李 帆，張琴星，童祥文，田高輝，顧力行，徐 瑤

武漢科技大學生命科學與健康學院 生物醫(yī)學研究院，湖北 武漢430081

1975年，洛克菲勒大學細胞生物學教授Bloble等［1］在一項研究中發(fā)現新合成的蛋白質具有內源性信號，即信號肽（signal peptide，SP），最后通過實驗驗證，他提出了“信號假說”，用以解答蛋白質合成后的去向問題。SP是一段存在于前體蛋白N-端的短肽鏈，能夠調節(jié)前體蛋白的折疊和轉移。研究［2-5］表明，在原核系統中，SP附著后，外源基因能夠在原核表達系統中成功表達并分泌，如芽孢桿菌、乳酸桿菌、L型細菌、大腸桿菌等。除此之外，SP還廣泛應用于真核表達系統，如昆蟲桿狀病毒表達系統和畢赤酵母表達系統［6-9］。由此可見，SP在蛋白質的分泌過程中扮演著極其重要的角色，通過分子生物學技術，優(yōu)化SP序列對于提高外源蛋白的分泌量及活性具有重要的實際意義。

嵌合抗原受體T淋巴細胞（chimeric antigen receptor T lymphocyte，CAR-T）技術是通過分子生物學和基因工程改造技術，將靶向特異性抗原的單鏈抗體的輕重鏈可變區(qū)（single chain antibody variable fragment，scFv）序列在患者的T細胞膜表面表達，進而特異性地殺死腫瘤細胞，達到治療癌癥的目的。CAR的基礎設計中包括一個腫瘤相關抗原結合區(qū)（通常來源于抗體抗原結合區(qū)域的scFv段）、一個細胞外鉸鏈區(qū)、一個跨膜區(qū)和一個細胞內信號區(qū)［10-11］。細胞膜外部分是從單克隆抗體中純化的抗原靶向部分，該抗體由scFv（重鏈和輕鏈可變區(qū)的融合蛋白）組成。scFv中的SP對自身的表達尤為重要，scFv的N端SP具有三重結構，并且與分泌蛋白的SP具有相同的特征［12-13］：疏水性α螺旋核心（h區(qū)），其N端側翼為極性氨基酸殘基（n區(qū)）。C端側翼在裂解位點（c區(qū)）的-1和-3處含有螺旋斷裂的脯氨酸和甘氨酸殘基，以及小的不帶電荷的殘基。scFv一旦與腫瘤抗原結合，它就會觸發(fā)T細胞活化并導致細胞因子釋放和T細胞增殖［14］。SP能促進CAR在T細胞膜表面的表達，因此，對SP結構進行優(yōu)化和選擇是提高CAR表達水平的重要方法。

本研究以CD19為CAR-T治療靶點，通過構建4種不同SP的CD19-CAR表達載體，研究4種不同來源的SP對CAR-T轉染效率的影響，并驗證其對CD19陽性腫瘤細胞的殺傷效果，為臨床治療急性淋巴細胞性白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）提供新的CAR-T治療方案。

1 材料和方法

1.1 細胞株與主要試劑

人胚腎細胞293T、K562細胞系和NALM-6細胞系均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），K562-CD19細胞系為武漢波睿達生物科技有限公司饋贈，大腸桿菌DH5α感受態(tài)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

慢病毒表達載體BRD-PTK-Kan購自武漢波睿達生物科技有限公司（自行構建并保存），慢病毒包裝載體pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pMD2.G均購自美國Addgene公司，大量質粒抽提試劑盒購自美國Axygen公司，胎牛血清、DMEM-Basic、RPMI-1640培養(yǎng)基及0.25%的Trypsin-EDTA均購自美國Gibco公司，PE-Labeled Human CD19 Protein購自北京百普賽斯生物科技有限公司，7-AAD購自美國BD Bioscience公司，鈣黃綠素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，Human IFN-γ precoated ELISA kit（Cat:1110002）和Human TNF-α precoated ELISA kit（Cat:1117202）ELISA試劑盒購自深圳達科為生物科技股份有限公司。寡核苷酸引物由武漢擎科生物科技有限公司合成。

