王 賽，張 嵐，陳永艷，邢方瀟

(中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100021)

微塑料是指粒徑小于5 mm的塑料顆粒、碎片、纖維等，可分為原生微塑料和次生微塑料。原生微塑料是指最初被制造為具有微觀尺寸的微塑料，次生微塑料是指大型塑料物品經(jīng)碎裂和風(fēng)化而形成的微塑料[1]。微塑料在環(huán)境中來源廣泛，包括陸地上人為活動(如日常使用的清潔產(chǎn)品中的洗滌靈、洗衣纖維、洗面奶)、基礎(chǔ)設(shè)施(如道路上路標(biāo)油漆脫落)、土地使用(如園藝生產(chǎn)過程中用以控制溫度和濕度的塑料薄膜)和廢水排放等[2]。不同水體中微塑料的豐度存在較大差異，污水、湖泊、河流、水渠、地下水、處理前后的自來水以及瓶裝水中微塑料的存在豐度可跨越10個數(shù)量級，為1×10-2～1×108個/m3[3]。由于人類每天大量的需水量，飲用水被認為是微塑料進入人體的重要途徑之一[4]。

目前，國內(nèi)外尚未建立飲用水中微塑料的標(biāo)準(zhǔn)化檢驗方法，相關(guān)文獻中采用的前處理及檢測方法也不盡相同。前處理是水中微塑料檢測中的重要步驟，其主要目的是在消解和去除水樣中天然有機物等干擾性物質(zhì)的基礎(chǔ)上完成富集和濃縮。文獻中主要有化學(xué)反應(yīng)和酶催化反應(yīng)：化學(xué)反應(yīng)主要分為4種，包括酸(HCl、HNO3、HClO4)法、堿(NaOH、KOH)法、氧化劑(H2O2)法[5]和芬頓試劑法[6-7]；酶催化反應(yīng)包括纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶[8]。H2O2消解處理對微塑料表面形態(tài)和其對應(yīng)的元素組成影響較小，因此，被認為是較佳的處理方式[5]。雖然近年在飲用水的研究中使用H2O2消解水樣中的天然有機物的應(yīng)用較多，但使用條件和濃度各不相同[9-13]。微塑料的檢測方法也眾多，包括光學(xué)顯微鏡法、電子掃描顯微鏡法、紅外光譜法、拉曼光譜法以及熱分析技術(shù)如括差示掃描量熱法(DSC)、熱重量分析結(jié)合差示掃描量熱法(TGA-DSC)及熱分解氣相色譜質(zhì)譜(Pyr-GC-MS)等[14]。飲用水中含有大量尺寸小于10 μm的微塑料[10,15-18]，因此，顯微紅外光譜法和顯微拉曼光譜法被認為是適用于飲用水中微塑料檢測的首選方法。本團隊在前期的研究中已建立了飲用水中微塑料顯微紅外光譜的檢測方法[19]，本研究的主要目標(biāo)是基于顯微拉曼光譜技術(shù)探索建立飲用水中微塑料檢測的定性定量分析方法，對樣品的前處理過程，如抽濾方式、消解條件、適用濾膜類型以及顯微拉曼光譜儀的儀器參數(shù)等進行了條件試驗，力求對較小粒徑的微塑料完成有效檢測，且操作簡單，消耗時間適宜，檢測結(jié)果準(zhǔn)確有效。

1 試驗方法

1.1 儀器與材料

共聚焦顯微拉曼成像系統(tǒng)(Nicolet DXR3，美國Thermo Fisher公司)、純水機(Milli-Q Integral 5，美國Millipore公司)、ME104電子天平(感量為0. 000 1 g，瑞士Mettler公司)、隔膜真空泵(GM-0.5 A，天津津騰設(shè)備有限公司)、超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)、生物顯微鏡(奧林巴斯工業(yè)有限公司)、玻璃抽濾裝置。H2O2溶液(分析純，30%)、無水乙醇(分析純)；硝酸纖維素濾膜(0.45 μm，Millipore，美國)、玻璃纖維素濾膜(0.7 μm，Whatman，美國)、不銹鋼濾膜(2 μm，北京芥微科技有限公司)、氧化鋁膜(0.2 μm，Whatman，美國)；聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酰胺/尼龍(Polyamide/Nylon 6)、纖維素(Cellulose)、聚苯乙烯(PS)微塑料標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 方法

