劉 鑫 岑妍慧,2 李 森 何 爽 黃 慧
提高雌鼠受孕率方法的研究進(jìn)展
劉 鑫1岑妍慧1,2李 森1何 爽1黃 慧1
(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530200;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023)
實(shí)驗(yàn)鼠是科學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用范圍最廣、應(yīng)用數(shù)量最多的實(shí)驗(yàn)動物,也是生命科學(xué)研究中最重要的研究對象,生命科學(xué)的發(fā)展與進(jìn)步離不開實(shí)驗(yàn)動物學(xué)的發(fā)展,為了提高實(shí)驗(yàn)研究的準(zhǔn)確性、科學(xué)性以及統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,科學(xué)實(shí)驗(yàn)中往往需要用到大量的實(shí)驗(yàn)動物模型,所以,如何有效地提高雌鼠的受孕率以擴(kuò)大種群數(shù)量、推進(jìn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展、提高實(shí)驗(yàn)效率,成為了科學(xué)研究中的重要問題。文章通過查閱數(shù)據(jù)庫中相關(guān)文獻(xiàn)記載,對影響雌鼠受孕率的因素,以及有助于提高雌鼠受孕率的方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。
雌鼠;受孕率;動情周期
生命科學(xué)的研究及發(fā)展和實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)密不可分,而實(shí)驗(yàn)鼠是實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用范圍最廣、應(yīng)用數(shù)量最多的動物。實(shí)驗(yàn)鼠在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、畜牧獸醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)學(xué)、化工學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域的研究中都起到了非常重要的作用。由于實(shí)驗(yàn)鼠經(jīng)濟(jì)效益高、容易獲得、易于飼養(yǎng)、成活率高、個(gè)體差異小、可操作性強(qiáng)、繁殖傳代能力強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、遺傳背景明確、基因序列和人類相似度高,以及生理結(jié)構(gòu)和病理轉(zhuǎn)歸與人類類似等優(yōu)點(diǎn)[1-3],實(shí)驗(yàn)鼠成為了科學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用面最廣、應(yīng)用數(shù)量最多的實(shí)驗(yàn)動物。許多實(shí)驗(yàn)都需要以大量的實(shí)驗(yàn)鼠模型作為研究對象,或者實(shí)驗(yàn)過程中具有令實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行受孕或者傳代的要求,所以雌鼠的受孕率成為了影響實(shí)驗(yàn)效率和實(shí)驗(yàn)進(jìn)展的重要因素。所以實(shí)驗(yàn)鼠的飼養(yǎng)管理以及繁育技術(shù)越來越受到重視。本綜述主要從雌鼠性周期動情期的把握、雌雄配比的選擇、初次交配日齡及合籠天數(shù)、胎間隔和交配間隔、外界環(huán)境因素、社會心理學(xué)因素以及營養(yǎng)水平等方面對可以有效提高雌鼠受孕率的相關(guān)方法進(jìn)行論述。
