李 銳 陳雪丹 張慶華**

1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（重慶 400042）2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室（重慶 400038）

前 言

熱休克蛋白A2 （heat shock protein A2,HSPA2）是一種在睪丸內(nèi)部組成型高表達(dá)的蛋白， 其在精子發(fā)育中的關(guān)鍵作用已為大量研究所證實(shí)[1]。 本課題組前期研究顯示，熱應(yīng)激條件下大鼠睪丸中HSPA2 的表達(dá)顯著下調(diào)[2]，與Krawczyk 等[3]的研究結(jié)果一致，這很可能成為回答熱應(yīng)激致精子發(fā)育功能損傷機(jī)制的一個(gè)關(guān)鍵突破口，但直到目前熱應(yīng)激導(dǎo)致HSPA2 表達(dá)水平降低的內(nèi)在機(jī)制不明。

表觀遺傳是指在DNA 序列不變的條件下，生物表型或基因表達(dá)發(fā)生穩(wěn)定的可遺傳變化， 其涉及到多種不同的分子機(jī)制，包括DNA 甲基化、組蛋白共價(jià)修飾、染色質(zhì)重塑及非編碼RNA 調(diào)控等， 其中DNA 甲基化是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的一種表觀遺傳修飾方式。 從整個(gè)生物界來說，DNA 甲基化可發(fā)生于胞嘧啶C-5 位、腺嘌呤N-6 位及鳥嘌呤N-7 位等點(diǎn)位，但發(fā)生在CpG 二核苷酸中胞嘧啶C-5 位的甲基化，則是動(dòng)、植物等真核生物DNA 甲基化的主要形式，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物DNA 甲基化的唯一形式。CpG 二核苷酸在基因組中分布不均， 其中某些區(qū)段的CpG 二核苷酸保持或高于正常概率，形成所謂的CpG 島，其主要位于基因啟動(dòng)子及第一外顯子區(qū)， 并在基因表達(dá)調(diào)控和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑等方面扮演重要角色。

既往研究[4]顯示，表觀遺傳機(jī)制可能是調(diào)控HSPA2表達(dá)的首要因素，而大量證據(jù)表明DNA 甲基化是調(diào)節(jié)人類細(xì)胞中HSPA2 表達(dá)最重要的表觀遺傳機(jī)制之一，在眾多乳腺癌、宮頸癌、膀胱癌和腎癌細(xì)胞系中均可檢測(cè)到HSPA2 基因甲基化[5,6]。 以DNA 甲基化抑制劑處理細(xì)胞系后，可觀察到HSPA2 基因轉(zhuǎn)錄水平升高，但過度甲基化則導(dǎo)致其表達(dá)水平降低[7]。這似乎表明，HSPA2基因的作用被過度甲基化所抑制， 但這一點(diǎn)目前尚存有爭議。 有研究認(rèn)為， 原發(fā)性膀胱腫瘤中HSPA2 基因的抑制作用與過度甲基化相關(guān)[8]，但另有研究發(fā)現(xiàn)HSPA2基因在膀胱癌細(xì)胞系和原發(fā)性尿路上皮腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)[9]?？傊?，DNA 甲基化在HSPA2 基因表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

通過在線查詢UCSC 數(shù)據(jù)庫， 可見大鼠Hspa2 基因啟動(dòng)子區(qū)也存在一個(gè)CpG 島， 熱應(yīng)激是否可能通過此CpG 島區(qū)域的DNA 甲基化來介導(dǎo)Hspa2 基因的表達(dá)下調(diào)，這是一個(gè)極有意思的問題。 本課題組通過構(gòu)建大鼠生殖系統(tǒng)的熱應(yīng)激模型， 并運(yùn)用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR,MSP)和重亞硫酸鹽測(cè)序PCR(bisu-lfite sequencing PCR,BSP)檢測(cè)大鼠睪丸組織中Hspa2 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島的甲基化狀況， 試圖揭示熱應(yīng)激條件下HSPA2 表達(dá)下調(diào)的內(nèi)在機(jī)制。

