劉 娜 張 巖 李 妍 楊 錚 云 霞 白 杰 張信來 劉陶迪

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（ 110032）

男性不育的發(fā)病率在全球呈上漲趨勢[1]，發(fā)病年齡也趨向年輕化。 確定與男性不育相關(guān)的分子機(jī)制對其診斷和治療非常重要。 Trib3 是一種存在于哺乳動物中的假激酶，用于控制細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲[2]。 本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，Trib3 基因在大鼠睪丸組織中表達(dá)，且在大鼠出生后第10 天比大鼠出生后第8 天轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)20.3 倍之多，是在大鼠精子發(fā)生過程中，表達(dá)差異比較顯著的基因之一[3]。 TRIB3 蛋白有一個中心絲氨酸/ 蘇氨酸激酶樣結(jié)構(gòu)域[4]，這個假激酶結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)與靶蛋白的相互作用中起著重要作用。 研究表明TRIB3 是通過調(diào)節(jié)和結(jié)合幾種關(guān)鍵蛋白質(zhì)的活性實現(xiàn)其功能， 包括AKT、 轉(zhuǎn)錄因子ATF4、DDIT3 等，且TRIB3 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的各種信號通路發(fā)揮作用[5]。 有研究發(fā)現(xiàn)TRIB3 通過結(jié)合AKT 可以抑制腫瘤發(fā)生[6]。但TRIB3 在大鼠睪丸細(xì)胞中是否能與AKT 結(jié)合發(fā)揮作用，目前尚未有研究。 本研究主要分析確定了在大鼠睪丸細(xì)胞中TRIB3 與AKT 存在蛋白互作關(guān)系，為進(jìn)一步研究TRIB3 對大鼠生殖的影響以及發(fā)揮作用的可能機(jī)制提供更多實驗證據(jù)。

材料與方法

一、材料

（一）實驗動物

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心購買20～25 日齡雄性Wistar 大鼠[許可證號：[SCXK（蒙）2015-0001]。 Trib3基 因 敲 除 雄 性Wistar 大 鼠 （SCXK 京2019-0002），20～25 日齡，委托北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司制備F0 代基因敲除純合鼠，F(xiàn)0 代基因敲除鼠自然交配產(chǎn)生后代純合鼠。 在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心同一條件下飼養(yǎng)。

（二）主要試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)基（美國Giboico 公司），胎牛血清（天津TBD 公司），免疫共沉淀試劑盒（美國Millipore公司），全蛋白提取試劑盒（凱基生物公司），總RNA 提取試劑盒(天根生化有限公司)，總DNA 試劑盒（天根生化有限公司），兔抗TRIB3 抗體(武漢菲恩生物科技有限公司)，兔抗AKT 抗體（美國CST 公司），羊抗兔IgG(美國Abcam 公司)，RT-qPCR 試劑盒（大連寶生物公司）。

二、實驗方法

（一）TRIB3 基因敲除大鼠鑒定

剪取8～10 日齡大鼠腳趾， 裝入0.2 ml PCR 管，提取DNA，使用紫外分光光度儀測定DNA 濃度及純度。以提取的DNA 為模板對部分Trib3 片段擴(kuò)增， 基因型鑒定引物列表，見表1，將擴(kuò)增完的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。 基因型判斷標(biāo)準(zhǔn)，見表2。

表1 基因型鑒定引物列表

表2 基因型判斷標(biāo)準(zhǔn)

（二）大鼠睪丸組織細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系建立

實驗分為對照組和實驗組，對照組即未敲除基因的Wistar 雄鼠，實驗組為Trib3 基因敲除雄鼠，兩組同時進(jìn)行睪丸組織細(xì)胞體外共培養(yǎng)。 隨機(jī)將20-25 日齡大鼠采用頸椎脫臼法處死，75%酒精浸泡10 分鐘，取出兩側(cè)睪丸，冰上75%酒精浸泡10 分鐘，用DPBS 清洗3 次以去除酒精，將清洗后的睪丸放在冰上含有4ml DPBS 的培養(yǎng)皿中，去除睪丸白膜和血管，放入加了雙抗的培養(yǎng)液中，把組織塊剪成大約2mm 小塊，轉(zhuǎn)移到含有4ml 培養(yǎng)液的60mm 培養(yǎng)皿中， 培養(yǎng)液中分別加入4μLVitamin A、Vitamin C、Vitamin E 等營養(yǎng)因子， 每個培養(yǎng)皿放10塊左右。 37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每周換液3 次，觀察細(xì)胞狀態(tài)，出現(xiàn)成片細(xì)胞時同時收集細(xì)胞。

（三）RT-qPCR

收集培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，提取兩組細(xì)胞總RNA,并測定其濃度和純度，RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 引物序列表，見表3，GAPDH 為內(nèi)參對照，設(shè)置反應(yīng)條件：95℃30s，95℃5s，60℃30s，38 個循環(huán)。 每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值，采用2-ΔΔct的方法計算相對表達(dá)水平。

表3 RT-qPCR 所用引物序列

（四）Western blot

收集對照組和實驗組的細(xì)胞， 按照總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA 法測定蛋白濃度。 進(jìn)行SDS-PAGE 后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜完成后，將膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1h，一抗4℃孵育過夜，次日二抗室溫孵育1h。