在正常情況下, 雌鼠每隔4 d~5 d為一個(gè)性周期,發(fā)情后2 h~3 h即可排卵,在雌鼠排卵期間進(jìn)行成功交配最有利于精卵結(jié)合完成受孕。因此鑒定并且把握實(shí)驗(yàn)鼠的動情期是提高雌鼠受孕率的關(guān)鍵。目前實(shí)際實(shí)驗(yàn)中常用到的確定雌鼠動情周期的檢測方法有:宮頸粘液結(jié)晶法、陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢察法、角化細(xì)胞計(jì)數(shù)法[4,5]、外陰直接觀察法等。值得一提的是,在以往研究[5]中發(fā)現(xiàn),在宮頸粘液結(jié)晶法中,動情前期結(jié)晶為云霧狀,動情期為典型的羊齒狀,動情后期為金魚草狀,動情間期為橢圓體或者菱形物;用陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢察法進(jìn)行觀察,若涂片上有大量角化上皮細(xì)胞和少量有核上皮細(xì)胞,細(xì)胞分散未成團(tuán)成堆, 即可確認(rèn)為動情期雌鼠[6,7]。在角化細(xì)胞計(jì)數(shù)法中,用低倍鏡進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,若無核角化細(xì)胞占據(jù)160個(gè)即80%以上,則可認(rèn)定雌鼠處于動情期排卵后。宮頸粘液結(jié)晶法和陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢察法在檢查過程中并沒有完全客觀的標(biāo)準(zhǔn),可能會出現(xiàn)假陽性的情況,而角化細(xì)胞計(jì)數(shù)法與前兩者相結(jié)合可以增加檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。但是因?yàn)檫@些檢測方法操作相對復(fù)雜,耗費(fèi)一定的時(shí)間和人力物力,所以在大多數(shù)的交配實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用并不廣泛。相對而言,雖然外陰直接觀察法在觀察過程中存在主觀性和不確定性,在一定程度上會影響觀察結(jié)果的完全客觀性和準(zhǔn)確性,但是該類方法可操作性強(qiáng),簡便易行,直觀經(jīng)濟(jì),所以適合廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中。研究發(fā)現(xiàn),在交配前檢查雌鼠的陰道狀態(tài),若雌鼠的陰道口打開,外陰微腫,顏色呈粉紅色,且陰道內(nèi)有黏液分泌物,則為動情前期;若陰道口開大,外陰腫脹,陰道口開大,呈灰白色,陰道干燥,則為動情期,此期進(jìn)行交配成功率極高;若外陰腫脹不明顯或回復(fù)正常,陰道口緊閉,陰道內(nèi)由粘液變?yōu)橐籂?,則為動情后期;若外陰無明顯變化,略微濕潤,陰道口緊閉,則為動情間期。實(shí)驗(yàn)過程中,可以通過及時(shí)在動情周期完成實(shí)驗(yàn)鼠交配或者人工誘導(dǎo)雌鼠進(jìn)入動情周期并完成交配的辦法,來提高雌鼠的受孕率。
在雌鼠與雄鼠進(jìn)行合籠交配前,確定合適的雌雄配比,不但可以提高雌鼠的受孕率,還可以對鼠資源進(jìn)行合理利用。在探討不同雌雄配比下對大、小鼠的受孕率的實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)Wistar大鼠雌雄配比為1∶1、2∶1、3∶1時(shí),其平均受孕率分別為19%、15.8%、9%;當(dāng)ICR小鼠雌雄配比為1∶1、2∶1、3∶2時(shí),其受孕率分別為72.34%、60.71%、35.94%。兩組研究均得出了雌雄配比為1∶1時(shí),雌鼠受孕率最高的結(jié)論[8,9]。在生殖毒理實(shí)驗(yàn)中較常使用的雌雄配比一般為2∶1或者1∶1[10]。在美國的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序中規(guī)定,動物的雌雄配比為1∶1[11],Wilson Jame Graves則認(rèn)為雌雄配比可以是2∶1或者3∶2[12]。而也有研究顯示,在實(shí)驗(yàn)小鼠的繁育實(shí)驗(yàn)中,在不影響小鼠的遺傳質(zhì)量控制的情況下,2∶1的雌雄配比是優(yōu)于1∶1的[13]。由此可見,如果在短時(shí)間內(nèi)孕鼠需求量大且實(shí)驗(yàn)鼠來源充足的情況下,采用受孕率最高的1∶1雌雄配比進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)較為合適;若在實(shí)驗(yàn)期限允許的條件下,選用2∶1的雌雄配比進(jìn)行交配即可,這樣既符合保證了生殖毒理實(shí)驗(yàn)的需要,又節(jié)省了實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)動物資源,更符合“3R”原則[14],這也是目前實(shí)驗(yàn)室中較為普遍運(yùn)用的實(shí)驗(yàn)鼠交配雌雄配比。
