尚 楠 張凱惠

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院（遼寧沈陽 110032）

慢性前列腺炎（chronic prostatitis，CP）是以慢性盆腔疼痛和排尿異常為主要表現(xiàn)的臨床綜合征[1]。 美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health,NIH)分類系統(tǒng)將其分類為Ⅲ型前列腺炎， 屬泌尿男科門診常見的疾病之一[2]。 該病在世界范圍內(nèi)發(fā)病率約為2.2%～16.0%， 且我國近期的一項(xiàng)針對(duì)40 歲以上男性的調(diào)查結(jié)果顯示，高達(dá)25.3%的人曾被診斷過CP[3]。 西醫(yī)學(xué)對(duì)病因病機(jī)的研究存在廣泛爭議， 治療上以緩解癥狀為主要目的，缺乏特異性，治療效果不甚理想[4]。 金沙藤又名海金沙， 是海金沙科植物L(fēng)ygodium japonicum(Thunb.)Sw.的干燥成熟孢子， 屬多年生蕨類植物，目前收載于2015 年版《中華人民共和國藥典》[5]。 《履巉巖本草》、《生草藥性備要》、《質(zhì)問本草》、《草木便方》、《天寶本草》、《廣西中藥志》、《湖南藥物志》 等古今本草專著中記載其具有清利濕熱，通淋止痛等功效，被用來治療慢性前列腺炎[6]。 然而金沙藤中含有的化學(xué)成分種類繁多、作用機(jī)制復(fù)雜，目前尚未有關(guān)于其有效成分及作用機(jī)制的系統(tǒng)性研究，限制了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。 反向藥效團(tuán)搜索是一種小分子靶點(diǎn)預(yù)測(cè)方法， 該方法將蛋白活性位點(diǎn)進(jìn)行三維藥效團(tuán)標(biāo)示， 再將小分子的基團(tuán)與標(biāo)示后的藥效團(tuán)進(jìn)行匹配， 相比傳統(tǒng)的反向分子對(duì)接方法具有快速高效的特點(diǎn)。 PharmMapper 數(shù)據(jù)庫是基于該方法，以TargetBank、BindingDB、DrugBank 及PDB 等數(shù)據(jù)庫中的23236 個(gè)蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)， 建立了16159 個(gè)藥物結(jié)合位點(diǎn)藥效團(tuán)模型，對(duì)小分子的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)[7]。 其快速高效的特點(diǎn)滿足了對(duì)金沙藤中多種化學(xué)成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。 本研究擬通過PharmMapper 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)金沙藤中化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)， 并通過富集分析對(duì)慢性前列腺炎癥相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選， 最后研究有效成分與其潛在靶點(diǎn)的結(jié)合模式及作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

金沙藤中的化學(xué)成分：海金沙主要含有黃酮類、酚酸類、 糖類及甾體類等， 其中含量較高的主要有田薊苷，山柰酚，對(duì)香豆酸、香葉木苷，香豆酸，原兒茶酸，漢松甾酮，羥基烏蘇酸，木栓酮[8]。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫搜集上述小分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)（表1），并利用ChemDraw 軟件將化學(xué)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成mol2 文件。

表1 海金沙中主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)小分子靶標(biāo)

將上述mol2 格式的小分子文件上傳到Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫中，將8 個(gè)化合物的mol2 格式文件提交給服務(wù)器，生成構(gòu)象設(shè)置為“on”，最大生成構(gòu)象數(shù)設(shè)置為300 個(gè)。 在高級(jí)選項(xiàng)中， 選擇藥物藥效團(tuán)模型(v2017，16159)作為目標(biāo)集，其他選項(xiàng)被用作默認(rèn)值。 最后， 根據(jù)小分子藥效團(tuán)與蛋白活性位點(diǎn)藥效團(tuán)的匹配情況，選擇Fitscore 前100 的蛋白靶標(biāo)用于隨后的綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析研究。

富集分析：Cytoscape 是一個(gè)開源軟件平臺(tái)，用于分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和生物途徑的可視化[9]。 我們使用Cytoscape 3.5 版本生成8 個(gè)化合物與Pharmmapper 結(jié)果之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)， 該網(wǎng)絡(luò)包含大量的功能節(jié)點(diǎn)和聯(lián)系。 為了對(duì)大量的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)解釋，我們進(jìn)一步對(duì)目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析， 以確定金沙藤抗慢性前列腺炎作用的關(guān)鍵途徑。

