王瑞琪，陳 鋼，熊文能，朱宏林，簡素平

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330047)

番茄紅素是一種親脂性類胡蘿卜素，廣泛存在于番茄、西瓜、胡蘿卜等紅色果蔬中[1]。番茄紅素屬于高不飽和碳?xì)浠衔颷2]，含有11個共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵，這種獨(dú)特的共軛多烯結(jié)構(gòu)決定其具有極強(qiáng)的抗氧化、抗炎癥[3]、活化免疫系統(tǒng)[4]等生物活性。在人類營養(yǎng)和疾病預(yù)防方面的研究發(fā)現(xiàn)，膳食補(bǔ)充番茄紅素可有效預(yù)防和改善心血管疾病[5]、2型糖尿病[6]和多種癌癥[7]的發(fā)生和發(fā)展。因此，番茄紅素在食品、營養(yǎng)保健、醫(yī)藥等行業(yè)具有很高的研究和應(yīng)用價(jià)值。

微生物發(fā)酵法具有工藝操作簡便、不受季節(jié)限制等優(yōu)勢，通過此法生產(chǎn)番茄紅素已受到高度關(guān)注。其中，粗糙脈孢菌對營養(yǎng)條件需求低，可在多種類型的培養(yǎng)基中生長，并通過甲羥戊酸途徑合成黃-橙類胡蘿卜素[8]。此外，迄今為止，在粗糙脈孢菌中尚未檢測到有害物質(zhì)的生成，這有利于其在學(xué)術(shù)及工業(yè)領(lǐng)域中的更多應(yīng)用[9]。因此，粗糙脈孢菌可作為生產(chǎn)番茄紅素的潛在菌株。據(jù)報(bào)道，在培養(yǎng)基中添加脂類物質(zhì)(如植物油、脂肪酸)可有效促進(jìn)類胡蘿卜素的積累[10]，尤其以油酸、亞油酸、亞麻酸等脂肪酸的促進(jìn)作用更為顯著[11]。Vereschagina等[12]以富含亞麻酸植物油的培養(yǎng)基對三孢布拉氏霉菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，番茄紅素的產(chǎn)量顯著增加。Hu等[13]報(bào)道，培養(yǎng)基中添加花生四烯酸作為代謝刺激物可誘導(dǎo)與類胡蘿卜素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的提高，從而提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。外源脂質(zhì)的添加可影響菌體生長、底物同化及胞內(nèi)的代謝變化等[14]。菌體吸收脂肪酸后經(jīng)β-氧化可生成大量的乙酰輔酶A和能量，不僅有利于菌體生物量的積累，亦可為甲羥戊酸途徑合成番茄紅素提供更多的前體物質(zhì)及能量[15]，進(jìn)而促進(jìn)番茄紅素的合成。

本研究以經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的油酸為外源脂肪酸，探究其對粗糙脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響，采用響應(yīng)面優(yōu)化法得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，并進(jìn)一步探究油酸對番茄紅素合成相關(guān)酶的影響，為脂類物質(zhì)促進(jìn)番茄紅素生產(chǎn)的研究與應(yīng)用提供新的思路和理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)3.1608，購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨20 g/L，NaNO33 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，K2HPO41 g/L，自然pH。油酸經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，在發(fā)酵起始添加，其余培養(yǎng)基成分于121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

油酸(分析純)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；乙酸乙酯(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；丙酮(分析純)，西隴科學(xué)股份有限公司；乙腈、二氯甲烷(色譜純)，德國Merck公司；番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，北京Solarbio公司；乙酰輔酶A ELISA試劑盒、HMG-CoA合成酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A synthase，HMGS)ELISA試劑盒、HMG-CoA還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR)ELISA試劑盒、香葉基香葉基焦磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS)ELISA試劑盒，江蘇科特生物科技有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺，上海尚道儀器制造有限公司；TS-1210B恒溫?fù)u床，蘇州市國飛實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；MK3型多功能酶標(biāo)儀，芬蘭Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

取150 μL甘油管保藏的菌種涂布接種于PDA培養(yǎng)基中，30℃活化培養(yǎng)72 h，全程光照。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