試驗方法包括水樣的前處理以及使用顯微拉曼儀進行定性定量檢測和分析。前處理和檢測流程如圖1所示。(1)水樣；(2)一級過濾：截留水樣中≥2 μm的所有顆粒物；(3)消解：對一級過濾后濾膜上的截留物質(zhì)進行消解，選擇適宜的消解液和消解條件，去除截留物中天然有機物及其他會對后續(xù)微塑料檢測產(chǎn)生干擾的物質(zhì)；(4)洗脫：將濾膜上的待測物質(zhì)經(jīng)超聲波振蕩至消解液中，形成洗脫液；(5)二級過濾：將洗脫液用定制的抽濾裝置進行二級過濾；(6)上機檢測。

圖1 前處理和檢測過程示意圖Fig.1 Schematic Diagram of Pre-Processing and Detection Process

1.2.1 二級過濾濾膜選擇

結(jié)合拉曼光譜的使用要求和檢測成本要求，本研究確定了二級過濾濾膜的3個選擇條件：(1)濾膜表面平整光滑，濾膜材質(zhì)在使用顯微拉曼儀檢測微塑料時不會對其產(chǎn)生干擾；(2)濾膜材質(zhì)的拉曼光譜平穩(wěn)，沒有明顯的可見基底峰，以保證樣品中微塑料的特征峰不會被濾膜基底峰遮蓋；(3)價格合適，便于獲得?，F(xiàn)有文獻基于拉曼光譜對飲用水中微塑料檢測的研究所使用的濾膜類型包括氧化鋁膜[16]、硝酸纖維素膜[20]、玻璃纖維素膜[12]、聚碳酸酯膜[21]、聚四氟乙烯濾膜[22]、鍍鋁聚碳酸酯膜[23]、鍍金聚碳酸酯膜[24]等。根據(jù)3個選擇條件，本研究選擇氧化鋁膜、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、不銹鋼濾膜進行后續(xù)的研究測試。

試驗操作步驟如下。(1)分別稱取0.001～0.005 g聚氯乙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚酰胺、纖維素、聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品，粒徑為10～50 μm。(2)將稱取的標(biāo)準(zhǔn)品加至5 L超純水中，充分混勻得到微塑料標(biāo)準(zhǔn)品溶液。(3)盛取100 mL微塑料標(biāo)準(zhǔn)品溶液使用一級抽濾裝置按照水樣處理過程進行抽濾，得到一級濾膜后將其放入干凈的燒杯中，加入消解液，消解處理后向燒杯中加入200 mL濾后超純水。(4)將燒杯放置于超聲波清洗器中振蕩20 min[19]，形成洗脫液，將洗脫液均分4份，每份50 mL，分別使用氧化鋁膜、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜和不銹鋼濾膜進行二級過濾。(5)使用共聚焦顯微拉曼儀對4種濾膜上的截留物質(zhì)進行定性定量分析。

1.2.2 消解條件測試

使用H2O2消解水樣中存在的天然有機物和其他會對微塑料檢測造成干擾的物質(zhì)，是目前飲用水中微塑料檢測時常用的處理方式，但時間、溫度、濃度方面多不統(tǒng)一。本團隊在前期研究中已經(jīng)對濃度為30%的H2O2在不同加熱時長下進行了消解測試[19]，結(jié)果顯示在40 ℃加熱消解24 h時效果最佳，但未對H2O2的濃度進行測試。本研究以節(jié)約時間成本、簡化試驗步驟為目標(biāo)，采集龍頭水6份，每份200 mL，經(jīng)一級過濾后在室溫下以不同濃度的H2O2進行24 h消解，探索最適的H2O2的消解濃度。消解液中H2O2濃度分別設(shè)定為0、10%、15%、20%、25%、30%。消解完成后繼續(xù)20 min超聲得到6份洗脫液，洗脫液經(jīng)過二級過濾后，將二級濾膜上機檢測。