使用cytoscape3.5 中的ClueGO 插件進(jìn)行KEGG和GO 富集分析[10]。篩選出所有與前列腺炎癥相關(guān)的途徑和靶點(diǎn)。 在ClueGO 操作界面中， 刪除重復(fù)節(jié)點(diǎn)，Go-tree 間期設(shè)置為5～10，kappa 評(píng)分設(shè)置為0.4，P 值閾值設(shè)置為0.01，ClueGO 結(jié)果僅顯示P 值小于或等于0.01 的生物過程和KEGG 通路。

（二）分子對(duì)接

通過PDB（https://www.rcsb.org/）網(wǎng)站下載蛋白質(zhì)3D 結(jié)構(gòu)文件（PDBid：7AFW[11]），并使用MOE 軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理， 力場設(shè)置為Amber10 EHT， 通過Quickprep 模塊中的Protonate 3D 功能進(jìn)行優(yōu)化， 以便下一步對(duì)接。 在對(duì)接操作界面中， 將placement 和refinement 分 別 設(shè) 置 為 “Triangle Matcher” 和“Induced Fit”， 用London dG 評(píng)分評(píng)價(jià)小分子與蛋白靶標(biāo)的結(jié)合能力。

結(jié) 果

一、金沙藤中化學(xué)成分的潛在作用靶標(biāo)

我們將8 個(gè)化合物的PharmMapper 結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)分析。 如表2 所示，結(jié)果包含8 個(gè)數(shù)據(jù)集，每個(gè)數(shù)據(jù)集中含有100 個(gè)蛋白質(zhì)。 我們首先對(duì)其進(jìn)行了Venn Diagram 交集研究發(fā)現(xiàn)，田薊苷、山柰酚以及香葉木苷的潛在靶標(biāo)數(shù)據(jù)集存在交集； 漢松甾酮C 和烏蘇酸的潛在靶標(biāo)數(shù)據(jù)集存在交集。 然而沒有任何一個(gè)蛋白質(zhì)會(huì)同時(shí)出現(xiàn)在8 個(gè)數(shù)據(jù)集中。 這說明金沙藤的抗慢性前列腺炎癥是通過多重生物學(xué)途徑實(shí)現(xiàn)的。

表2 金沙藤中主要成分的潛在靶標(biāo)

二、富集分析

為了篩選與慢性前列腺炎癥相關(guān)的蛋白靶標(biāo)，我們對(duì)800 個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行了基于GO 和KEGG 的富集分析。得到一個(gè)完整的基因（353 個(gè)節(jié)點(diǎn)，3133 個(gè)聯(lián)系）富集網(wǎng)絡(luò)如圖1a 所示。 將節(jié)點(diǎn)基于中心性測(cè)度（Centrality measure）重疊后，圖1b 顯示了具有關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的基因子網(wǎng)絡(luò)，密切相關(guān)的基因項(xiàng)聚集在同一顏色組中。 綠色為免疫應(yīng)答與信號(hào)調(diào)節(jié)信號(hào)通路 （immune response regulation）；藍(lán)色為白細(xì)胞分化（leukocyte differentiation）青色的為T 細(xì)胞活化（T cell activation）。 上述三個(gè)生物學(xué)途徑的p 值如表3 所示。

圖1 潛在靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

表3 潛在靶點(diǎn)參與的關(guān)鍵生物學(xué)途徑

為了進(jìn)一步明確8 個(gè)化合物中的有效成分， 我們將參與形成上述關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的蛋白靶標(biāo)進(jìn)行了可視化如圖1c， 其中參與免疫信號(hào)調(diào)節(jié)和T 細(xì)胞活化途徑的蛋白靶標(biāo)有IL-6、IL-1β、TNF、CCL5 和CTNNB1。 通過比對(duì)PharmMapper 結(jié)果， 我們得到了小分子與上述蛋白靶標(biāo)的潛在相互作用關(guān)系： 烏蘇酸&IL-6、 漢松甾酮C&IL-1β、漢松甾酮C&TNF、山奈酚&CTNNB1、田薊苷&CTNNB1 以及對(duì)香豆酸&CCL5。