挑取活化好的菌種孢子至30 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中混勻制得孢子懸浮液。取2.5 mL(接種量5%)接種至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于一定振蕩速率、一定溫度條件下?lián)u瓶振蕩培養(yǎng)19 h，繼續(xù)在一定溫度下靜置培養(yǎng)87 h，全程光照。以不含油酸的培養(yǎng)基為空白對照組，以添加油酸的培養(yǎng)基為油酸組。

1.2.3 生物量及生長曲線的測定

發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)8 000 r/min、5 min離心去除發(fā)酵液，蒸餾水洗滌3次并收集菌體，于45℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干48 h，稱量得到的干燥菌體質(zhì)量即為生物量。以開始靜置培養(yǎng)時(shí)間(19 h)為首個記錄點(diǎn)，然后每間隔12 h收集并稱量記錄生物量。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，生物量為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.4 番茄紅素產(chǎn)量的測定

1.2.4.1 番茄紅素的提取

待發(fā)酵結(jié)束后，在處理得到的干燥菌體中(按1.2.3方法)加入適量石英砂以輔助研磨至粉末狀，加入25 mL乙酸乙酯-丙酮溶液(體積比2∶3)為萃取溶劑，于40 kHz、25℃條件下超聲25 min，再經(jīng)33℃水浴鍋中暗室提取2.5 h，離心(8 000 r/min，10 min)后收集上清的色素浸提液并適當(dāng)稀釋，通過0.22 μm微孔濾膜過濾后，經(jīng)高效液相色譜進(jìn)行測定。

1.2.4.2 高效液相色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動相為乙腈-二氯甲烷溶液(體積比3∶2)；柱溫28℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；運(yùn)行時(shí)間10 min；檢測波長472 nm。

1.2.4.3 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

100 μg/mL番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品母液的配制：精確稱量1 mg番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯-丙酮溶液(體積比2∶3)定容至10 mL。再經(jīng)稀釋后得到質(zhì)量濃度分別為80、60、40、20、0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于1.2.4.2色譜條件下進(jìn)行測定，以番茄紅素質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)，得到番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=24.246x+51.938，R2=0.998 8。

1.2.4.4 番茄紅素產(chǎn)量的計(jì)算

根據(jù)公式(1)計(jì)算番茄紅素產(chǎn)量(Y)。

Y=(y-51.938)/24.246×(V1/V2)

(1)

式中：y為樣品的番茄紅素峰面積；V1為樣品浸提稀釋液總體積；V2為發(fā)酵液體積。

1.2.5 乙酰輔酶A及番茄紅素合成相關(guān)酶質(zhì)量濃度的測定

待發(fā)酵結(jié)束后，離心(8 000 r/min，5 min)去除發(fā)酵液，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌3次后收集菌體，經(jīng)真空冷凍干燥48 h得到干燥菌體。分別精確稱量50 mg干燥菌體，根據(jù)ELISA試劑盒的方法分別測定乙酰輔酶A和番茄紅素合成相關(guān)酶(HMGS、HMGR、GGPPS)的OD值。使用試劑盒中所提供的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同質(zhì)量濃度測定其OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品的OD值計(jì)算各樣品乙酰輔酶A和番茄紅素合成相關(guān)酶的質(zhì)量濃度。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置5組平行。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

除特別說明，所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。應(yīng)用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA分析，P<0.05時(shí)表明具有顯著差異。采用Excel 2019作圖，并通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 孢子濃度對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響

接種孢子濃度是影響微生物生長及合成次級代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵因素[16]。將孢子懸浮液濃度分別調(diào)整至2.5×105、5.0×105、1.0×106、2.0×106、4.0×106個/mL，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中。采用不含油酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，在振蕩速率100 r/min、振蕩培養(yǎng)溫度及靜置培養(yǎng)溫度均為30℃條件下，考察孢子濃度對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 孢子濃度對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響

