王國驕

乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436

0 引言

布丁為一種源自英國的傳統(tǒng)食品，外形呈凝膠型半固體，深得中國消費者喜愛。近年來，含有豐富乳蛋白的牛奶布丁逐漸流行起來[1]。牛奶布丁是布丁家族中的一類由漿狀材料凝固而制得的果凍狀的凝膠型乳制品，一般作為飯后甜點或零食。隨著我國國民經(jīng)濟水平的不斷提升，消費者對于產(chǎn)品品質(zhì)的追求日漸凸顯，在食品方面，兼具口感和保健功能的產(chǎn)品成為市場新寵。目前市售布丁新品多表現(xiàn)在口味方面的變化[2]，而在營養(yǎng)與健康方面未見明顯突破，且傳統(tǒng)布丁在加工過程中，需要加入大量的增稠劑，來構(gòu)建其穩(wěn)定體系，這也不符合“大健康”的國策[3]。

腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是一類重要的乳酸菌，能發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸，具有高產(chǎn)酸、抗氧化和拮抗致病菌等能力；同時，因其能發(fā)酵產(chǎn)生乳酸及雙乙酰類物質(zhì)[4，5]，而被認為對多種傳統(tǒng)食品的風味有重要貢獻。目前腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp mesenteroides）已被廣泛應用作食品領域的風味劑，如在奶酪成熟過程中，可以發(fā)揮特殊的風味作用[6]。

我國衛(wèi)生部（衛(wèi)生部公告2012年第8號）和美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA，1989）都將腸膜明串珠菌腸膜亞種列為安全可食用菌種。腸膜明串珠菌BD3749（CGMCC10064）是本試驗室在前期工作中從傳統(tǒng)食品——發(fā)酵后的泡菜中分離出的一株菌，可以高產(chǎn)胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）。經(jīng)初步的研究表明，該菌株可特異性地合成不溶性EPS，并介導形成菌體及其他胞外物組成的復合結(jié)構(gòu)[7，8]。BD3749合成的EPS的結(jié)構(gòu)已被初步解析，其主要為高分子量的葡聚糖，雖不被人體消化吸收，但能特異性地促進某些有益菌的增殖[8]，因而可以作為新型的益生菌型膳食補充劑，有望對諸如糖尿病之類的慢性代謝性疾病起到干預作用。

番茄汁因其成本低、天然安全、來源廣，且富含膳食纖維、多種維生素以及番茄紅素等抗氧化成分，近年來被作為一種低成本的培養(yǎng)基，在科研及食品工業(yè)領域逐漸得到重視。隨著對其研究的進一步深入，以番茄汁為基礎介質(zhì)的食品形式不斷得到豐富[9]。這些食品具有安全性高、成本低、品質(zhì)易于標準化以及可進行批量工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。此前的一些研究表明，明串珠菌菌株在番茄汁培養(yǎng)基中生長良好，且當蔗糖供給充足時，能夠產(chǎn)生大量胞外多糖[10]。

據(jù)此，本文利用腸膜明串珠菌BD3749產(chǎn)生大量胞外多糖的這一特征，研制了一款基于番茄汁介質(zhì)的奶布丁乳制品。該乳制品蛋白質(zhì)含量高，且含有大量經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的高分子量葡聚糖，可以作為葡聚糖型膳食補充劑，且此產(chǎn)品無需添加增稠劑、穩(wěn)定劑等食品添加劑，營養(yǎng)又健康，很好地契合了當下消費者對于食品的高品質(zhì)需求。此外，該款產(chǎn)品利用了腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)生的葡聚糖在質(zhì)構(gòu)及保水性方面的特點，可以實現(xiàn)產(chǎn)品外觀形式上的花樣化，在美味、營養(yǎng)和健康的基礎上，增加了趣味性。

1 材料與儀器設備

1.1 試驗材料

MRS固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基，美國默克集團；脫脂乳粉，恒天然貿(mào)易有限公司；市場購得新鮮成熟番茄；-80℃凍存的腸膜明串珠菌BD3749（保藏編號為CGMCC10064），本實驗室分離。

MRS培養(yǎng)基（1 L）含有蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏粉10 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 g，K2HPO42 g，乙酸鈉 5 g，檸檬酸三銨2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺（UM/SK5），蘇州智凈凈化設備有限公司；搖床（TS-20H），上海天呈試驗儀器制造有限公司；渦旋振蕩器（VORTEX-5），貝克曼庫爾特國際貿(mào)易（上海）有限公司；pH計（FiveEasy），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；全自動生長曲線分析儀（Bioscreen C），Oy Growth Curves Ab Ltd.。

