目前肉食獸細(xì)小病毒中感染范圍最寬、致病性最強(qiáng)的一種[3]。

FPV 屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬成員,病毒粒子在電子顯微鏡下呈圓形或六邊形,無(wú)囊膜結(jié)構(gòu),核衣殼為軸對(duì)稱(chēng)的二十面體[4]。隨著細(xì)小病毒的不斷遺傳進(jìn)化,病毒DNA 基因組序列也隨之發(fā)生變異,其宿主選擇性、跨物種傳播、自然重組等生物學(xué)特性存在改變的可能[5]。細(xì)小病毒基因組主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2 和結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2。VP2 蛋白是構(gòu)成衣殼蛋白的主要成分,是主要的抗原蛋白,決定病毒的血凝活性,具有介導(dǎo)細(xì)小病毒感染宿主細(xì)胞的作用[6-7]。本試驗(yàn)從上海某寵物醫(yī)院采集疑似感染FPV 的貓糞便樣品,接種F81 貓腎細(xì)胞進(jìn)行病毒分離,并對(duì)分離株VP2 基因及全基因組進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,以期有效預(yù)防和控制該病毒。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

F81 貓腎傳代細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；2 ×taq mix、2 × Phanta Max Master Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；病毒核酸提取或純化試劑購(gòu)自上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司。FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 二抗購(gòu)自北京依珊匯通科技有限公司。Hoechst 33342 染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 病料的采集與處理

貓糞便樣品采集于上海某寵物醫(yī)院,經(jīng)FPV 試紙條檢測(cè)為陽(yáng)性。在采集的糞便樣本中加入5 倍體積的PBS,充分混勻,反復(fù)凍融3 次后離心取上清,過(guò)0.22 μm 濾膜,備用。

1.3 病毒的分離與培養(yǎng)

采用同步接毒法將過(guò)濾后的樣品上清按細(xì)胞培養(yǎng)液總體積的10%接種F81 細(xì)胞,置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱,盲傳4 代時(shí)細(xì)胞病變達(dá)80%,此時(shí)收毒,反復(fù)凍融3 次后收集上清,備用。

1.4 分離毒株P(guān)CR 鑒定

參考丁軻等[8]的方法設(shè)計(jì)特異性引物, 引物預(yù)擴(kuò)增片段大小559 bp。序列為FPV-F:GAATCTGCTACTCAGCCACCAAC,FPV-R:GTGCACTATAACCAACCTCAGC,由上海捷瑞生物工程有限公司合成。提取分離株第4 代F81 細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA,病毒DNA 的提取根據(jù)病毒核酸提取或純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 間接免疫熒光試驗(yàn)

將培養(yǎng)瓶中單層F81 細(xì)胞消化傳代并鋪96 孔板,將分離病毒同步接種到F81 細(xì)胞中,72 h 后棄掉培養(yǎng)基,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,PBST 緩沖液洗3 次,以小鼠抗FPV VP2 單克隆抗體為一抗,以FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 為二抗,分別進(jìn)行孵育清洗后,每孔加入50 μL Hoechst 33342 染色液,進(jìn)行細(xì)胞核的DAPI 染色,室溫作用15 min,PBST 緩沖液洗3 次,使用熒光倒置顯微鏡觀察熒光情況。

1.6 分離株全基因組序列測(cè)定

根據(jù)GenBank 已刊載的FPV 全基因組序列,利用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)5 對(duì)引物用于FPV 全基因分段擴(kuò)增,引物序列見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)體系:DNA 模板2 μL,2 × Phanta Max Master Mix 25 μL,上、下游引物各2 μL,ddH2O 19 μL。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃3 min；95 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃60 s,循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的5 段FPV基因序列拼接組裝成全基因組序列。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 分離株VP2 基因的克隆