實(shí)驗(yàn)鼠的日齡、性成熟程度以及生理機(jī)能是影響雌鼠受孕率的重要因素。研究表明,實(shí)驗(yàn)鼠的初次交配日齡及合籠天數(shù)會在一定程度上影響雌鼠的受孕率。不同品系的實(shí)驗(yàn)鼠性成熟的日齡有所不同,所以其最佳初配日齡也略有差異。在不同初次交配日齡對小鼠繁殖性能的研究中發(fā)現(xiàn),NIH小鼠在70~85日齡進(jìn)行初次交配繁殖性能較好,雌鼠受孕率較高[15];昆明小鼠則是在75~90日齡進(jìn)行交配繁殖性能較好,雌鼠受孕率較高[16]。不同品系的實(shí)驗(yàn)鼠的性成熟期和繁殖適齡存在差異,而且動物的性成熟期往往較動物的繁殖適齡要早[17],即初次交配日齡若相對較小,會出現(xiàn)由于雌鼠與雄鼠雖然性成熟,但是實(shí)驗(yàn)鼠的其他生理機(jī)能尚未發(fā)育完全,導(dǎo)致雌鼠受孕率降低的情況。所以要根據(jù)實(shí)驗(yàn)鼠的品系和繁殖適齡確定其最佳初次交配日齡范圍。且7~8月齡后繁育能力可能會下降,應(yīng)及時(shí)常規(guī)替換8月齡實(shí)驗(yàn)鼠。
除此之外,延長合籠時(shí)間法也是實(shí)驗(yàn)中常應(yīng)用的提高雌鼠受孕率的方法[18]。有實(shí)驗(yàn)研究表明,雌鼠合籠天數(shù)和受孕率成正相關(guān),即合籠天數(shù)越多,雌鼠受孕率也越高[19,20]。從動物飼養(yǎng)的角度來考慮,有可能是因?yàn)樾凼髸绊懘剖蟮脑兄芷?,誘使其進(jìn)入動情期,從而有助于提高了雌鼠受孕率。
雌鼠的胎間隔時(shí)間以及雄鼠的交配間隔時(shí)間是影響雌鼠受孕率的重要因素。在以昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)對象的研究中發(fā)現(xiàn),胎間隔時(shí)間大于102d的雌鼠與交配間隔時(shí)間大于60d的雄鼠進(jìn)行交配,其受孕率相比于沒有時(shí)間間隔的雌雄鼠顯著下降;胎間隔時(shí)間大于102d的雌鼠或者交配間隔時(shí)間大于60d的雄鼠,分別與無間隔的雄鼠、雌鼠進(jìn)行交配后,其受孕率相比于沒有時(shí)間間隔的雌雄鼠亦有顯著下降。雌鼠胎間隔和雄鼠交配間隔越長,可能對實(shí)驗(yàn)鼠的影響越大[21]。因此,胎間隔時(shí)間過長的雌鼠或交配間隔時(shí)間過長的雄鼠的生育能力低下,直接或間接導(dǎo)致雌鼠受孕率下降。還有研究表明,昆明小鼠的胎間隔時(shí)間在繁殖6~7胎后增加[22],此時(shí)應(yīng)及時(shí)更換種鼠。所以在生殖毒理實(shí)驗(yàn)或者有雌鼠受孕要求的實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)盡量避免使用胎間隔時(shí)間過長的雌鼠或交配間隔時(shí)間過長的雄鼠。
實(shí)驗(yàn)鼠生存環(huán)境中的多種因素會對其生殖性能產(chǎn)生一定影響。實(shí)驗(yàn)室中用來飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)鼠的墊料種類繁多,歐美等發(fā)達(dá)國家的實(shí)驗(yàn)室動物多使用商品化的標(biāo)準(zhǔn)墊料,而我國實(shí)驗(yàn)室動物所使用的墊料則多是如刨花、鋸末、玉米等木制品加工的下腳料。在探討松木刨花,楓木刨花、紙皮和稻草4種墊料對NIH小鼠繁殖性能及仔鼠生長發(fā)育的影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),這4種墊料中松木刨花墊料對NIH小鼠的生長發(fā)育、繁殖性能指標(biāo)有一定影響[23]。
光照會對雌鼠的動情周期以及生長發(fā)育造成很大影響,從而影響雌鼠生理及生殖功能。不同的光照時(shí)間、光照波長以及色溫都會對實(shí)驗(yàn)鼠的生理及生殖功能造成影響。有研究表明,光照可以促進(jìn)雌鼠性激素的分泌,對雌鼠性周期產(chǎn)生一定影響[24,25]。實(shí)驗(yàn)鼠動情周期與光線波長有關(guān),光照的照度、光線的波長以及明暗交替時(shí)間都對影響到雌鼠的生長生殖和發(fā)育。有實(shí)驗(yàn)表明,長光照通過刺激垂體—性腺軸的活動,引起內(nèi)分泌活動的改變,從而使實(shí)驗(yàn)鼠的生長發(fā)育和生殖功能增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)室中通常通過人工調(diào)控光照,模擬自然日照,所以實(shí)驗(yàn)室里通常采用12 h∶12 h明暗光照,如果每天維持14 h的光照,可以較好地促進(jìn)雌鼠的繁殖能力,從而提高受孕率。