1.3 試驗方法

1.3.1 腸膜明串珠菌BD3749的凍干粉的制備

挑取2 個菌落，接種于300 mL的10%（w/w）的脫脂乳溶液里，于30 ℃培養(yǎng)4 h，在-80 ℃下預凍過夜后，于-20 ℃下冷凍干燥。

1.3.2 發(fā)酵種子液的制備

將腸膜明串珠菌BD3749的凍干粉用少量無菌蒸餾水溶解，用接種環(huán)取一環(huán)劃線于含5%蔗糖的MRS固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h取出，用接種環(huán)挑取單菌落放入10 mL含5%蔗糖的MRS液體培養(yǎng)基，運用渦旋振蕩器將菌落均勻分散于液體培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后取出，以2%（v/v）接種量接種于含5%蔗糖的MRS液體培養(yǎng)基，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)物15 000 r/min離心10 min，棄去上清，菌體用無菌蒸餾水洗滌3 次后，用原培養(yǎng)體積的無菌蒸餾水懸浮，得到發(fā)酵用的種子液即為腸膜明串珠菌種子液，發(fā)酵種子液中腸膜明串珠菌菌落數(shù)為1 億CFU/mL。

1.3.3 培養(yǎng)基的制備

（1）脫脂乳培養(yǎng)基（Medium A）制備

使用恒天然脫脂乳粉配制，比例為：5%脫脂乳粉+5%蔗糖，于105 ℃滅菌10 min后冷卻至室溫備用。

（2）番茄汁培養(yǎng)基（Medium B）制備

由市場購得新鮮成熟番茄，洗凈，去皮，榨汁機壓榨，80 目紗布過濾取汁，煮沸5 min，8 500 rmp離心10 min取上清，加入5%蔗糖，加熱溶解后冷卻，105 ℃滅菌10 min后冷卻至室溫備用。

（3）脫脂乳+番茄培養(yǎng)基（Medium A+B）制備

脫脂乳-番茄汁培養(yǎng)基（Medium A+B）由（1）和（2）中所述培養(yǎng)基按1:1比例混合而成，如表1所示，105 ℃滅菌10 min后冷卻備用。

表1 不同組別的腸膜明串珠菌培養(yǎng)基的組成

1.3.4 腸膜明串珠菌BD3749在番茄汁及脫脂乳系統(tǒng)中的發(fā)酵

取1.3.2中制備的種子液按1:50的比例分別轉(zhuǎn)接入A、B和A+B介質(zhì)中，在30 ℃，180 rpm條件下培養(yǎng)。設定時間點為0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，分別取樣，進行活菌數(shù)及多糖產(chǎn)量的測定。

1.3.5 活菌數(shù)的檢測方法

按設定的時間點取樣，經(jīng)梯度稀釋后均勻涂布于MRS平板（每個樣品做3 個重復），置于厭氧箱中培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)。通過所得的活菌數(shù)量繪制生長曲線。發(fā)酵過程中的pH使用pH計進行測定[11]。

1.3.6 多糖的產(chǎn)量測定

按下述方法分別對不溶性多糖和水溶性多糖的量進行測定，用兩者產(chǎn)量總和作圖。

（1）不溶性多糖的測定

發(fā)酵液凍干后，將凍干粉末與2 M的NaOH溶液以1 g∶4 mL的比例混合，室溫浸提2 h，15 000 rpm離心10 min，取上清，用2.5 M的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，15 000 rpm離心10 min后取沉淀，冷凍干燥后稱重即得水不溶性胞外多糖的量[12]。

（2）可溶性多糖的測定

將發(fā)酵液以8 000 rpm離心10 min，取上清，緩慢加入3 倍體積的無水酒精（邊加入邊攪拌），4 ℃靜置2 h后15 000 rpm離心10 min，收集所得沉淀，經(jīng)冷凍干燥后稱重即得可溶性胞外多糖的量[13]。

1.3.7 同心圓形花樣牛奶布丁的制備

取上述種子液按1:50的比例分別轉(zhuǎn)接入A、B、A+B的培養(yǎng)體系中。在30 ℃，180 rpm條件下培養(yǎng)30 h。取上述30 h的培養(yǎng)物（Medium A、A+B和B，依次定義為組1、組2、組3）經(jīng)過巴氏殺菌（72 ℃，15 min）后按照A、A+B、B的順序依次倒入品嘗杯中。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸膜明串珠菌BD3749在脫脂乳介質(zhì)中的生長情況

