趙家賢，江道淮，叢斌斌，高 飛，王永勝

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），山東 濟南 250062；

2.山東省腫瘤防治研究院（山東省腫瘤醫(yī)院）乳腺病中心，山東 濟南 250117；

3.上?？萍即髮W(xué)，信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，混合成像系統(tǒng)實驗室，上海 201210；

4.中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)所與信息技術(shù)研究所，上海 200050；

5.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

乳腺癌前哨淋巴結(jié)（sentinel lymph node，SLN）的狀態(tài)反映腋窩區(qū)域淋巴結(jié)（lymph nodes，LN）轉(zhuǎn)移情況。前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)（sentinel lymph node biopsy，SLNB）已經(jīng)取代腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)成為診治早期乳腺癌區(qū)域LN轉(zhuǎn)移患者的首要方案。目前國內(nèi)及國際指南［1-2］推薦藍染法聯(lián)合核素法作為SLN的定位方法。然而藍染料顆粒直徑較小，不具有靶向性，易將次級LN染色，存在較高的假陰性率。核素存在放射性污染的問題，其制備過程復(fù)雜且需嚴格質(zhì)控，限制了放射性核素示蹤劑在臨床中的推廣［3-5］。為此我們研制了新型熒光靶向示蹤劑，將吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）與利妥昔單抗（rituximab，RIT）偶聯(lián)形成ICG-RIT，其以ICG產(chǎn)生熒光效應(yīng)，以RIT產(chǎn)生靶向定位效應(yīng)。該示蹤劑具有靶向SLN的性能，且無放射性污染，但目前以熒光脈管系統(tǒng)成像儀探測，ICG發(fā)出的熒光穿透組織厚度低，較難發(fā)現(xiàn)位置深的SLN，且易切斷淋巴管使熒光示蹤劑泄露導(dǎo)致周圍組織熒光污染，不易識別并定位SLN［6-7］。

光聲成像（photoacoustic imaging，PAI）是近年新興的成像技術(shù)，其結(jié)合了光學(xué)成像高對比度和超聲成像高穿透力的優(yōu)勢，具有良好的應(yīng)用前景。ICG是常用的小分子近紅外光聲造影劑，它是一種獲得中國國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的低毒染料，具有較高的摩爾吸光系數(shù)［（2.3×105/（mol·cm）］。在水溶液中，ICG的光吸收峰在波長為780 nm處，此波長下可獲得在熒光染料中較低的熒光量子產(chǎn)率（0.027）。ICG能迅速與血漿蛋白結(jié)合，結(jié)合后光吸收峰為805 nm，所以臨床上常利用其光聲效應(yīng)用作血流造影劑［8］。

本研究利用ICG-RIT的光聲效應(yīng)，以其作為光聲造影劑，搭建手持式光聲信號傳感系統(tǒng)（photoacoustic signal sensing system，PASS）及手持式光聲成像（photoacoustic imaging，PAI）系統(tǒng)，探索其探測富集ICG-RIT淋巴結(jié)的最佳探測深度，研究其定位SLN的準確性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及儀器

RIT 100 mg/10 mL，購自上海羅氏制藥有限公司；ICG 25 mg，購自丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責任公司；亞甲藍（methylene blue，MB）20 mg/2 mL，購自濟川藥業(yè)集團有限公司；明膠500 g，購自濟南槐蔭藍鯨實驗設(shè)備銷售經(jīng)營部；PASS及PAI系統(tǒng)，由上?？萍即髮W(xué)混合成像系統(tǒng)實驗室提供；MDM-I型熒光脈管系統(tǒng)成像儀，購自廊坊明德生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；SD大鼠，體重為200～300 g，雌性，無菌級，購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；雞胸組織自備；其他試劑為國產(chǎn)AR級。

