彭 梅，楊 娟，李良群，楊小生，郁華英，孫 斌，羅忠圣，楊 艷，潘 雄，蔡 用

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014；2.貴陽市息烽縣人民醫(yī)院ICU，貴州 貴陽 551100）

珊瑚姜（Zingiber corallinumHance）為姜科植物珊瑚姜的根莖[1-3]，別名老虎姜、陰姜，為貴州少數(shù)民族常用藥[4-5]，主要含有揮發(fā)油、蒽醌、姜黃素、粘液質(zhì)等成分[6-9]，具有抑制真菌、殺蟲、抗氧化、治胃病等作用[10-13]。珊瑚姜中揮發(fā)油具有很多藥理活性，廣大科研學(xué)者對其開展多方面的研究，市場上也有很多含珊瑚姜揮發(fā)油的產(chǎn)品[14-15]。

發(fā)酵中藥是生物技術(shù)和中藥提取的完美結(jié)合，中藥借助微生物的作用，如細(xì)菌、霉菌、酵母等菌種進(jìn)行發(fā)酵，通過這些微生物自身的物質(zhì)代謝，使中藥材的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)發(fā)生分解和改變，產(chǎn)生很多復(fù)雜的中間代謝或交叉代謝產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)之間的代謝轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生新的生物活性成分，并代謝產(chǎn)生多種生物酶，改變了原有藥性，提高了臨床療效，降低了不良反應(yīng)，擴(kuò)大了適應(yīng)癥，與傳統(tǒng)中藥加工炮制相比發(fā)酵具有提高藥效、減毒、擴(kuò)大用途等特點(diǎn)[16-19]。

中藥發(fā)酵過程中有效成分的結(jié)構(gòu)變化與加入的微生物組成關(guān)系密切，復(fù)合菌群發(fā)酵通過菌之間的交叉作用，使得發(fā)酵更為徹底，高效酒曲以產(chǎn)酯產(chǎn)香的細(xì)菌類微生物為主，含少量酵母菌，用于發(fā)酵含有淀粉物質(zhì)如大米、玉米、紅糧等的混合微生物產(chǎn)品，具有糖化發(fā)酵力強(qiáng)，出酒率高等特點(diǎn)，一般少用于藥材的發(fā)酵[20-24]，醋酸桿菌（Acetobacter aceti）是一類能使糖類和酒精氧化成醋酸等產(chǎn)物的短桿菌，化能異養(yǎng)型，利用葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、酒精作為碳源，可利用蛋白質(zhì)水解物、尿素、硫酸銨作為氮源，因此除能氧化酒精生成醋酸外，還可氧化其他醇類和糖類生成相應(yīng)的酸和酮。

珊瑚姜目前臨床上用的較多的制劑為含揮發(fā)油制劑，一般揮發(fā)油采用水浴回流提取、超臨界提取等，珊瑚姜藥材采用醇提、水提等方法制備，珊瑚姜產(chǎn)品的發(fā)酵較少見文獻(xiàn)報道。超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time of flight tandem mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS/MS）因其載樣量大、分離度好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，成為分析藥物代謝產(chǎn)物的有效技術(shù)手段，再進(jìn)一步結(jié)合質(zhì)量虧損過濾技術(shù)分析，可高選擇性的從復(fù)雜的機(jī)制中快速找到藥物的代謝產(chǎn)物及鑒定其可能的分子結(jié)構(gòu)，從而可提供良好的代謝物覆蓋率[25-27]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）法分離快，靈敏度較高，比較實(shí)用于揮發(fā)性物質(zhì)的檢測；而珊瑚姜富含豐富的揮發(fā)油，因此采用UPLC-MS/MS及GC-MS分別對發(fā)酵前后的珊瑚姜物質(zhì)進(jìn)行比較，使得檢測到物質(zhì)更為精準(zhǔn)，數(shù)據(jù)更為可靠。

本課題組在前期研究中，將高效酒曲用于中藥材的發(fā)酵，聯(lián)合醋酸桿菌共同對中藥材發(fā)酵發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)酵后的藥材對疾病的治療作用增強(qiáng)，因此，本實(shí)驗(yàn)利用高效酒曲對珊瑚姜進(jìn)行酒樣發(fā)酵后再加入醋酸桿菌進(jìn)行酸度發(fā)酵，對其發(fā)酵前后的成分進(jìn)行對比，為珊瑚姜的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

珊瑚姜：購買于黔南州興義市，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為姜科植物珊瑚姜（Zingiber CorallinumHance）的根塊；高效酒曲：貴州科力實(shí)驗(yàn)公司；純凈水：本課題組自制；乙醇（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）：德國Merck公司；甲醇（色譜純）：美國Tedia公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、石膏樣小孢子菌（Microsporum gypseum）、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum）：上海滬崢生物科技有限公司；醋酸桿菌（Acetobacter aceti）：成都市食品調(diào)味研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

QE Focus UPLC-Q-TOF-MS/MS聯(lián)用儀：美國賽默飛世爾科技公司；Millipore-0026超純水機(jī)：美國Millipore公司；HP6890/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；FA2004N電子天平：上海菁嗨儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