根據(jù)GenBank 已刊載的FPV 全基因組序列,利用primer premier 5.0 軟件,設(shè)計(jì)l 對(duì)擴(kuò)增VP2 基因的引物,引物序列為FPV-VP2-F:AGAGACAATCTTGCACCAAT,FPV-VP2-R:ATGTTAATATAATTTCTAGGTGCT。PCR 反應(yīng)體系:DNA 模板2 μL,2× Phanta Max Master Mix 25 μL,FPV-VP2-F∕R(10 μmol∕L)各2 μL,ddH2O 19 μL。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃3 min；95 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃60 s,循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,利用DNA 凝膠回收試劑盒回收片段,之后連接pEASY-T1 克隆載體,挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.8 全基因組及VP2 基因變異分析

用DNAstar 軟件包中的SeqMan 軟件對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行校對(duì)和編輯,利用MegAlign 軟件進(jìn)行同源性分析并建構(gòu)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離

經(jīng)無(wú)菌處理過(guò)的糞便樣品接種F81 細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。在盲傳第2 代時(shí)出現(xiàn)20%的細(xì)胞病變(Cytopathic effect,CPE),細(xì)胞主要表現(xiàn)為圓縮、拉絲,第4 代時(shí)病變更明顯,對(duì)照組細(xì)胞界限完整,形態(tài)均一(圖1)。將其命名為FPV-SH05-2020。

圖1 感染FPV-SH05-2020 株的F81 細(xì)胞CPE(200 ×)Fig.1 CPE in F81 cells infected by FPV-SH05-2020 strain(200 ×)

2.2 病毒的PCR 鑒定

用檢測(cè)引物FPV-F∕R 對(duì)分離病毒基因組DNA 樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,得到的擴(kuò)增片段約559 bp(圖2),與預(yù)期相符。

圖2 分離病毒基因組的PCR 擴(kuò)增鑒定Fig.2 PCR analysis of viral DNA genome

2.3 間接免疫熒光試驗(yàn)

將分離得到的FPV-SH05-2020 接種F81 細(xì)胞,培養(yǎng)48 h 后,進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn),并利用細(xì)胞核的DAPI染色法進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)接毒細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光,說(shuō)明該分離毒株能與FPV VP2 抗體發(fā)生特異性反應(yīng)(圖3)。

圖3 間接免疫熒光檢測(cè)F81 細(xì)胞感染分離株FPV-SH05-2020(400 ×)Fig.3 IFA for the detection of virus isolate FPV-SH05-2020 infection F81 cells(400 ×)

2.4 全基因組序列測(cè)定

分5 段進(jìn)行分離株FPV-SH05-2020 全基因組序列的擴(kuò)增,凝膠電泳結(jié)果顯示,擴(kuò)增條帶分別為1 022 bp、937 bp、974 bp、1 056 bp、1 209 bp,與預(yù)期結(jié)果相符(圖4)。對(duì)擴(kuò)增的5 個(gè)片段進(jìn)行測(cè)序拼接后,獲得基因組片段全長(zhǎng)為4 614 bp。

圖4 分離株FPV-SH05-2020 全基因組分段擴(kuò)增Fig.4 Segmental Amplification of complete genome of FPV-SH05-2020 isolate

2.5 VP2 基因擴(kuò)增及測(cè)序

用引物FPV-VP2-F∕R 擴(kuò)增VP2 全基因序列,凝膠結(jié)果顯示,擴(kuò)增條帶約1 700 bp(圖5)。測(cè)序結(jié)果使用DNAstar 軟件拼接后,顯示FPV-SH05-2020 株的VP2 基因全長(zhǎng)1 755 bp,與預(yù)期相符。

圖5 VP2 基因序列擴(kuò)增Fig.5 Amplification sequence of VP2 gene

2.6 VP2 基因主要氨基酸位點(diǎn)分析

使用DNAstar MegAlign 軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank 登錄的FPVVP2 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),選取FPV-18LY0902 和FPV-JL03 作為參考毒株,重點(diǎn)分析決定宿主特異性的第80、93、103、323、564、568 位氨基酸位點(diǎn),結(jié)果顯示,本次分離的毒株VP2 基因上第80(K)、93(K)、103(V)、323(D)、564(N)、568(A)位氨基酸完全符合FPV 的序列特征(表2)。

表2 VP2 基因中主要氨基酸位點(diǎn)分析Table 2 Analysis of major amino acid sites of the VP2 gene