材料與方法

一、樣品采集

動(dòng)物模型建立、分組與高溫模型（熱應(yīng)激組）建立，大鼠睪丸組織取材及保存方法參見本課題組前期研究[2]。

二、主要儀器與試劑

HOPE-MED 8150E 型特定環(huán)境智能型模擬實(shí)驗(yàn)艙（天津合普公司），基因擴(kuò)增儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司），Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），EPS 301 Power Supply 電源（美國GE 公司），多功能水平電泳槽HM-I 型 （大連競(jìng)邁生物科技有限公司），組織基因組DNA 小量提取試劑盒（北京天漠科技開 發(fā) 有 限 公 司，TD325-50），EZ DNA 甲 基 化 試 劑 盒-GOLD （北京天漠科技開發(fā)有限公司，D5005），EpiTaq酶（日本Takara 公司，R110Q），OMEGA 膠回收試劑盒（美國Omega Biotek 公司，D2500-01），pMD 19-T Vector Cloning Kit（日本Takara 公司，6013），DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（生工，B528413-0020），X-gal（美國Thermo Fisher Scientific 公司，R0404），IPTG （異丙基-β-D- 硫代半乳糖苷）（生工，A600168-0050）。

三、生物信息學(xué)分析

在線查詢UCSC 數(shù)據(jù)庫（http://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?hgsid=1172038731_2dobyI1s0Y9jp I6aHMZWeFcAtRIO&redirect=manual&source=genome.ucsc.edu）， 可見大鼠Hspa2 基因啟動(dòng)子區(qū)有一個(gè)CpG島（如圖1 所示），其總長2670 bp（chr6:99,432,862-99,435,531），內(nèi)含CpG 總數(shù)為217。

圖1 CpG 島在Hspa2基因啟動(dòng)子區(qū)位置

四、大鼠睪丸組織基因組DNA 的提取

從熱應(yīng)激組（含8 份睪丸組織樣本）和對(duì)照組（含8份睪丸組織樣本）各隨機(jī)選出5 份睪丸組織樣本，提取大鼠睪丸組織基因組DNA， 并運(yùn)用紫外吸收法測(cè)定所提取的基因組DNA 溶液濃度。

五、大鼠睪丸組織基因組DNA 的C-U 轉(zhuǎn)換

熱應(yīng)激組和對(duì)照組每個(gè)DNA 樣品取200 ng，體積不足20ul 的，用雙蒸水補(bǔ)平，具體見表1。使用EZ DNA甲基化試劑盒-GOLD 法得到經(jīng)重亞硫酸鹽處理 （即C-U 轉(zhuǎn)換）并純化的基因組DNA 溶液。

表1 各DNA 樣品濃度、200ng DNA所取體積及雙蒸水體積

六、MSP 法檢測(cè)大鼠睪丸組織中Hspa2 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島的甲基化

以大鼠Hspa2 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島的序列為模板，運(yùn)用Methyl Primer Express v1.0 軟件設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物，如表2 所示，所有引物均由擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。 以經(jīng)重亞硫酸鹽處理（即C-U 轉(zhuǎn)換）并純化的基因組DNA 為模板，根據(jù)EpiTaq 酶法進(jìn)行普通PCR（反應(yīng)體系50 ul，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性20 秒；94℃20 秒，53℃30 秒每完成一輪循環(huán)降低0.5℃，72℃60 秒，共10 個(gè)循環(huán)；94℃20 秒，48℃30 秒，72℃60 秒，共25 個(gè)循環(huán)）。 PCR 結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)終產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳， 之后將凝膠自電泳糟取出，置于Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)照相。

表2 MSP 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

七、BSP 法檢測(cè)大鼠睪丸組織中Hspa2 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島的甲基化