由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著孢子濃度的增大，番茄紅素產(chǎn)量及菌體生物量均表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢，分別在孢子濃度為1.0×106、2.0×106個/mL時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)孢子濃度較低時(shí)，菌體生長緩慢，不能保證足夠的菌體量使其代謝產(chǎn)物產(chǎn)量最大化[17]。當(dāng)孢子濃度較高時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量下降。這是由于粗糙脈孢菌生產(chǎn)番茄紅素受氧氣影響[18]，在提高接種濃度而含氧量不變的條件下，培養(yǎng)基黏度增加引起溶氧不足；同時(shí)在發(fā)酵后期，處于衰老期的菌體細(xì)胞可能會積累一些自身抑制物質(zhì)，影響番茄紅素的合成[19]。因此，最佳孢子濃度為1.0×106個/mL，采用此濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 生長曲線測定

圖2為振蕩速率100 r/min、振蕩培養(yǎng)溫度及靜置培養(yǎng)溫度均為30℃條件下，空白對照組及添加0.6 g/L油酸組的菌體生長曲線，反映了粗糙脈孢菌在一定環(huán)境條件下的群體生長規(guī)律[20]。

圖2 粗糙脈孢菌在添加或不添加油酸培養(yǎng)基中的生長曲線

由圖2可知，在整個生長周期內(nèi)，兩組菌體生長變化趨勢一致，大約在31 h進(jìn)入穩(wěn)定生長期，且油酸組的菌體生物量顯著高于空白對照組?？梢?，當(dāng)以含有油酸的培養(yǎng)基對粗糙脈孢菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，其生長活性穩(wěn)定，促進(jìn)了菌體生物量的增加。因此，進(jìn)一步探究培養(yǎng)基中添加油酸對粗糙脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 油酸質(zhì)量濃度對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響

在振蕩速率100 r/min、振蕩培養(yǎng)溫度及靜置培養(yǎng)溫度均為30℃條件下，考察油酸質(zhì)量濃度對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 油酸質(zhì)量濃度對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響

由圖3可知，當(dāng)油酸質(zhì)量濃度分別為0.8、1.0 g/L時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量和菌體生物量達(dá)到最大，其番茄紅素產(chǎn)量是空白對照組(油酸質(zhì)量濃度為0 g/L)的2.31倍。當(dāng)以含有油酸的培養(yǎng)基對粗糙脈孢菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，油酸經(jīng)β-氧化分解生成大量的乙酰輔酶A和能量，不僅促進(jìn)了菌體的生長，同時(shí)可供利用更多的乙酰輔酶A經(jīng)甲羥戊酸途徑合成番茄紅素，有利于番茄紅素的積累。當(dāng)油酸質(zhì)量濃度過高時(shí)，由于不飽和脂肪酸的自動氧化作用會產(chǎn)生對菌體自身不利的氧脂質(zhì)和短鏈醛[21]，進(jìn)而影響了粗糙脈孢菌的生長及番茄紅素的合成。該結(jié)果與Hu等[13]的報(bào)道一致，在添加0.4 g/L花生四烯酸的培養(yǎng)基中，三孢布拉氏霉菌中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到最大，而花生四烯酸質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時(shí)其產(chǎn)量顯著下降。因此，選擇油酸質(zhì)量濃度為0.8 g/L用于響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3.2 振蕩速率對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響

本文以二階段培養(yǎng)方式對粗糙脈孢菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，即先經(jīng)過一段時(shí)間的振蕩培養(yǎng)再繼續(xù)靜置培養(yǎng)。第一階段振蕩培養(yǎng)是積累生物量，此時(shí)菌株主要以菌絲球的形態(tài)生長，較少產(chǎn)生分生孢子[22]。振蕩速率直接影響培養(yǎng)液中的溶解氧及剪切力[23]，對菌體初始生長過程具有重要意義，進(jìn)而影響代謝產(chǎn)物的合成。在油酸質(zhì)量濃度0.6 g/L、振蕩培養(yǎng)溫度及靜置培養(yǎng)溫度均為30℃條件下，考察振蕩速率對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 振蕩速率對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響