1.2 4種不同SP的CD19-CAR分子的設計

CD19-CAR分子的單鏈抗體片段來源于GenBank：HM852952.1，將細胞外域CD19-scFv（包含SP1序列）、跨膜區(qū)、細胞內域共刺激因子CD28、4-1BB及CD3ζ依次串聯連接，獲得完整的CD19-CAR片段，CD19抗原的scFv可在細胞膜上穩(wěn)定表達。然后通過分子克隆技術將SP2、SP3、SP4替換CD19-CAR中原有的SP1，即可得到含不同SP的CD19-CAR分子。SP序列如表1所示。

表1 SP的核苷酸和氨基酸序列及來源Tab.1 Nucleotide and amino acid sequences and sources of SP

1.3 分子重組技術構建不同SP的PTK-CD19-CAR 載體

通過基因合成得到序列大小為792 bp的CD19-scFv序列，包括SP1、VL輕鏈、Linker連接肽和VH重鏈。此外，基因合成得到大小為804 bp的基因序列，包括hinge、共刺激因子CD28、41BB及CD3ζ等結構。

通過重疊PCR 技術，將上述兩段序列連接，得到CD19-CAR 片段，然后使用引物CAR-F、CAR-R（表2），擴增獲得不含SP1的CAR片段。用表2的引物序列分別擴增基因合成的SP2、SP3、SP4，使其帶有相同的同源臂，然后與不含SP1的CAR片段連接即可獲得含有不同SP的CD19-CAR片段。隨后，通過BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，利用亞克隆技術將其連接至慢病毒表達載體BRD-PTK-Kan。最終獲得分別含4種SP的CD19-CAR目的載體，即SP1-CD19-CAR、SP2-CD19-CAR、SP3-CD19-CAR和SP4-CD19-CAR，用于慢病毒包裝。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

1.4 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)K562細胞系、K562-CD19細胞系和NALM-6細胞系。HEK-293T細胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基，原代T細胞培養(yǎng)使用含1 000 U/mL IL2、1∶1 000的HEPES 1M、1∶1 000谷氨酰胺的TexMACS? GMP培養(yǎng)基；細胞通過添加或替換新鮮培養(yǎng)基維持生長，換液需要300×g離心5 min 去細胞上清，然后按2×106～3×106個/mL 的細胞密度添加培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻后置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 慢病毒的包裝、濃縮及滴度測定

利用第3代慢病毒包裝系統，由慢病毒包裝載體pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G和慢病毒表達質粒組成。用PEI轉染法將慢病毒系統4種質粒共轉染HEK-293T細胞，轉染比例為12∶10∶6∶5，然后37 ℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后收集上清液，采用超速離心法進行濃縮。滴度測定：采用6孔板，每孔鋪5×105個HEK-293T細胞，每孔分別加入0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μL的病毒，并加入聚凝胺（polybrene），使其濃度為5 μg/mL 。并設置陰性對照，72 h后通過PE-Labeled Human CD19 Protein用流式細胞術檢測HEK-293T細胞轉染效率并計算慢病毒滴度。每種病毒量設置2 組平行孔，實驗重復3 次。

1.6 慢病毒轉導T細胞構建CD19-CAR-T

顯微鏡下觀察待轉染細胞生長情況，取需要數目的生長狀況良好的待轉細胞；于6孔板中按感染復數等于5計算需要加入慢病毒濃縮液的量，補加Polybrene使其終濃度為5 μg/mL；37 ℃斜置溫育4 h，最后補加培養(yǎng)基至正常培養(yǎng)濃度。

1.7 流式細胞術檢測慢病毒感染T細胞表面CD19-CAR的表達

收集＞5×105個轉染待測轉效或表面表達的細胞于流式管中，并選取未染色或未處理細胞作為陰性對照。向每管中加入1～2 mL流式細胞術用Buffer（PBS＋2%～5%FBS，FBS維持細胞活性），300×g，離心5 min，去掉上清液，重復洗2遍，用流式細胞術用Buffer配制好工作濃度的染色抗體，并除盡離心后的上清液，重懸細胞于配制好的抗體中，4 ℃避光染色30 min。加入1～2 mL流式細胞術用Buffer終止染色，300×g，5 min離心，去掉上清液，重復洗2遍，加 2 μL 7-AAD 抗體（稀釋比例 1∶100）于 0.2 mL流式細胞術用Buffer中重懸細胞，2～3 h之內流式細胞儀分析檢測。