1.2 搭建手持式PASS及手持式PAI

根據(jù)PAI原理搭建手持式PASS及手持式PAI。實驗采用能量為80～100 mJ的波長可調(diào)脈沖激光器（Phocus Mobile,OPOTEK,Carlsbad,CA），激發(fā)光源波長選擇本次實驗所測ICGRIT光吸收峰780 nm（圖1），脈沖重復(fù)頻率為10 Hz，脈沖持續(xù)時間為10 ns。激光通過光纖圍繞在頻率2.5 MHz，帶寬80%的單點超聲換能器（仿體實驗使用的超聲換能器廠商為日本奧林巴斯公司，人體組織試驗超聲換能器廠商為廣州多浦樂電子科技股份有限公司），與皮膚的距離不同產(chǎn)生直徑3～5 cm照射范圍，激光能量小于最大允許曝光量（20 mJ/cm2），信號通過示波器收集（圖2）。PAI采用同款激光器，激光通過光纖由兩側(cè)貼合于頻率7.5 MHz，帶寬80%的128通道線性陣列超聲換能器（廣州多浦樂電子科技股份有限公司），示意圖見圖3。

圖1 光聲造影劑光吸收譜對比Fig.1 Comparison of optical absorption spectra of different photoacoustic agents

圖2 手持式PASS結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 The diagram of the structure of hand-held photoacoustic signal sensing system

圖3 手持式PAI結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 The structure of hand-held photoacoustic imaging system

1.3 制備新型示蹤劑及模擬腋窩環(huán)境

根據(jù)我們團隊的研究［6-7］，以RIT與ICG最佳質(zhì)量比4∶1配制新型示蹤劑1 mL，含ICG 1.25 mg（1.613 mmol/L），RIT 5 mg（34.756 μmol/L）。ICG與RIT偶聯(lián)后其光吸收峰位于780 nm附近，與ICG光吸收峰780 nm近似，對比MB光吸收峰位于664 nm，血紅蛋白光吸收峰位于600 nm以下［9-10］（圖1）。偶聯(lián)的ICG-RIT保持抗體分子的完整性和免疫活性，且無菌、無致熱原，也無急性毒性。

仿體實驗以ICG-RIT染色明膠模仿體外LN，取5份1 mL ICG-RIT分別用無菌注射用水稀釋至100.00%、50.00%、25.00%、12.50%和6.25%備用；取10 g明膠，加入30 mL無菌注射用水隔水加熱溶解，在冷卻至室溫時加入不同濃度ICG-RIT染色，置于4 ℃冰箱靜置凝固，成型后分割成直徑0.5 cm，厚度0.3 cm的圓柱形仿體。有研究［11-12］顯示，雞胸組織光散射系數(shù)與人體乳腺組織相似，故本實驗采用雞胸組織模擬人體乳腺組織，將雞胸組織切割成長約7.0 cm，寬約3.0 cm，厚度約1.0 cm薄片。雞胸組織的確切厚度將通過PASS測量。

人體組織試驗在擬行SLNB患者術(shù)前3～18 h于6、12點位腺體內(nèi)注射99mTc-硫膠體（各0.6 mL 0.5 mCi，1 mCi=3.7×107Bq），同時患乳外上象限乳暈旁單點皮下注射ICG-RIT 1.0 mL，術(shù)中應(yīng)用核素法及熒光顯像法遵循 SLNB 操作規(guī)范行SLNB，術(shù)中取熒光顯像的SLN以明確ICG-RIT引流至SLN。收集乳房標本中遠離瘤床及LN的腋窩脂肪層，切割成長約5.0 cm，寬約3.0 cm，厚度約1.0 cm薄片以之模擬腋窩環(huán)境，其確切厚度通過PASS測量。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 光聲穿透組織深度實驗

1.4.1.1 仿體實驗

取不同濃度的ICG-RIT仿體，放置于不同層數(shù)雞胸組織下，用手持式PASS探測光聲信號。同時測量MB明膠仿體光聲信號作為對照。每組重復(fù)3次取平均值。實驗共采集30組數(shù)據(jù)（表1）。

1.4.1.2 人體組織試驗

取紅外熒光顯像的SLN，放置于不同層數(shù)腋窩脂肪下，用手持式PASS探測光聲信號，用手持式PAI與超聲成像對比其成像效果及穿透深度。試驗共采集10例原發(fā)性乳腺癌患者數(shù)據(jù)。患者均簽署知情同意書（2021年7月—12月就診于山東省腫瘤醫(yī)院乳腺外科一病區(qū)，共行10例次SLNB）。