珊瑚姜水煎液制備：將珊瑚姜藥材粉碎過10目篩，稱取粉末30 g，加入純凈水300 mL，文火煎煮0.5 h，過濾后將濾液減壓濃縮至10 mL，放置冰箱備用。

珊瑚姜酒曲發(fā)酵液制備[28-29]：稱取30 g珊瑚姜粉末，加入300 mL純凈水，15%白砂糖，水浴滅菌30 min，冷卻后加入5%的活化高效酒曲，30 ℃恒溫條件下無氧發(fā)酵21 d取出滅活，過濾后將濾液濃縮至10 mL，放置冰箱備用。

珊瑚姜醋酸發(fā)酵液制備：稱取30 g珊瑚姜粉末，加入300 mL純凈水，15%白砂糖，水浴滅菌30 min，冷卻后加入5%的活化高效酒曲（加入少量白砂糖及40 ℃左右的5 mL左右的純凈水，在37 ℃水浴中恒溫20 min，中途5 min攪拌一次），30 ℃恒溫條件下無氧發(fā)酵5 d至酒精度含量達(dá)40%vol～45%vol左右后加入0.2%的醋酸桿菌繼續(xù)發(fā)酵至21 d，取出滅活，過濾后將濾液濃縮至10 mL，放置冰箱備用。

1.3.2 化合物成分測定方法

分別用UPLC-MS和GC-MS測定珊瑚姜發(fā)酵液及水煎液中的總體成分和揮發(fā)性成分，并對其進(jìn)行分析。

UPLC-Q-TOF-MS/MS 色譜條件：ACE Ultracore2.5 Super C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫程序：0～2 min，5%A；2～42 min，5%～95%A；47～50 min，5%A，體積流量0.3 mL/min，柱溫40 ℃。質(zhì)譜條件：靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜采用正離子模式，噴霧電壓3 kV，輔助氣：0.06 MPa，鞘氣：0.24 MPa，離子傳輸管溫度：320 ℃。一級全掃描：質(zhì)量范圍：80～1 200 m/z，分辨率：70 000。二級掃描，分辨率：17 500，碰撞氣體為氮?dú)猓∟2），碰撞能量30 eV。

氣相色譜條件：色譜柱為FLM-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），初始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升溫至325 ℃后，以8 ℃/min升溫至310 ℃后，保持9 min，運(yùn)行時間：56 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He）（99.999%）；柱前壓0.05 MPa，載氣流量1.0 mL/min，分流比10∶1，溶劑延遲時間：6.0 min。質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 894 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍29～450 amu。

1.3.3 珊瑚姜制備液對真菌抑制作用的測定

濾紙片法：用無菌移液槍吸取80 μL紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌的菌液（含活菌個數(shù)106/mL）均勻涂抹在PDA平板上[22-24]，再用無菌鑷子將直徑為6 mm的圓濾紙片貼入平板的4個小區(qū)（每平板劃分4個小區(qū)）內(nèi)對應(yīng)位置，加入20 μL上述各制備液，再將加好藥的帶菌PDA平板放置26～28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，石膏樣小孢子菌培養(yǎng)48 h，紅色毛癬菌培養(yǎng)5～7 d，取出測量抑菌圈直徑的大小[25-26]。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析方法

對發(fā)酵液、水煎液質(zhì)譜圖進(jìn)行分析。根據(jù)一級質(zhì)譜離子峰上所得到的精確化合物相對分子質(zhì)量信息（MS1），通過xcalibur軟件在5×10-6的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)計算其精確分子式，完成各化合物的初步鑒定。其次，選擇合適分子離子峰進(jìn)行碰撞，通過二級質(zhì)譜的裂解（MS2），獲得化合物相應(yīng)的碎片離子，根據(jù)裂解的情況結(jié)合文獻(xiàn)分析化合物的信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-MS檢測珊瑚姜發(fā)酵前后成分變化

采用UPLC-MS檢測珊瑚姜水煎液、經(jīng)過高效酒曲聯(lián)合醋酸桿菌發(fā)酵后制備液中成分的變化，其檢測的質(zhì)譜圖見圖1、圖2，化合物信息見表1。

圖1 珊瑚姜水煎液的UPLC-Q-TOF-MS/MS質(zhì)譜圖Fig.1 UPLC-Q-TOF-MS/MS spectrogram of water decoction of Zingiber corallinum

由圖1、圖2及表1可以看出，珊瑚姜經(jīng)高效酒曲及醋酸桿菌發(fā)酵后，經(jīng)UPLC-MS檢測到的成分種類減少，發(fā)酵后的成分多數(shù)與發(fā)酵前水煎液不同，檸檬酸、原兒茶醛、對羥基安息香醛、白術(shù)內(nèi)酯I、梣酮、白術(shù)內(nèi)酯II、青蒿乙素、雙氫青蒿素、小白菊內(nèi)酯、莪術(shù)二酮、莪術(shù)烯醇、莪術(shù)醇、吉馬酮、藁本內(nèi)酯等15個成分發(fā)酵前后無變化。在水煎液中，珊瑚姜中發(fā)酵前的姜黃素在發(fā)酵液中沒有檢測到，而檢測到去甲氧基姜黃素，發(fā)酵后產(chǎn)生的新成分，與發(fā)酵前結(jié)構(gòu)上有差異，可能是微生物在代謝過程中產(chǎn)生的變化，發(fā)酵后的藥效增強(qiáng)也許與這些成分的變化有關(guān)。