由圖4可知，菌體生物量隨著振蕩速率的增大而減小，在振蕩速率為100 r/min時(shí)番茄紅素產(chǎn)量最大。當(dāng)振蕩速率較低時(shí)，菌體所受剪切力較小，形成的菌絲球較大[24]，有利于菌體生物量的積累；但可能使培養(yǎng)環(huán)境中氧氣過多消耗，從而影響番茄紅素的合成。當(dāng)振蕩速率較高時(shí)，會對菌體產(chǎn)生一定的剪切作用，加快菌體自溶，不利于菌體生物量的積累，影響番茄紅素的合成[25]。因此，選擇振蕩速率為100 r/min用于響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3.3 振蕩培養(yǎng)溫度對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響

適宜的溫度有益于微生物的生長和代謝活動，對代謝產(chǎn)物的合成具有重要影響[26]。在油酸質(zhì)量濃度0.6 g/L、振蕩速率100 r/min、靜置培養(yǎng)溫度30℃條件下，考察振蕩培養(yǎng)溫度對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 振蕩培養(yǎng)溫度對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響

由圖5可知，當(dāng)振蕩培養(yǎng)溫度為35℃時(shí)，菌體生物量和番茄紅素產(chǎn)量均達(dá)到最大。振蕩培養(yǎng)階段是菌體快速積累生物量的過程，當(dāng)溫度低于35℃時(shí)，減弱了菌體對環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收速率[27]，不利于生物量的積累，番茄紅素的產(chǎn)量亦較低。當(dāng)溫度較高時(shí)，菌體細(xì)胞內(nèi)整體酶的代謝活動受到影響[28]，生物量下降，進(jìn)而影響番茄紅素的合成。因此，選擇振蕩培養(yǎng)溫度為35℃用于響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3.4 靜置培養(yǎng)溫度對番茄紅素產(chǎn)量的影響

在油酸質(zhì)量濃度0.6 g/L、振蕩速率100 r/min、振蕩培養(yǎng)溫度30℃條件下，考察靜置培養(yǎng)溫度對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 靜置培養(yǎng)溫度對菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量的影響

由圖6可知，在實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，菌體生物量和番茄紅素產(chǎn)量均呈先升高后下降的變化趨勢。當(dāng)靜置培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量和生物量均達(dá)到最大。經(jīng)分析可知，當(dāng)靜置培養(yǎng)溫度升高至35℃時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量及菌體生物量與空白對照組無顯著差異(P>0.05)；當(dāng)靜置培養(yǎng)溫度高于35℃時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量及菌體生物量均低于空白對照組。靜置培養(yǎng)階段主要誘導(dǎo)粗糙脈孢菌生長氣生菌絲進(jìn)而產(chǎn)生孢子；同時(shí)，此階段培養(yǎng)時(shí)間較長，當(dāng)溫度較高或較低時(shí)，不利于粗糙脈孢菌氣生菌絲及孢子的生長，影響菌體生物量和番茄紅素的合成。另一方面，在較高溫度下可能使番茄紅素合成相關(guān)酶的活性降低甚至失活，亦對番茄紅素的合成造成影響。因此，30℃是粗糙脈孢菌氣生菌絲及孢子的最適生長溫度。綜合考慮，恒定靜置培養(yǎng)溫度為30℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定靜置培養(yǎng)溫度為30℃，以油酸質(zhì)量濃度(A)、振蕩速率(B)及振蕩培養(yǎng)溫度(C)為考察因素，以番茄紅素產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，依據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.2 模型的建立及方差分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件對表2中結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到以番茄紅素產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)式回歸方程：Y=4.01+0.48A-0.029B-0.28C+0.07AB-0.22AC-0.048BC-0.67A2-0.28B2-0.85C2。