1.4.2 大鼠SLNB模型實驗

1.4.2.1 實驗組

據(jù)解剖圖示及研究結(jié)果［13］顯示，SD大鼠后肢淋巴引流由雙側(cè)腘LN引流至髂LN，我們定義腘LN為SLN，髂LN為次級LN。取0.1 mL ICGRIT，含ICG 0.125 mg，麻醉大鼠后注射至大鼠后肢足墊皮下，據(jù)團隊既往研究［14］，注射后18 min后腘LN開始顯像，39 min達到最佳顯像效果。本實驗設(shè)置注射后30 min用PASS探測并記錄腘窩LN及髂LN光聲信號強度，同時行PAI。根據(jù)光聲信號及成像結(jié)果解剖大鼠后肢及盆腔，取出對應(yīng)LN并置于PASS下探測并記錄光聲信號強度。取3只SD大鼠重復(fù)實驗。

1.4.2.2 對照組

取0.1 mL MB（1 mg），麻醉大鼠后注射至大鼠后肢足墊皮下，重復(fù)上述實驗步驟。取3只SD大鼠重復(fù)實驗。

2 結(jié)果

2.1 PASS探測雞胸組織下ICG-RIT仿體

示波器采集信號均顯示雞胸組織置于仿體上時可探測到相同基礎(chǔ)信號，為雞胸組織的光聲信號，同時在基礎(chǔ)信號上ICG-RIT仿體呈現(xiàn)特征性單峰信號波形，證明PASS可特異性識別雞胸組織下的ICG-RIT仿體（圖4）。示波器采集數(shù)據(jù)后平均計算X軸距離，得0～4層雞胸組織平均厚度分別為0.00、15.13、24.84、39.72和52.42 mm。取單純雞胸組織基礎(chǔ)光聲信號為0，測得單純濃度100%的ICG-RIT仿體光聲信號強度為26.70 mV，在平均52.42 mm深處平均光聲信號強度為5.87 mV；對比100%MB在深度為0.00 mm處產(chǎn)生光聲信號強度19.45 mV，52.42 mm處產(chǎn)生光聲信號強度4.34 mV（表1）。隨著探測深度的增加，ICG-RIT濃度的降低，仿體的光聲信號逐漸減?。▓D4）。PASS探測25%ICG-RIT仿體達到最大探測深度62.22 mm，信號強度為2.75 mV（圖5）。6.25%ICG-RIT仿體在46.95 mm深度測得光聲信號強度最小可觀測值為2.74 mV，與基礎(chǔ)信號區(qū)分度小，不予采用（圖6）。

圖4 不同濃度ICG-RIT仿體在各深度下的光聲信號強度變化趨勢Fig.4 Amplitudes of ICG-RIT phantoms with different concentrations at different depths

圖5 25%濃度ICG-RIT仿體在各深度下的光聲信號圖Fig.5 Photoacoustic signals of 25% concentration ICG-RIT phantoms at different depths

2.2 PASS、PAI與US探測腋窩脂肪下SLN

術(shù)中應(yīng)用核素法及熒光法取得SLN，在熒光脈管系統(tǒng)成像儀中顯示為發(fā)光LN（圖7）。PASS探測腋窩脂肪獲取基礎(chǔ)信號（圖8），SLN在不同厚度脂肪下均呈現(xiàn)特征性單峰信號，且隨著深度減少光聲信號減弱，最大穿透深度為32.72 mm時光聲信號為31 mV，與6.25%的ICG-RIT在雞胸組織下光聲信號相似（圖6D）。PAI可清晰成像約2.5 cm深度SLN，對比超聲可成像約4 cm深度SLN（圖9）。

圖6 6.25%濃度ICG-RIT仿體在各深度下的光聲信號圖Fig.6 Photoacoustic signals of 6.25% concentration ICG-RIT phantoms at different depths

圖7 熒光法行SLNBFig.7 Lymph nodes in NIR fluorescence imaging system

圖8 SLN在不同層數(shù)腋窩脂肪下光聲信號圖Fig.8 Photoacoustic signals SLN at different depths

圖9 SLN在深度不同的腋窩脂肪下光聲成像與超聲成像Fig.9 Photoacoustic images and ultrasound images of SLN at different depths