1.8 鈣黃綠素釋放法檢測各種SP CD19-CAR-T的細胞毒性

以T、SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19 和SP4-CD19細胞作為效應細胞，陽性靶細胞為表達CD19的NALM-6細胞系和K562-CD19細胞系，陰性靶細胞為不表達CD19的K562細胞系。將靶細胞用calcein-AM 標記后，將其接種于U底96孔培養(yǎng)板（100 μL/孔），接種密度為1 × 105個/mL。將體積為100 μL/孔，不同效靶比（25∶1、5∶1、1∶1）的效應細胞加入對應孔中，共培養(yǎng)體系用含5%胎牛血清的PBS。設置：陽性對照組（加入裂解液）和陰性對照組（加入 PBS），各組均設 4個復孔，37 ℃生化培養(yǎng)箱中溫育3 h。將96 孔板在常溫下700×g離心10 min，將每個孔中所有的上清轉移至新的平底96孔板預標記的對應的孔中。分參數設置酶標儀：激發(fā)光波長485/20，發(fā)射光波長530/25，掃描讀取熒光值。各組效應細胞的細胞毒性根據以下公式計算：特異性殺傷百分率（%）=（實驗組熒光值-陰性對照組熒光值）/（最大釋放組熒光值-陰性對照組熒光值）×100%，實驗重復3 次。

1.9 ELISA法檢測各種SP CD19-CAR-T內IFN-γ和TNF-α的分泌水平

取適量的靶細胞，加入5×103個K562細胞于96孔板中，作為陰性靶細胞組，陽性靶細胞組加入5×103個CD19＋的NALM-6 細胞，而空白組中不加入靶細胞，體積為100 μL。按照效應細胞比靶細胞為10∶1，加入T 細胞和4種SP的CD19-CAR-T（5×104個/孔，體積100 μL）于對應的孔中，每個樣品做3個復孔，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為共培養(yǎng)體系。37 ℃生化培養(yǎng)箱中溫育24 h后，將96 孔板常溫，700×g，10 min離心后收集100 μL上清液，按酶聯免疫吸附實驗試劑盒的說明書常溫操作檢測IFN-γ和TNF-α的分泌水平，在450 nm波長下檢測吸光度（D）值，并根據標準曲線計算各樣本細胞因子的含量（pg/mL）。

1.10 數據分析

本研究采用GraphPad Prism 8軟件進行數據分析，實驗數據以表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功構建分別含4種SP的CD19-CAR 重組質粒

利用基因合成和分子克隆技術成功獲得了含不同SP的CD19-CAR片段（圖1A），將4種CD19-CAR分子亞克隆至慢病毒載體BRD-PTKKan上。通過BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切進行鑒定，CD19-CAR分子的重鏈VH結構含有BamHⅠ酶切位點，則CD19-CAR分子被切成一段帶SP的序列和一段大小為1 052 bp大小的序列。結果顯示，含4種SP的重組質粒酶切后可見4條帶SP的序列大小分別為 544、547、550和541 bp，兩段序列加起來的大小與攜帶不同SP的CD19-CAR片段一致（圖1B）。此外，載體測序結果證實，4種CD19-CAR片段基因序列和插入的閱讀框與設計完全相符，證明4種慢病毒表達質粒SP1-CD19-CAR、SP2-CD19-CAR、SP3-CD19-CAR和SP4-CD19-CAR構建成功。

圖1 含4種不同SP慢病毒表達載體的構建Fig.1 Construction of recombinant lentiviral plasmid containing four different SP

2.2 成功制備4種慢病毒載體

流式細胞術檢測結果顯示，用濃縮的4種病毒液分別以 0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 μL的體積轉染HEK-293T細胞，以病毒添加量為0.4 μL 時計算對應的4 種慢病毒（S P 1、SP2、SP3和SP4）的滴度。結果顯示，SP4［（2.80±0.10)×108TU/mL］慢病毒的滴度顯著高于SP1［（1.40±0.09)×108TU/mL］、SP2［（1.70±0.11)×108TU/mL］、SP3［（2.10±0.19)×108TU/mL］（P＜0.01，圖2A），證明4種慢病毒包裝成功，可用于后續(xù)實驗。此外，如圖2B所示，病毒添加量為0.4 μL時對應的4種慢病毒（SP1、SP2、SP3和SP4）的轉染效率分別為11.3%、13.1%、16.6%和23.5%。