討 論

富集分析結(jié)果表明8 個(gè)小分子的潛在靶點(diǎn)與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)， 白細(xì)胞分化以及T 細(xì)胞活化等生物途徑有著密切的關(guān)系。 有研究表明，Th17/Treg 細(xì)胞比例失衡是促進(jìn)慢性前列腺炎發(fā)生的重要原因之一，Th17 細(xì)胞是 由CD4+T 細(xì) 胞 在TCR 激 活 及IL-6，TGF-β，IL-21，IL-1β 和IL-23 等刺激下分化而來，主要受STAT3 信號(hào)通路、mTOR 信號(hào)通路和HIF1 信號(hào)通路調(diào)控， 不論抑制上述白介素的功能還是抑制上游信號(hào)通路都可以減少 T 細(xì) 胞 向 Th17 細(xì) 胞 的 轉(zhuǎn) 化[12-14]。 我 們 的PharmMapper 結(jié)果顯示金沙藤中的有效成分烏蘇酸、漢松甾酮能直接與上述細(xì)胞因子結(jié)合并抑制其功能，進(jìn)而減少T 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，達(dá)到治療慢性前列腺炎的作用。 除此之外，山奈酚、田薊苷、漢松甾酮C 和香豆酸雖然沒有直接與上述細(xì)胞因子直接作用，但我們的富集分析結(jié)果顯示，綠色的免疫應(yīng)答通路與青色的T 細(xì)胞活化途徑都與慢性前列腺炎相關(guān)。 由此推斷，它們的潛在靶標(biāo)與上述調(diào)控白介素功能的信號(hào)通路關(guān)系密切。研究表明，CTNNB1 是STAT3 信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，抑制前者的活性可以阻斷后者的功能，進(jìn)而減少細(xì)胞因子的分泌達(dá)到治療慢性前列腺炎的作用[15,16]。 這與我們的預(yù)測(cè)結(jié)果完全相符，進(jìn)一步驗(yàn)證了金沙藤治療慢性前列腺炎的作用機(jī)制。為了進(jìn)一步確定金沙藤中的有效成分，并探索其與潛在靶標(biāo)的相互作用機(jī)理，我們將參與關(guān)鍵生物途徑的蛋白與上述小分子進(jìn)行了分子對(duì)接研究。 如圖2 所示，其中田薊苷&CTNNB1 的分子對(duì)接打分最高為-7.8831，其次為烏蘇酸&IL-6.8533，遠(yuǎn)高于其他小分子&蛋白。 說明金沙藤中的有效成分主要為田薊苷和烏蘇酸。二者分別屬于黃酮類和甾體類化合物，曾有研究表明這兩類化合物對(duì)泌尿系統(tǒng)炎癥有較好的治療作用，這也驗(yàn)證了本次篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖2 田薊苷與CTNNB1 的分子對(duì)接構(gòu)象

在田薊苷&CTNNB1 的對(duì)接構(gòu)象中， 田薊苷結(jié)合在蛋白活性口袋中， 與氨基酸殘基Asn206、Met243 形成氫鍵相互作用，與H2O506 形成鹽橋，進(jìn)一步穩(wěn)定了小分子的構(gòu)象。 研究表明Asn206 是CTNNB1 行駛功能的關(guān)鍵氨基酸，因此我們推斷田薊苷與Asn206 的氫鍵作用抑制了CTNNB1 功能， 進(jìn)而影響了T 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞轉(zhuǎn)化，起到治療慢性前列腺炎的作用。

綜上所述， 本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)確定了金沙藤抗慢性前列腺炎作用的成份與關(guān)鍵途徑。 從基因和KEGG 途徑中產(chǎn)生了三個(gè)與炎癥相關(guān)的假定途徑，然后這些途徑中關(guān)鍵激酶的分子對(duì)接技術(shù)證明田薊苷和烏蘇酸分別以CTNNB1 和IL-6 為靶點(diǎn)，協(xié)同作用調(diào)節(jié)T 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終起到治療慢性前列腺炎的作用。 該方法不僅篩選到了金沙藤中的有效成分，并且對(duì)有效成分的作用機(jī)制進(jìn)行了探索研究， 且這種綜合方法不僅適用于研究預(yù)測(cè)多組分中草藥的途徑或靶點(diǎn)，也適用于多組分中草藥配方。