由圖1可以看出，pH反映其產(chǎn)酸情況，CFU值表征其活菌數(shù)的增加。在發(fā)酵前3 h，腸膜明串珠菌BD3749在脫脂乳介質(zhì)中生長緩慢，尚處在發(fā)酵初期，主要以積累菌體生物量為主；在3~12 h，隨著發(fā)酵時間的延長，增殖速率急劇加快，生長達到了對數(shù)期；在12~24 h，增殖速率放緩，進入了穩(wěn)定期，活菌數(shù)由達到log7.45 CFU/mL的極值；在隨后的24~72 h的時段內(nèi)，增殖速率開始緩慢下降，進入了衰亡期，活菌數(shù)降至log7.3 CFU/mL。而產(chǎn)酸情況由發(fā)酵開始時的pH 7.3至發(fā)酵72 h時的5.75。由此可知，發(fā)酵時間從0~24 h內(nèi)，腸膜明串珠菌BD3749生長良好，隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)酸能力增強，在脫脂乳中有一定生長及產(chǎn)酸能力，這對終產(chǎn)品的凝固成型是由有貢獻的。

圖1 腸膜明串珠菌BD3749 在脫脂乳中介質(zhì)中的生長情況

2.2 腸膜明串珠菌BD3749在番茄汁介質(zhì)中的產(chǎn)糖情況

圖2是BD3749在番茄汁介質(zhì)中的產(chǎn)糖情況，可以看出隨著發(fā)酵時間的延長，蔗糖濃度逐漸降低，EPS產(chǎn)量逐漸增加，當蔗糖溶度降低到1.6%時，EPS產(chǎn)量達到了18.4 g/L。作為多糖合成代謝作用的直接底物，蔗糖的濃度與腸膜明串珠菌BD3749多糖產(chǎn)量息息相關，蔗糖含量由5%降低到1.6%，反映了其對碳源的利用情況，是衡量其生長的一個重要指標，說明蔗糖被充分利用，EPS產(chǎn)量是形成終產(chǎn)品的主要因素。pH則反映其產(chǎn)酸情況，從發(fā)酵開始時的pH 7.0至發(fā)酵達到72 h時，pH降到4.0，說明隨著發(fā)酵時間的延長，BD3749在番茄汁介質(zhì)中的產(chǎn)酸能力也逐漸增強，這對終產(chǎn)品的成型也有重要貢獻，因為酸度可以導致介質(zhì)混合后發(fā)生凝乳，從而達到成型的效果。

圖2 腸膜明串珠菌BD3749在番茄汁介質(zhì)中的產(chǎn)糖情況

2.3 基于腸膜明串珠菌BD3749發(fā)酵的同心圓形花樣奶布丁

由圖3可以看出，圖A為脫脂乳-番茄汁培養(yǎng)基（Medium A+B）混合殺菌后將尚未凝結(jié)的布丁倒入容器中；圖B為成型的花樣奶布丁。本試驗對腸膜明串珠菌BD3749發(fā)酵產(chǎn)物殺菌冷卻后，將兩種發(fā)酵產(chǎn)物倒入同一個容器中，可以獲得不同形式的花樣奶布丁，不含食品添加劑營養(yǎng)又健康的同時，使得奶布丁的產(chǎn)品形式多樣化，增加了產(chǎn)品的趣味性。

圖3 基于腸膜明串珠菌BD3749的同心圓形花樣奶布丁

3 結(jié)論

本試驗以脫脂乳和番茄汁為介質(zhì)的、基于腸膜明串珠菌的發(fā)酵特性，將腸膜明串珠菌BD3749應用于制備花樣奶布丁，通過植物來源的果汁與動物來源的牛奶的結(jié)合，將植物營養(yǎng)和豐富的乳蛋白融合到一個產(chǎn)品中，且制備工藝簡單，對營養(yǎng)物質(zhì)的損傷小，既保留了牛乳中的營養(yǎng)成分，又富含抗氧化性成分和葡聚糖型膳食補充劑（含量為8 g/L），并且無需添加其他添加劑，僅通過發(fā)酵產(chǎn)物就可以自然成型，制得營養(yǎng)又健康的奶布丁，很好的契合了當下消費者對于食品的高品質(zhì)需求。此外，該款產(chǎn)品利用了腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)生的葡聚糖在質(zhì)構(gòu)及保水性方面的特點，可以實現(xiàn)在產(chǎn)品形式上的花樣化，在美味、營養(yǎng)和健康的基礎上，同時又增加了這一類產(chǎn)品的趣味性。