2.3 ICG-RIT定位SLN的能力

ICG-RIT組，3只SD大鼠用PASS及PAI探測腘LN體表，距超聲換能器9.57 mm處探及高信號，光聲信號平均為2.00 mV，對側(cè)后肢腘LN處未探及明顯信號，髂LN處未探及明顯信號（圖10）。沿光聲信號解剖大鼠后肢未見綠染LN（圖10G、H）。取下LN后可見腘LN光聲信號平均為2.50 mV，髂LN未見明顯光聲信號。MB組，腘LN處距超聲換能器6.19 mm處探及光聲信號平均為2.25 mV，髂LN處距換能器14.34 mm處探及光聲信號平均為3.00 mV，PAI明確顯像腘LN及髂LN（圖11A～D），取出LN后見腘LN光聲信號平均為20.25 mV，髂LN光聲信號7.74 mV（圖12）。大鼠后肢注射ICG-RIT和MB各級LN光聲信號強度對比如表1所示。證明PASS能準確地定位富集ICG-RIT的LN，具有定位SD大鼠腘LN的性能，且在30 min內(nèi)無次級LN顯像。對比可看出，肉眼下MB染色的LN可視性優(yōu)于ICGRIT組（圖10G、H和圖11E、F）。

圖10 大鼠后肢注射ICG-RIT各級LN光聲信號強度及對應(yīng)光聲成像Fig.10 Amplitudes and photoacoustic images after injection of ICG-RIT

圖11 大鼠后肢注射MB各級LN光聲信號強度及對應(yīng)光聲成像Fig.11 Amplitudes and photoacoustic images after injection of MB

圖12 離體LN后光聲信號圖Fig.12 Amplitudes of ex vivo lymph nodes

表1 不同濃度ICG-RIT仿體在各深度下的光聲信號強度Tab.1 Amplitudes of ICG-RIT phantoms with different concentrations at different depths

表2 大鼠后肢注射ICG-RIT與MB各級LN光聲信號強度對比（mV）Fig.2 Amplitude differences between ICG-RIT and MB at different level lymph nodes

3 討論

SLNB是早期乳腺癌患者分期的標準技術(shù)，SLN陰性的患者可以豁免腋窩淋巴結(jié)清掃，從而減少腋窩淋巴結(jié)清掃引發(fā)的上肢淋巴水腫、感覺異常及運動障礙等并發(fā)癥［1-2］。因此準確定位并識別SLN是重要環(huán)節(jié)。當前指南［15］推薦藍染法聯(lián)合核素法作為SLN示蹤技術(shù)，但其仍存在一定的限制性，MB會使次級LN染色，可出現(xiàn)皮膚色素沉著導(dǎo)致壞死的不良反應(yīng)；核素具有放射性，同時其制備過程需嚴格質(zhì)控，這需要醫(yī)院配備核醫(yī)學(xué)科室［3-5］。理想的示蹤劑應(yīng)具備靶向性：局部注射后，由外周淋巴管網(wǎng)快速到達并大量積聚在SLN，不進入次級淋巴結(jié)；可視性：確保SLN可被準確識別，肉眼可見/可經(jīng)特殊設(shè)備探測發(fā)現(xiàn)；可重復(fù)性：易質(zhì)控；以及安全性、操作簡便、價格低廉等特點［8］。

為此，我們團隊研究將大分子的RIT與小分子的ICG進行偶聯(lián)，其原理為小分子ICG中的含硫活性基團與大分子RIT中的自由氨基相結(jié)合，每個大分子的利妥昔單抗能偶聯(lián)15～20個小分子ICG，新形成的ICG-RIT以ICG產(chǎn)生熒光效應(yīng)，以RIT產(chǎn)生靶向定位效應(yīng)。通過熒光成像儀顯像富集ICG-RIT的SLN，以此行SLNB。該新型示蹤劑制備工藝簡單且無放射性危害，為無菌、無致熱原、無急性毒性的示蹤劑。同時，ICG-RIT是一種粒徑穩(wěn)定的偶合物，通過透射電鏡確認其粒徑為200～300 nm，皮下注射時能通過淋巴管（100～500 nm）而不會進入毛細血管（20～50 nm）。當RIT與ICG以質(zhì)量比為4∶1制備，注射劑量為10 μL/20 mg小鼠時（含ICG 12.5 μg），在熒光成像系統(tǒng)中能達到SLN顯像且無次級LN顯像效果。但其最大穿透深度約為22 mm，實際操作中容易漏檢產(chǎn)生熒光效應(yīng)的淋巴管及LN［6-7，16］。