1.2.3 拉曼檢測模式和參數(shù)

本研究使用的共聚焦顯微拉曼儀(Nicolet DXR3)檢測模式包括點掃描、面掃描和自動化面掃描(particle analysis模式)這3種模式。點掃描適用于數(shù)量較少的顆粒，掃描單個點。面掃描是掃描一個面，設(shè)置一個區(qū)域和步長，在這個區(qū)域內(nèi)機械生成等距的樣品點，對每個樣品點進行逐一掃描。該模式下如果設(shè)置較小步長，則檢測時間十分漫長可達數(shù)百小時；若設(shè)置較大步長，兩點之間間隔較大，會造成樣品點的遺漏。自動化面掃描(particle analysis模式)是首先生成白光圖，根據(jù)窗口顯示的白光圖像，可以設(shè)定軟件自動確定背景強度或手動調(diào)節(jié)背景強度，調(diào)節(jié)合適的背景強度可以更好地突出空白背景與樣品的差異。另外，還可以設(shè)置粒徑范圍，程序會自動根據(jù)參數(shù)設(shè)定對樣品區(qū)域進行布點和采集。相比而言，自動化面掃描更精確，可同時生成定性和定量分析的報告，時間上也具有較大優(yōu)勢，因此，本研究在上機檢測時采用自動化面掃描的方式。

共聚焦顯微拉曼儀主要參數(shù)設(shè)置：532 nm激光器，拉曼位移為50～3 550 cm-1，50×短距物鏡，1 mW能量，激光光斑尺寸為0.7 μm，光柵為900 lines/mm，曝光時間為2 s，累計次數(shù)為5次。

1.2.4 定性定量方法

Pivokonsky等的研究中均采用了以局部估計總體的方式對微塑料的豐度進行定量分析以降低檢測時間成本，采集的局部區(qū)域有扇形區(qū)域、五點區(qū)域(圓心及濾膜中部各方位四點)、三點區(qū)域(濾膜圓心、邊緣、圓心與邊緣之間)等[10,15,25]。本研究在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，微塑料存在于過濾區(qū)域邊緣聚集的現(xiàn)象，為避免因邊緣聚集現(xiàn)象造成對微塑料數(shù)量估計的偏差，選擇對三點取樣法進行定量估計。三點分布如圖2所示，每個矩形區(qū)域為一點，共3個點，面積之和約占整個待測面積的9.8%。根據(jù)式(1)估算水樣中微塑料的數(shù)量。

圖2 三點取樣法示意圖Fig.2 Schematic Diagram of Three-Points Sampling Method

(1)

其中：N總——整個待測面積上的微塑料總數(shù)，個；

Ni——每個點面積上的微塑料數(shù)量，個；

S總——總的待測面積，S總=15.9 mm2；

S點——每個點的面積，mm2。

對區(qū)域內(nèi)每一顆粒進行定量分析的同時，也逐一進行定性分析。定性方法是將顆粒的拉曼譜圖與OMNIC軟件中HR FT-Raman polymer library譜庫進行匹配，根據(jù)樣品的特征峰對聚合物的類型進行鑒別并生成相應(yīng)的匹配度，本試驗在當(dāng)前儀器參數(shù)的設(shè)置下，當(dāng)特征峰明顯且匹配度>60%時即認為是該聚合物類型。

1.3 質(zhì)量控制措施

微塑料存在廣泛，為減少背景干擾，本研究采用了如下質(zhì)控措施：試驗人員穿棉質(zhì)實驗服，佩戴丁腈手套，整個試驗在通風(fēng)櫥中進行，操作過程中避免使用塑料制品；試驗器具在使用前用濾后超純水(將超純水用2 μm孔徑不銹鋼濾膜進行過濾)沖洗3次，接觸過微塑料標(biāo)準(zhǔn)品的試驗器具先使用50%乙醇溶液清洗，再使用濾后超純水沖洗3次；樣品抽濾過程中在抽濾間隙使用不銹鋼蓋對漏斗進行遮蓋，避免空氣中微塑料進入，抽濾完成后的待測樣品存放于玻璃培養(yǎng)皿中；實際樣品操作過程中，對每批次樣品使用濾后超純水設(shè)置全程序空白，在實際樣品測定結(jié)果中進行扣除。