與MSP 相類似， 運(yùn)用Methyl Primer Express v1.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)BSP 的引物， 如表3 所示， 除引物與MSP 不同外，BSP 其余反應(yīng)體系及熱反應(yīng)程序設(shè)置與MSP 完全一致。PCR 結(jié)束之后，將反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。 根據(jù)Marker 指示，運(yùn)用OMEGA 膠回收試劑盒法割膠提取目的DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物，隨后將回收的目的DNA 片段連接至pMD 19-T Vector，并以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的DH5α 感受態(tài)細(xì)胞置入無抗生素的LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60 分鐘進(jìn)行擴(kuò)增，取適量菌液接種至含X-gal 及IPTG 的氨芐平板，用玻璃棒涂抹均勻，37℃放置14h。待菌落長出后，每個(gè)平板挑選10 個(gè)白色菌落，以37℃振蕩培養(yǎng)過夜，最后菌液送擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序（一代測(cè)序）。

表3 MSP 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

八、數(shù)據(jù)分析

使用Vector NTI Advance 11.5.1 對(duì)BSP 測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，并將序列中的CpG 位點(diǎn)，根據(jù)其甲基化狀態(tài)的不同，繪制成黑白圈點(diǎn)圖（黑色代表甲基化，白色代表非甲基化）。 使用SPSS 20.0 對(duì)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析。本研究涉及到熱應(yīng)激組和對(duì)照組，為兩組獨(dú)立樣本，要比較的是兩組甲基化率的差異， 可以整理為四格表資料，根據(jù)單元格理論頻數(shù)的實(shí)際情況，采用Pearson χ2檢驗(yàn)，連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果的解讀：P ＞0.05 為差異不顯著， 結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P ＜0.05 為差異顯著，P ＜0.01 為差異極顯著，此二者均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MSP 法檢測(cè)大鼠睪丸組織中Hspa2 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島的甲基化情況

從瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果來分析， 無論是使用甲基化引物，還是非甲基化引物，熱應(yīng)激組和對(duì)照組，都能成功擴(kuò)增出目的DNA 片段，從所拍的片子上均可以看到清晰明亮的條帶，如圖2A、圖2B 所示。 這說明，對(duì)兩組DNA 樣本而言，甲基化引物（或非甲基化引物）所在區(qū)域的CpG 位點(diǎn)， 其甲基化與非甲基化狀態(tài)是同時(shí)存在的，也就是都存在部分甲基化，但無從得知二者之間的分布比例。 因此，通過MSP 尚難以判斷熱應(yīng)激是否會(huì)導(dǎo)致CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)發(fā)生顯著改變。

圖2 熱應(yīng)激組與對(duì)照組MSP 終產(chǎn)物凝膠電泳圖

二、BSP 法檢測(cè)大鼠睪丸組織中Hspa2 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島的甲基化情況

熱應(yīng)激組及對(duì)照組共10 個(gè)DNA 樣本， 每個(gè)樣本選擇10 個(gè)陽性單克?。ㄒ来尉幪?hào)為1-10）進(jìn)行DNA 測(cè)序。從返回的數(shù)據(jù)來看，只有一個(gè)陽性單克隆（對(duì)照組4號(hào)樣本的第2 個(gè)陽性單克?。?測(cè)序失敗， 測(cè)序成功99個(gè)。 使用Vector NTI Advance 11.5.1 軟件對(duì)測(cè)序成功的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)， 一部分單克隆并不含目的DNA 片段，另一部分單克隆可能僅含空載體，將這一部分?jǐn)?shù)據(jù)予以剔除。

熱應(yīng)激組實(shí)際有效的單克隆為：1 號(hào)樣本的（1-2、1-3、1-4、1-6、1-7、1-9、1-10）號(hào)單克??；2 號(hào)樣本的（2-3、2-5、2-6、2-8、2-9、2-10）號(hào)單克隆；3 號(hào)樣本的（3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-7、3-8） 號(hào)單克??；4 號(hào)樣本的（4-1、4-3、4-5、4-8、4-10）號(hào)單克??；5 號(hào)樣本的（5-1、5-2、5-7、5-8、5-9、5-10）號(hào)單克隆。