（五）免疫共沉淀

按照免疫共沉淀試劑盒說明書操作。 利用兩步酶消法得到大鼠睪丸組織細(xì)胞， 經(jīng)RIPA 裂解提取蛋白后，分為正向和反向免疫共沉淀組。 取下分離柱底塞，5000r 離心30s,1×Wash Buffer 洗兩次，將底塞塞回分離柱底部；按如下順序加樣：1×Wash Buffer 140μl、裂解液350μl、Antibody capture10μl 為 陰 性 對 照；1 ×Wash Buffer 130μl、裂解液350μl、TRIB3 抗體10μl、Antibody capture10μl 為 正 向 免 疫 共 沉 淀 組；1×Wash Buffer 130μl、 裂 解 液350μl、AKT 抗 體10μl、Antibody capture10μl 為反向免疫共沉淀組，4 ℃孵育過夜； 取下分離柱底塞， 離心1×Wash Buffer 洗3 次， 加入70μl1×Non-Denaturany Eluston Buffer 離心30s，最后收集到的洗脫液中即含有相互作用的蛋白質(zhì)。 按照6 的步驟對蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot 分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t 檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TRIB3 基因敲除結(jié)果及效果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示， 引物為Trib3-seq-F1+Trib3-seq-R 時，1、2、3、4、5 在333bp 處有條帶； 引物為Trib3-seq-F2+Trib3-seq-R 時,1、2、3、4、5 無產(chǎn)物， 表明1、2、3、4、5 為Trib3 基因敲除大鼠。 RT-qPCR 結(jié)果顯示，與對照組相比，Trib3 基因敲除組Trib3 mRNA 無表達(dá)（P＜0.05），見圖1A、圖1B。

圖1 Trib3 基因敲除效果

（二）對照組和實驗組AKT 蛋白和mRNA 的表達(dá)

與對照組相比，Trib3 基因敲除組AKT 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖2A、圖2B，Akt mRNA 的表達(dá)水平升高(P＜0.01），見圖3。

圖2 AKT 蛋白在對照組和實驗組中的表達(dá)(n=3)

圖3 Akt mRNA 在對照組和實驗組中的表達(dá)(n=3)與control 比較：***P＜0.01

（三）免疫共沉淀法驗證TRIB3 與AKT 在細(xì)胞內(nèi)相互作用

使用TRIB3 抗體對大鼠睪丸細(xì)胞蛋白裂解物進(jìn)行免疫沉淀，然后使用AKT 抗體進(jìn)行Western blot 分析，結(jié)果在復(fù)合物中檢測到AKT 蛋白。 隨后使用AKT 抗體對大鼠睪丸細(xì)胞蛋白裂解物進(jìn)行反向免疫沉淀，發(fā)現(xiàn)免疫復(fù)合物中可檢測到TRIB3 蛋白。 在大鼠睪丸細(xì)胞中，TRIB3 和AKT 之間存在相互作用，見圖4。

圖4 免疫共沉淀結(jié)果

討 論

男性不育癥作為一種病因不明的異質(zhì)性疾病，截止到現(xiàn)在全球至少有7%的男性受到影響[8]。 導(dǎo)致男性不育的原因有多種， 從細(xì)胞水平探究基因變化導(dǎo)致男性不育已成為近年來研究的熱點。

精子發(fā)生及成熟是一系列復(fù)雜的事件， 需要多種基因共同調(diào)控。 不同的生精細(xì)胞在曲細(xì)精管中按特定順序排列，構(gòu)成了精子發(fā)生過程，分為三個階段：有絲分裂、減數(shù)分裂和精子發(fā)生[9]。

有研究發(fā)現(xiàn)Trib3 基因在精子發(fā)生初期差異性表達(dá),這一時期正是精子發(fā)生開始[3]。TRIB3 在多種癌癥細(xì)胞中高表達(dá)[10]。 近年來，TRIB3 作為代謝性疾病和癌癥的生物標(biāo)志物和治療靶點得到了積極的研究[11]。 一些研究表明，TRIB3 可與許多激酶依賴性蛋白結(jié)合，并通過負(fù)向調(diào)節(jié)其磷酸化來其功能減弱， 從而影響多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活[12]。

有研究表明TRIB3 的最佳功能是對AKT 活性的負(fù)調(diào)節(jié)， 一些證據(jù)表明，TRIB3 通過與AKT 的直接相互作用破壞Thr308 和Ser473 殘基的磷酸化[13]， 敲低TRIB3 可升高AKT 蛋白磷酸化，從而激活A(yù)KT-mTOR信號通路， 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增值[14]。 AKT 位于mTOR 信號通路上游，mTOR 信號通路對于調(diào)控男性生殖具有重要作用[15]，本研究預(yù)測Trib3 在大鼠睪丸細(xì)胞中可能存在相似的作用機(jī)制，調(diào)節(jié)AKT-mTOR 信號通路進(jìn)而影響精子發(fā)生過程， 但國內(nèi)外尚未見男性生殖有關(guān)方面的報道。 為此，本實驗在前期構(gòu)建Trib3 基因敲除大鼠， 構(gòu)建大鼠睪丸組織共培養(yǎng)體系， 提取細(xì)胞， 進(jìn)一步觀察TRIB3 水平與AKT 表達(dá)之間的關(guān)系；運用免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用[16]。研究結(jié)果表明，與對照組相比，敲除Trib3 基因可顯著升高AKT 蛋白和Akt mRNA 表達(dá)量，正向和反向免疫共沉淀法均證實TRIB3 與AKT在大鼠睪丸細(xì)胞內(nèi)可形成復(fù)合物，為臨床靶向TRIB3 治療男性不育提供了實驗室證據(jù)。

但TRIB3 和AKT 蛋白之間是緊密結(jié)合還是短暫相互作用， 復(fù)合物如何調(diào)控睪丸細(xì)胞其他基因表達(dá)及其具體機(jī)制，尚需在后續(xù)實驗中加以完善。