圖2 珊瑚姜醋酸桿菌發(fā)酵液的UPLC-Q-TOF-MS/MS質(zhì)譜圖Fig.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS spectrogram of fermentation broth of Zingiber corallinum by Acetobacter aceti

表1 珊瑚姜水煎液及發(fā)酵液中化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS測定結(jié)果Table 1 Determination results of components of water decoction and fermentation broth of Zingiber corallinum by UPLC-Q-TOFMS/MS

續(xù)表

2.2 GC-MS檢測珊瑚姜發(fā)酵前后香氣成分的變化

經(jīng)GC-MS對發(fā)酵前后珊瑚姜進(jìn)行香氣成分分析，繪制珊瑚姜制備液的GC-MS總離子流色譜圖見圖3，檢測珊瑚姜發(fā)酵前后香氣成分及相對百分含量，結(jié)果見表2。

圖3 珊瑚姜發(fā)酵前后香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of aroma compositions of Zingiber corallinum before and after fermentation analysis by GC-MS

表2 珊瑚姜發(fā)酵前后香氣成分含量GC-MS檢測結(jié)果Table 2 Determination results of aroma compositions contents of Zingiber corallinum before and after thefermentation by GC-MS

續(xù)表

由圖3及表2可知，對總離子色譜流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist05和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定珊瑚姜中總檢測到的化合物有176個，鑒別出的已知成分有74個，其中珊瑚姜水煎液中含有73個成分，已知成分38個，珊瑚姜發(fā)酵液中含有77個成分，已知成分36個（表2列舉出的均為已知成分）。比較發(fā)酵前后的成分變化發(fā)現(xiàn)，水煎液與發(fā)酵液有14個成分是相同的，與水煎液比較，有20個成分在發(fā)酵液中未被檢測到，但在發(fā)酵液中，有19個成分在水煎液中不存在，為新生成分，也許是經(jīng)發(fā)酵后，高效酒曲及醋酸桿菌中的微生物能改變珊瑚姜的香氣成分。

水煎液以及發(fā)酵液的香氣物質(zhì)種類的百分含量對比結(jié)果見圖4。由圖4可知，經(jīng)發(fā)酵后，珊瑚姜中物質(zhì)種類和含量也有很大的變化，發(fā)酵前，主要是烯烴類物質(zhì)比例較大，占總物質(zhì)成分的50%，醛類和醇類的含量也較大，各占了總物質(zhì)成分的17%，經(jīng)發(fā)酵后，烯烴類物質(zhì)下降至25%，而其他雜類成分占了42%，醇類物質(zhì)含量下降至14%，但發(fā)酵過程中產(chǎn)生了酚類物質(zhì)，占總物質(zhì)含量的3%。

圖4 水煎液（A）以及發(fā)酵液（B）的香氣物質(zhì)種類百分含量Fig.4 Percentage content of aroma substances types of water decoction (A) and fermentation broth (B) of Zingiber corallinum

2.3 珊瑚姜發(fā)酵液對紅色毛癬菌及石膏樣小孢子菌的抑制作用

測定珊瑚姜水煎液、珊瑚姜醋酸發(fā)酵液及珊瑚姜酒曲發(fā)酵液對紅色毛癬菌及石膏樣小孢子菌的抑菌圈直徑，結(jié)果見表3。

表3 不同珊瑚姜制備液的抑菌圈大小Table 3 Inhibition zone of Zingiber corallinum preparation liquid

由表3可知，珊瑚姜酒曲酵液、珊瑚姜醋酸發(fā)酵液、珊瑚姜水煎液對石膏樣小孢子菌的抑菌圈直徑分別為9 mm、14 mm、9 mm；對紅色毛癬菌的抑菌圈直徑分別為4.5 mm、11 mm、9 mm，可見酒曲聯(lián)合醋酸桿菌發(fā)酵珊瑚姜能提高其抑制紅色毛癬菌與石膏樣小孢子菌的能力。

3 結(jié)論

通過GC-MS檢測對珊瑚姜發(fā)酵前后的成分進(jìn)行比較，結(jié)果表明，發(fā)酵液中香氣成分種類增加，成分與發(fā)酵前有所差別；經(jīng)UPLC-MS/MS檢測，發(fā)酵后檢測到的成分比發(fā)酵前減少，發(fā)酵后珊瑚姜檢索到的成分大致與發(fā)酵前一致，也有新的成分生成；經(jīng)發(fā)酵后的珊瑚姜對紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌兩株人腳癬真菌的抑菌效果均優(yōu)于發(fā)酵前，因此發(fā)酵珊瑚姜更利于治療疾病，更能充分發(fā)揮藥效。