對(duì)照組實(shí)際有效的單克隆為：1 號(hào)樣本的（1-1、1-3、1-5、1-7、1-8）號(hào)單克隆；2 號(hào)樣本的（2-2、2-4、2-5、2-10）號(hào)單克??；3 號(hào)樣本的（3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6、3-10）號(hào)單克 ??；4 號(hào) 樣 本 的（4-1、4-2、4-4、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10）號(hào)單克?。? 號(hào)樣本的（5-1、5-3、5-4、5-10）號(hào)單克隆。

經(jīng)BSP 擴(kuò)增的目的DNA 片段長為259 bp，內(nèi)含22個(gè)CpG 位點(diǎn)。根據(jù)Vector NTI Advance 11.5.1 軟件比對(duì)結(jié)果，針對(duì)熱應(yīng)激組和對(duì)照組每一個(gè)樣本的不同有效單克隆，繪制黑白圈點(diǎn)圖（黑色代表甲基化，白色代表非甲基化），如圖3A、圖3B 所示。從比對(duì)的整體結(jié)果來看，熱應(yīng)激組和對(duì)照組發(fā)生甲基化的CpG 位點(diǎn)均較少， 且分布不規(guī)律，無法針對(duì)單個(gè)CpG 位點(diǎn)進(jìn)行差異性分析。本課題組以22 個(gè)CpG 位點(diǎn)作為整體進(jìn)行分析，比較熱應(yīng)激組和對(duì)照組在這22 個(gè)CpG 位點(diǎn)甲基化率的差異。由于熱應(yīng)激組和對(duì)照組各個(gè)樣本有效單克隆的數(shù)目不盡相同，為提高數(shù)據(jù)分析質(zhì)量，我們從有效單克隆在4 個(gè)以上的樣本中隨機(jī)抽取4 個(gè)，保證所有樣本有效單克隆的數(shù)目一致，均為4 個(gè)。熱應(yīng)激組和對(duì)照組各含20 個(gè)有效單克隆，440 個(gè)CpG 位點(diǎn)， 其中熱應(yīng)激組發(fā)生甲基化的CpG 位點(diǎn)總數(shù)為6， 對(duì)照組發(fā)生甲基化的CpG 位點(diǎn)總數(shù)為7。在四格表卡方檢驗(yàn)中，所有單元格理論頻數(shù)均大于5，且樣本例數(shù)大于40，可以直接讀取Pearson χ2檢驗(yàn)的結(jié)果，χ2=0.078，P=0.780，P ＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 因此， 熱應(yīng)激組和對(duì)照組在BSP 所擴(kuò)增的目標(biāo)DNA 片段內(nèi)，其甲基化率沒有明顯差異（P ＞0.05）。