圖2 4種慢病毒的成功制備Fig.2 Successful preparation of four lentiviruses

2.3 4種不同SP的CD19-CAR在T細胞中的表達差異分析

通過流式細胞術檢測不同SP對CAR-T轉染效率的影響，結果如圖3所示，轉染效率隨著時間的延長呈現先上升后下降的趨勢，且SP4-CD19組顯著高于SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19組（P＜0.05）（圖3A）。并且在轉染效率最高的第6天檢測4組慢病毒感染組的表達情況，結果顯示，含4種SP的慢病毒（SP1、SP2、SP3和SP4）感染的T細胞成功表達CD19-CAR的比例分別為20.9%、22.6%、31.5%和38.6%（圖3B）。此外，本研究還檢測了相同時間點CD19陽性細胞的數量，結果顯示，SP4-CD19組的陽性細胞數均高于其他3組（圖3C），細胞增殖實驗結果顯示，含不同SP的CAR結構對CAR-T細胞的增殖活性差異無統計學意義（P＞0.05，圖 3D）。

圖3 4種CD19-CAR分子在T細胞中的轉染效率及增殖情況Fig.3 Transfection and expression rate of four CD19-CAR in the T cells and its proliferation activity

2.4 4種不同SP的CD19-CAR-T對靶細胞的殺傷效率

本研究通過流式細胞術進一步檢測4種SP的CAR-T的體外殺傷效力，實驗選擇不表達CD19的K562細胞作為陰性靶細胞，K562-CD19細胞（CD19穩(wěn)定表達細胞系）和NALM-6細胞（CD19表達陽性率為99.6%和99.5%），作為陽性靶細胞（圖4A）。

細胞毒性實驗結果（圖4B）顯示，用第6天的CAR-T殺傷靶細胞，在效靶比相同的條件下SP4-CD19細胞對K562-CD19腫瘤細胞的殺傷作用顯著高于SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19細胞和T細胞［效靶比為25∶1時，分別為（36.77±2.42）%、（15.15±1.35）%、（18.80±0.30）%、（31.58±1.47）%、（9.04±3.25）%，P＜0.01］。同樣SP4-CD19細胞對NALM-6腫瘤細胞的殺傷作用明顯高于SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19和T細胞［效靶比為25∶1時，分別為（23.43±1.13）%vs（11.16±0.48）%、（10.54±2.27）%、（1 7.9 0±1.5 3）%和（8.2 7±2.7 5）%，P＜0.01］。而兩者對CD19-腫瘤細胞K562的殺傷作用差異無統計學意義［效靶比為25∶1 時，分別為（3.75±0.95）%vs（3.06±0.80）%、（2.4 2±0.7 9）%、（4.0 0±1.0 6）%和（1.92±0.76）%，P＞0.05］。

圖4 4種CD19-CAR-T對CD19+靶細胞的殺傷效應Fig.4 Killing effect of four CD19-CAR-T on CD19+ target cells

2.5 4種不同SP的CD19-CAR-T中IFN-γ和TNF-α的分泌

前期研究發(fā)現，細胞因子IFN-γ和TNF-α可發(fā)揮協同作用殺死腫瘤細胞，因此本研究采用ELISA技術檢測細胞因子IFN-γ和TNF-α的釋放情況［15-16］。結果顯示，效靶比為10∶1 時，共培養(yǎng)24 h后，陽性靶細胞組與空 白 細 胞 組 相 比，T 細 胞I F N-γ 和T N F-α 的分泌水平沒有顯著變化［IFN-γ：（894.90±8.83）pg/mLvs（649.60±64.70）pg/mL，P＞0.05；TNF-α：（419.80±8.81）pg/mLvs（401.60±25.80）pg/mL，P＞0.05］，而4種不同SP的CD19-CAR-T中IFN-γ和TNF-α的分泌水平在陽性靶細胞組中顯著升高（圖5）。在陽性靶細胞組中，SP4-CD19細胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平比SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19細胞和T細胞顯著升高［IFN-γ：（5 819.00±281.90）pg/mLvs（2 626.00±154.50）pg/mL、（3 089.00±173.50）pg/mL、（3 844±39.08）pg/mL、（894.90±8.83）pg/mL，P＜0.01；TNF-α：（5 004.00±169.50）pg/mLvs（3 014.00±85.20）pg/mL、（3 351.00±66.43）pg/mL、（3 922.00±63.38）pg/mL和（419.80±8.81）pg/mL，P＜0.01］。