本研究利用ICG的光聲效應(yīng)，其依賴于光熱轉(zhuǎn)換，造影劑吸收脈沖激光引起局部熱彈性膨脹，隨后向外輻射超聲波，由于不同組織成分的光吸收系數(shù)不同，超聲換能器可以檢測到不同強度的超聲波，分析處理后即形成了組織光能吸收差異光聲信號圖。光聲技術(shù)不僅結(jié)合了光學(xué)成像高對比度和超聲成像高穿透力的優(yōu)勢，還能通過光聲造影劑獲得組織功能和相關(guān)分子信息，有助于組織結(jié)構(gòu)形態(tài)、生理病理特征和代謝功能等的研究，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［8-10］。ICG光吸收峰位于近紅外區(qū)域，與RIT結(jié)合后光吸收峰位于780 nm，在手持式PASS下定位效果優(yōu)于熒光成像系統(tǒng)。

本研究應(yīng)用100 μL/250 mg大鼠（含ICG 125 μg），實驗顯示注射30 min后，SD大鼠腘LN顯像，而無髂LN顯像，證明ICG-RIT靶向停留在腘LN中，在PASS系統(tǒng)中成像特征性單峰信號圖，證明富集ICG-RIT的LN能被特異性識別；在仿體實驗中，小于2.74 mV的光聲信號難以與雞胸組織產(chǎn)生的基礎(chǔ)信號區(qū)分，而大鼠實驗中2.00 mV信號與基礎(chǔ)信號區(qū)分度大，即光聲信號強弱不代表識別難易程度。不同組織下基礎(chǔ)光聲信號呈現(xiàn)不同波形，識別特定信號依賴于與基礎(chǔ)信號的區(qū)分，提示后續(xù)研究需采集不同組織的基礎(chǔ)信號，以識別特定信號波形，從而避免系統(tǒng)誤差，提示操作手持式PASS系統(tǒng)需要一定的學(xué)習(xí)曲線。接收到的光聲信號強度與超聲換能器到探測組織內(nèi)產(chǎn)生光聲信號源的距離相關(guān)，距離越近光聲信號強度越高，預(yù)計臨床應(yīng)用時與核素探測儀效果相似，即探頭與被探測物越近則信號越強，結(jié)合特定信號區(qū)別于基礎(chǔ)信號即可識別前哨LN。ICG-RIT淋巴結(jié)在PASS系統(tǒng)中穿透腋窩脂肪厚度達到32.72 mm，突破以往利用熒光效應(yīng)顯像時穿透深度低的限制；深度大于32.72 mm時，其特定信號與基礎(chǔ)信號難以區(qū)分，這是因為激光穿透組織深度有限，以及光聲信號穿透組織時有更大衰減使得信號淹沒在其他非目標組織所產(chǎn)生的信號中。

早期乳腺癌腋窩的外科處理傳統(tǒng)意義上是為了提升生存率、提高局部控制率以及為分期和治療決策提供依據(jù)。當前早期乳腺癌外科處理在有效的局部控制及全身治療的基礎(chǔ)上呈現(xiàn)降階梯化的趨勢，腋窩處理更大的作用在于提供分期信息以及為全身治療決策提供依據(jù)。在此背景下，精準識別乳腺癌腋窩SLN能更大程度地減少患者腋窩損傷，提高生活質(zhì)量。利用ICG-RIT的淋巴結(jié)靶向性及新型手持式PASS和手持式PAI的高組織穿透力，該技術(shù)有望精準地識別乳腺癌SLN，使SLNB進一步微創(chuàng)化，是一項理想的示蹤技術(shù)，需要進一步開展臨床試驗證實。

總之，利用ICG-RIT的光聲特性、靶向LN特性及良好的被探測深度，通過手持式PASS系統(tǒng)及手持式PAI能特異性定位SLN，具有良好的應(yīng)用前景，但仍需進一步臨床試驗數(shù)據(jù)證實。

利益沖突聲明：所有作者均不存在利益沖突。