2 試驗結(jié)果與討論

2.1 抽濾方式和水樣體積選擇

本研究根據(jù)前期顯微紅外光譜法測定飲用水中微塑料的研究成果[26]，依然采用兩級過濾的方式。一級過濾使用孔徑為2 μm、直徑為47 mm的不銹鋼濾膜，目的是將水樣中所有待測物質(zhì)收集至濾膜上，以備后續(xù)對水樣中天然有機物和雜質(zhì)進行消解去除。一級過濾的濾膜經(jīng)過消解處理和20 min超聲洗脫后得到洗脫液，將洗脫液進行二級過濾，二級過濾目的是將經(jīng)消解得到的洗脫液中有效待測物質(zhì)收集至濾膜上，以備上機檢測。二級過濾過程中使用直徑為4.5 mm的不銹鋼漏斗，較小直徑的漏斗使得水樣中的待測物質(zhì)截留于較小的面積上，可節(jié)約后續(xù)上機檢測的時間成本，提高檢測效率。抽濾過程中水樣體積的選擇十分重要，應(yīng)確保待測物質(zhì)盡量不發(fā)生重疊覆蓋的現(xiàn)象。本研究以實驗室龍頭水為試驗對象，對比不同水樣體積(100～5 000 mL)的檢測效果，推薦的一級過濾水樣體積是200 mL。

2.2 二級過濾濾膜測試結(jié)果

4種濾膜顯微鏡下白光圖成像如圖3所示(物鏡50×，目鏡10×)。氧化鋁濾膜和硝酸纖維素濾膜表面平整光滑，與微塑料區(qū)分清晰，便于鏡下觀察和鑒別微塑料；玻璃纖維素濾膜表面有纖維狀突起，使用50×物鏡進行觀察時，無法對全部視野內(nèi)所有物質(zhì)進行統(tǒng)一聚焦，且較小粒徑的微塑料易與纖維混合而難以辨認；不銹鋼濾膜為編織制成，存在空隙，且白光圖下視野較暗，難以完成對微塑料的準(zhǔn)確辨認和識別。

圖3 4種濾膜白光圖Fig.3 White Light Diagram of Four Kinds of Filters

本研究分別對4種濾膜基底成分進行拉曼光譜掃描，譜圖如圖4所示。氧化鋁濾膜拉曼光譜平穩(wěn)，無明顯基底峰，不會對微塑料鑒別帶來干擾，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品檢測測試，所有標(biāo)準(zhǔn)品均可檢出且特征峰清晰可認。玻璃纖維素濾膜和不銹鋼濾膜拉曼光譜較平穩(wěn)，有較小干擾峰，對標(biāo)準(zhǔn)品的檢測影響較小，基本可準(zhǔn)確鑒別微塑料標(biāo)準(zhǔn)品的類型。硝酸纖維素濾膜的拉曼光譜存在較大基底峰，微塑料標(biāo)準(zhǔn)品檢測過程中，這些基底峰對微塑料種類的鑒別產(chǎn)生干擾，影響微塑料類型的辨認，當(dāng)微塑料粒徑較小時這種干擾尤為明顯，甚至導(dǎo)致種類辨認錯誤或無法鑒別。

綜上，選擇氧化鋁濾膜作為二級濾膜，圖5為氧化鋁濾膜上各微塑料標(biāo)準(zhǔn)品拉曼譜圖。氧化鋁濾膜上的微塑料可以清晰辨認，且其基底的拉曼光譜十分平穩(wěn)，不會對微塑料的特征峰造成任何干擾。