2.7 VP2 基因及全基因組氨基酸同源性與遺傳進(jìn)化分析

使用MegAlign 軟件將分離株的VP2 基因序列與GenBank 中的參考株序列進(jìn)行氨基酸同源性分析,結(jié)果表明,分離株FPV-SH05-2020 的VP2 基因與參考毒株的VP2 氨基酸序列同源性為98.3%—99.9%。由圖6 可知,本次分離的FPV-SH05-2020 毒株與中國(guó)株MN908257 和MT614366 親緣關(guān)系較近。

圖6 分離株FPV-SH05-2020VP2 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of VP2 gene from FPV-SH05-2020 isolate

使用MegAlign 軟件將分離株的全基因組序列與GenBank 中的參考株進(jìn)行氨基酸同源性分析,結(jié)果表明,本次分離株FPV-SH05-2020 的全基因組與參考毒株的全基因組氨基酸同源性為94.2%—98.8%。由圖7 可知,本次分離株FPV-SH05-2020 與中國(guó)株MN908257 和MT614366 親緣關(guān)系較近。

圖7 分離株FPV-SH05-2020 全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree of complete genome of FPV-SH05-2020 isolate

3 討論與結(jié)論

FP 在貓群中的發(fā)病率相對(duì)較高,該病也在不斷發(fā)生遺傳進(jìn)化,因此監(jiān)測(cè)該病毒在我國(guó)的流行變異情況,對(duì)防治該病及研制有效疫苗具有重要意義。FPV 為單股線(xiàn)狀DNA 病毒,在形態(tài)學(xué)和抗原性上與犬細(xì)小病毒(CPV)、貂腸炎病毒等都非常相似[9]。FPV 全長(zhǎng)約5 000 bp,FPV 基因組包括2 個(gè)開(kāi)放閱讀框,目前研究最多的是VP2 結(jié)構(gòu)蛋白,VP2 蛋白是主要免疫功能區(qū),可刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,為FPV 的主要免疫保護(hù)性抗原蛋白,也是決定FPV 的血凝性和宿主范圍的蛋白[10]。FPV VP2 蛋白的第80 位、93 位、103 位、323 位、564 位、568 位氨基酸位點(diǎn)是決定分離株抗原性和宿主性的關(guān)鍵位點(diǎn),這幾個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的變化會(huì)改變其抗原特性和宿主范圍[11]。

本試驗(yàn)從疑似感染FPV 的貓糞便樣品中分離出1 株病毒,將其命名為FPV-SH05-2020。與對(duì)照組相比,分離株在第2 代時(shí)出現(xiàn)少量病變,在第4 代時(shí)出現(xiàn)80%以上的病變,主要表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、拉絲、脫落。通過(guò)分段擴(kuò)增獲得分離株FPV-SH05-2020 基因組全長(zhǎng),為4 614 bp；獲得VP2 基因全長(zhǎng)1 755 bp,編碼584 個(gè)氨基酸。VP2 基因與參考毒株的VP2 基因氨基酸同源性為98.3%—99.9%,全基因組與參考毒株的全基因組氨基酸同源性為94.2%—98.8%。從氨基酸同源性來(lái)看,VP2 基因同源性高于全基因組的同源性,說(shuō)明FPV 的VP2 基因遺傳進(jìn)化較為保守。犬貓細(xì)小病毒衣殼蛋白VP2 基因的突變已被證實(shí)會(huì)影響不同抗原變體的進(jìn)化,其中第80 位、564 位、568 位氨基酸位點(diǎn)與FPV 能否在貓?bào)w內(nèi)繁殖有關(guān),而第93位、103 位、323 位氨基酸位點(diǎn)影響CPV 在犬內(nèi)繁殖[12]。本試驗(yàn)對(duì)分離株的這6 個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)這6 個(gè)位點(diǎn)未發(fā)生突變,符合FPV 的序列特征。本研究有助于完善上海地區(qū)FPV 遺傳進(jìn)化情況,為FPV 毒株分子流行病學(xué)研究、疫苗研發(fā)等奠定基礎(chǔ)。