對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析

2.4.3 粗糙脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素最佳培養(yǎng)條件的確定

根據(jù)優(yōu)化模型可知，當(dāng)油酸質(zhì)量濃度為0.88 g/L、振蕩速率為100.23 r/min、振蕩培養(yǎng)溫度為33.92℃時(shí)，粗糙脈孢菌的番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到最高值，預(yù)測值為4.13 mg/L。對優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的方便性，將培養(yǎng)條件修正為油酸質(zhì)量濃度0.90 g/L、振蕩速率100 r/min、振蕩培養(yǎng)溫度34℃，經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)后得到番茄紅素產(chǎn)量為4.21 mg/L，與模型預(yù)測結(jié)果相近，此時(shí)番茄紅素產(chǎn)量是空白對照組的2.77倍。

2.5 油酸對粗糙脈孢菌內(nèi)乙酰輔酶A及番茄紅素合成相關(guān)酶的影響

按研究確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，以不含油酸的培養(yǎng)基為空白對照組，以添加質(zhì)量濃度為0.8 g/L油酸的培養(yǎng)基為油酸組，測定兩組菌體中乙酰輔酶A及番茄紅素合成相關(guān)酶的變化。

2.5.1 對乙酰輔酶A的影響(見圖7)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

由圖7可知，以含油酸的培養(yǎng)基對粗糙脈孢菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，其乙酰輔酶A的水平顯著高于空白對照組，提高了37.64%(P<0.05)。β-氧化是脂肪酸分解代謝生成乙酰輔酶A的重要步驟，并且乙酰輔酶A可進(jìn)一步作為合成番茄紅素的起始物質(zhì)。因此，粗糙脈孢菌攝取油酸后通過分解可獲得更高含量的乙酰輔酶A，有利于更多的前體物質(zhì)進(jìn)入甲羥戊酸途徑合成番茄紅素。

2.5.2 對番茄紅素合成相關(guān)酶的影響(見圖8)

圖8 培養(yǎng)基中添加油酸對HMGS、HMGR和GGPPS水平的影響

由圖8可知，空白對照組中HMGS、HMGR及GGPPS的水平分別為142.40、94.83 ng/L和88.81 ng/L，油酸組中HMGS、HMGR及GGPPS的水平分別提高至200.71、134.84 ng/L和151.28 ng/L，均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖9為粗糙脈孢菌經(jīng)甲羥戊酸途徑合成番茄紅素的代謝路徑。

圖9 粗糙脈孢菌中番茄紅素的生物合成途徑

由圖9可以看出，在整個過程中，HMGS、HMGR及GGPPS對番茄紅素的合成具有重要影響。HMGS催化乙酰乙酰輔酶A合成HMG-CoA，其是番茄紅素合成的重要前體物質(zhì)；HMGR是番茄紅素合成途徑中的第一個限速酶，催化HMG-CoA不可逆地生成甲羥戊酸[29]；GGPPS控制著另一個重要中間代謝物質(zhì)的生成，誘導(dǎo)加快FPP向GGPP的轉(zhuǎn)換，促進(jìn)GGPP的合成[30]。因此，油酸組中上述酶水平的上調(diào)有利于調(diào)節(jié)更多的乙酰輔酶A用于合成番茄紅素，提高番茄紅素產(chǎn)量。這與先前的報(bào)道相似，花生四烯酸通過誘導(dǎo)HMGR的表達(dá)促進(jìn)了類胡蘿卜素的積累[31]。未來可進(jìn)一步探究油酸促進(jìn)番茄紅素合成的機(jī)理。

3 結(jié) 論

當(dāng)培養(yǎng)基中添加油酸后，可顯著提高粗糙脈孢菌的番茄紅素產(chǎn)量。通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為油酸質(zhì)量濃度0.90 g/L、振蕩速率100 r/min、振蕩培養(yǎng)溫度34℃、靜置培養(yǎng)溫度30℃，在此條件下粗糙脈孢菌的番茄紅素產(chǎn)量為4.21 mg/L，是空白對照組的2.77倍。在培養(yǎng)基中添加油酸不僅有利于粗糙脈孢菌生物量的積累，胞內(nèi)乙酰輔酶A和番茄紅素合成相關(guān)酶(HMGS、HMGR、GGPPS)的水平均顯著增加，可供利用更多的前體物質(zhì)朝向甲羥戊酸合成途徑，有利于番茄紅素的合成。