圖5 4種CD19-CAR-T IFN-γ和TNF-α分泌水平Fig.5 The secretion levels of IFN-γ and TNF-α among four CD19-CAR T

3 討論

ALL是淋巴細胞在分化早期惡性增殖造成的，可侵犯骨髓、血液和髓外部位，發(fā)病率高，預后和生存率不理想［17-18］。CAR-T免疫治療能靶向性地殺傷具有特異性抗原的ALL細胞，而對正常細胞無殺傷作用，這將大大降低脫靶效應，為ALL的臨床治療提供新的策略。有研究［19-20］表明，增加CAR在T細胞表面的表達可以增加CAR-T的抗腫瘤能力，這為治療ALL提供了一個全新的方案。本實驗成功構建了表達不同SP的CD19-CAR分子的T細胞，并在體外驗證出其具有靶向特異性，CD19抗原CAR對CD19＋ALL細胞有較為明顯的殺傷作用，并且SP4-CD19細胞的轉染效率和對CD19＋ALL細胞的殺傷作用明顯高于SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19細胞。該研究結果為CAR-T在臨床轉化中的優(yōu)化方案提供了重要的實驗依據。

近年來，靶向CD19的CAR-T在白血病的治療中取得了重大突破［21-22］，關于CAR結構的胞內域改造方面的研究也越來越深入，而對scFv的N端SP研究較少。CAR的主要結構包括抗原結合區(qū)（包含SP）、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和細胞內信號區(qū)［23］。這些元件都有各自獨特的功能，可以通過使用來源于各種蛋白的結構域組合，來優(yōu)化CAR的結構。因此，為了增強CAR結構在T細胞表面的表達及殺傷作用，本研究主要采用由單鏈抗體scFv、CD28跨膜區(qū)、CD28細胞內結構域、細胞內共刺激域4-1BB和CD3ζ鏈組成的第三代CAR的結構，并在此基礎上優(yōu)化了抗原結合區(qū)SP結構，從而增強對靶細胞的殺傷。從細胞毒性實驗結果可以看出，攜帶不同SP的SP-CD19 CAR-T對CD19＋ALL細胞表現出特異性的殺傷效果，由此可以證明，不同的SP能夠影響CAR在T細胞表面的表達以及對靶細胞的殺傷。

從研究結果可以看出，SP4-CD19細胞較其他SP的SP-CD19細胞對CD19＋ALL細胞殺瘤效應顯著增強。ELISA法檢測IFN-γ和TNF-α分泌水平結果顯示，在CD19＋腫瘤細胞刺激下SP4-CD19細胞較其他SP的SP-CD19細胞IFN-γ和TNF-α分泌水平顯著提高。研究表明，改造SP是一種有效增加重組蛋白表達量的方式［24］，并且SP具有極強的異質性，許多SP即使在不同物種之間也具有功能上的互換性［25］。這可能與CAR結構中的SP與SRP（信號識別顆粒）的識別有關，據推測，不同的SP對SRP表現出不同的親和力，SRP隨后決定了新生多肽鏈進入分泌途徑的效率［26-27］。本研究發(fā)現，SP4-CD19細胞的轉染效率和對靶細胞的殺傷力較其他3個SP均顯著升高，這可能與SP4結合SRP的效率有關，其中的分子機制及作用效應還有待進一步實驗驗證。

綜上所述，隨著國內外科學家們對免疫療法的深入研究，越來越多的研究者關注CAR-T對腫瘤細胞的殺傷作用［28］。本研究制備了含不同SP的CAR-T，并通過系統的體外實驗初步驗證了SP對提升CAR在T細胞表面表達的影響。從本實驗中CAR-T對靶細胞的體外功能鑒定結果來看，SP4-CD19細胞較其他SP的CAR-T對靶細胞的殺傷和細胞因子分泌水平顯著提高。這將為ALL的臨床精準治療提供參考，但是還需要通過動物實驗評估其安全性。

利益沖突聲明：所有作者均不存在利益沖突。