圖4 4種濾膜基底拉曼光譜Fig.4 Raman Spectra of Four Filters Membrane Substrates

圖5 微塑料標(biāo)準(zhǔn)品拉曼譜圖Fig.5 Raman Spectra of Microplastics Standards

2.3 消解結(jié)果

每張濾膜采集尺寸為400 μm×400 μm，位于濾膜中心。按匹配度為60%，計算消解液中不同H2O2濃度(0、10%、15%、20%、25%、30%)下微塑料檢出數(shù)量占所有檢測顆粒數(shù)量的比例。比例越高說明有效檢測越多，消解效果越好，水樣中存在的微塑料被準(zhǔn)確檢出的可能性越大。不同消解條件下微塑料檢測結(jié)果如圖6所示。H2O2濃度為20%時，檢出微塑料占全部檢測物質(zhì)的0.31%，比例最高，說明在該濃度下消解充分且適宜。H2O2濃度為0時，占比<0.01%，由于存在大量的天然有機質(zhì)，其會遮蓋在待測微塑料上，造成微塑料難以檢出。10%、15%濃度下，微塑料檢出比較低，說明消解不徹底，微塑料表面仍可殘留雜質(zhì)覆蓋而影響鑒別。25%、30%濃度下，占比<0.01%，由于水樣中存在的微塑料經(jīng)消解后其譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫相比匹配度較低，當(dāng)設(shè)定匹配度最低限為60%時難以將其辨認為微塑料，說明過量的H2O2會使微塑料消解過度而增加鑒別難度。

圖6 不同消解條件下微塑料檢測結(jié)果Fig.6 Microplastics Detection Results under Different Digestion Conditions

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精確度

為使得水樣中微塑料濃度可準(zhǔn)確區(qū)分為低、中、高濃度組，且保證組內(nèi)加標(biāo)量均一，粒徑為10 μm的微塑料顆粒是具有代表性且可準(zhǔn)確計數(shù)和添加的最佳選擇。因此，本研究以直徑為10 μm的球形聚苯乙烯(PS)為試驗對象，將其加至200 mL飲用水中，模擬實際水樣按照研究中確定的試驗條件進行分析檢測。試驗條件：采用一級過濾、消解、洗脫、二級過濾的前處理方式；使用20% H2O2進行消解；二級過濾使用氧化鋁濾膜；最后經(jīng)三點取樣法進行定性定量分析。檢測結(jié)果只計入10 μm的聚苯乙烯微球，不計入飲用水本底中存在的聚苯乙烯，以避免影響結(jié)果準(zhǔn)確性。按照低、中、高濃度分為3組，每一組中6個樣品的加標(biāo)量為顯微鏡下準(zhǔn)確計數(shù)后添加，計數(shù)6次，誤差范圍為10個以內(nèi)，最終以6個樣品均數(shù)計為該組的加標(biāo)量，結(jié)果如表1所示。本方法回收率為75.64%～121.53%，低濃度組相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為22.65%，中濃度組RSD為14.74%，高濃度組RSD為11.21%。

表1 準(zhǔn)確度和精密度分析結(jié)果Tab.1 Accuracy and Precision Analysis Results

3 小結(jié)與展望

本研究探索建立了基于拉曼光譜檢測飲用水中微塑料的方法，采用一級過濾、消解、洗脫、二級過濾的前處理方式，濃度為20%的H2O2消解效果最佳，氧化鋁濾膜作為二級過濾濾膜上機最適宜。經(jīng)三點取樣法定量分析，方法的回收率為75.64%～121.53%，低濃度組RSD為22.65%，中濃度組RSD為14.74%，高濃度組RSD為11.21%。本方法操作便捷、回收率較高、時間成本適宜，可適用于檢測生活飲用水中的微塑料。

顯微拉曼儀進行檢測時，在保證檢測到較小粒徑微塑料的情況下，需要較大的時間成本，因此，采用三點取樣法進行定量分析。這在一定程度上會對微塑料的數(shù)量造成高估或低估，更精確更優(yōu)化的方法還亟待研究。