圖3 熱應(yīng)激組與對(duì)照組各樣本有效單克隆CpG 位點(diǎn)的黑白圈點(diǎn)圖（黑色代表甲基化，白色代表非甲基化）

討 論

大量證據(jù)顯示，HSPA2 在精子發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用， 其表達(dá)失調(diào)或功能障礙都會(huì)顯著影響精子發(fā)生，并最終引發(fā)不育[1]。 既往研究表明，熱應(yīng)激下精子濃度顯著降低，精子活性及運(yùn)動(dòng)能力受損[10]，而精子頭部的某些性狀也可發(fā)生改變，并直接影響受精[11]，但其內(nèi)在機(jī)制不明。 有證據(jù)顯示，熱應(yīng)激可通過一系列途徑引發(fā)生精細(xì)胞凋亡[12-14]，但這些研究僅能從一定角度說明精子數(shù)量減少的根本原因， 很難解釋熱應(yīng)激所致的精子活性及運(yùn)動(dòng)能力損傷。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)， 熱應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠睪丸中HSPA2 表達(dá)水平降低[2]，這是一個(gè)非常有意思的發(fā)現(xiàn)， 同時(shí)也為熱應(yīng)激致精子發(fā)育受損的內(nèi)在原因提供了一個(gè)可能的解釋。 但熱應(yīng)激條件下HSPA2 表達(dá)下調(diào)的本質(zhì)原因卻不清楚。 既往研究表明，表觀遺傳機(jī)制可能是調(diào)控HSPA2 表達(dá)的首要因素[4]，而DNA 甲基化則是調(diào)節(jié)人類細(xì)胞中HSPA2 表達(dá)最重要的表觀遺傳機(jī)制之一[5,6]。 本研究試圖通過已經(jīng)構(gòu)建的大鼠生殖系統(tǒng)的熱應(yīng)激模型，運(yùn)用MSP 和BSP 技術(shù)去探索甲基化在熱應(yīng)激致HSPA2 表達(dá)下調(diào)過程中可能發(fā)揮的作用。

從本次實(shí)驗(yàn)MSP 的結(jié)果來看，熱應(yīng)激組和對(duì)照組的所有DNA 樣本，在MSP 所研究的區(qū)域（即引物結(jié)合區(qū)域）都同時(shí)存在著甲基化和非甲基化兩種狀態(tài)。 由于MSP 的局限性， 還難以判斷熱應(yīng)激是否引起甲基化狀態(tài)的變化。 但可以推測(cè)，熱應(yīng)激組和對(duì)照組可能存在甲基化率的差異，這是BSP 要回答的問題。

從本實(shí)驗(yàn)BSP 的結(jié)果分析， 熱應(yīng)激組和對(duì)照組在BSP 目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域的甲基化率都很低， 且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

綜合MSP 和BSP 的結(jié)果來看，熱應(yīng)激在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致HSPA2 的表達(dá)下調(diào)， 可能不是通過DNA 的甲基化修飾來實(shí)現(xiàn)的， 盡管甲基化是由甲基轉(zhuǎn)移酶來催化完成的（從理論上說，這個(gè)過程并不需要很長時(shí)間）。 但同時(shí)需要注意的是，本次BSP 實(shí)驗(yàn)涉及的259 bpDNA 片段只是全長2670bp 的CpG 島中很小一段區(qū)域， 因此不能完全排除熱應(yīng)激通過甲基化修飾來下調(diào)HSPA2 表達(dá)的可能性。如前所述， 在眾多腫瘤細(xì)胞系中檢測(cè)到了HSPA2 基因甲基化，且多數(shù)研究顯示，這種甲基化導(dǎo)致了HSPA2 表達(dá)水平降低。但甲基化在這些腫瘤細(xì)胞系中發(fā)生的內(nèi)在原因是未知的。 盡管如此，我們可以推測(cè)，HSPA2 基因甲基化很可能與HSPA2 表達(dá)水平降低高度相關(guān)。

總而言之，熱應(yīng)激致HSPA2 表達(dá)下調(diào)的機(jī)制可能是多方面的， 甲基化修飾是可能的機(jī)制之一。 直到目前， 關(guān)于HSPA2 表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究還非常有限，究竟是轉(zhuǎn)錄調(diào)控為主，還是表觀調(diào)控為主，都還具有極大的不確定性。

毫無疑問， 對(duì)HSPA2 表達(dá)調(diào)控機(jī)制的深入研究是有重大意義的，這對(duì)于解決諸多因HSPA2 表達(dá)或功能失常所致的不育問題大有裨益。同時(shí)，有助于我們更好地認(rèn)識(shí)熱應(yīng)激致HSPA2 表達(dá)下調(diào)的深層原因，對(duì)于推動(dòng)解決熱應(yīng)激致精子發(fā)育損傷的問題也是有重大幫助的。