環(huán)境溫度會影響實(shí)驗(yàn)動物的繁殖能力,溫度過高或者過低都會降低實(shí)驗(yàn)動物鼠的受胎率,而且高溫會影響卵子受精以及受精卵的著床。除此之外,也有研究表明,在適宜條件下,雌鼠在夏季的受孕率高于其在春季的受孕率,所以選擇夏季作為繁殖季節(jié)也可以有效地提高雌鼠的受孕率[18]。
噪音會在很大程度上干擾人和動物的生理以及心理狀態(tài),并且為此帶來負(fù)面?zhèn)?。國家?biāo)準(zhǔn)(GB l4925-2010)《實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境及設(shè)施》規(guī)定,噪聲不得超過60 dB,超出該范圍將會對實(shí)驗(yàn)動物的生殖能力產(chǎn)生影響[25]。
有研究標(biāo)明低濕度可以降低雌鼠的受孕率[26]。所以實(shí)驗(yàn)室里通常采用12 h∶12 h明暗光照;恒溫18℃~25℃,相對濕度40%~60%,噪音≤60分貝的相對穩(wěn)定環(huán)境對實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行飼養(yǎng)和繁殖。
柯立芝效應(yīng)又稱為庫利奇效應(yīng),是指雄性動物交配之后又立即與新配偶交配的現(xiàn)象[27]。大多數(shù)哺乳動物在交配之后的一段時(shí)間內(nèi),即使原有的配偶就在身邊,也不再有性行為。這個(gè)階段稱為性不應(yīng)期。其長短因動物的種類和周圍環(huán)境而異,如果在雄性動物交配之后,重新給它安排一個(gè)新雌性發(fā)情對象,它的性不應(yīng)期則會大大縮短,甚至立即又出現(xiàn)交配行為??铝⒅バ?yīng)在雄鼠中普遍存在。雄鼠容易產(chǎn)生性疲勞[28], 從而不利于雌鼠成功受孕,所以當(dāng)雌雄鼠合籠一段時(shí)間,雌鼠仍未受孕,應(yīng)及時(shí)更換雌鼠配偶,以提高雌鼠的受孕率。
有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),ICR小鼠在進(jìn)行社會隔離飼養(yǎng)后,其動情前期和動情期延長,動情后期和動情間期幾乎不發(fā)生改變,動情周期整體延長,從該實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以推斷,社會隔離延長雌鼠的動情前期和動情期,相當(dāng)于延長其排卵時(shí)間,從而可以提高受孕率,這或許是對隔離應(yīng)激的一種適應(yīng)性反應(yīng)[29,30]。由此可見,對雌鼠進(jìn)行低群體密度飼養(yǎng),或許可以提高種群的受孕率。
實(shí)驗(yàn)鼠的生長、發(fā)育、繁殖以及健康的生理狀態(tài)離不開營養(yǎng)物質(zhì)的支持,營養(yǎng)物質(zhì)的攝入水平可直接影響性激素的產(chǎn)生。營養(yǎng)水平低下會使雌鼠生殖功能降低;營養(yǎng)水平過高會使雌鼠過肥,進(jìn)而影響其發(fā)情,而公鼠過肥,其生殖機(jī)能也會受到一定程度的影響,進(jìn)而雌鼠與雄鼠交配困難,同樣也會影雌鼠的受孕率。因此維持正常且適宜水平的蛋白質(zhì)、維生素以及礦物質(zhì)攝入,對提高雌鼠的受孕率具有重要的意義。
為高效、穩(wěn)定、大量地獲取實(shí)驗(yàn)鼠種群數(shù)量,使用人為的藥物手段對雌鼠進(jìn)行超數(shù)排卵操作是科學(xué)實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)動物繁育中常用的技術(shù)手段。超數(shù)排卵,簡稱“超排”,顧名思義,這是一種利用外源性促性腺激素誘發(fā)卵巢的多個(gè)卵泡發(fā)育,從而獲得更多胚胎的方法。目前科學(xué)實(shí)驗(yàn)中超數(shù)排卵常用到的促性腺激素通常是孕馬血清促性腺激素(PMSG)與人絨毛膜促性腺激素(hCG)。有研究表明,孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)的使用劑量組合、注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)的時(shí)間間隔、給藥雌鼠周齡以及超數(shù)排卵雌鼠所處發(fā)情周期階段等都會對雌鼠超數(shù)排卵的結(jié)果產(chǎn)生影響[31,32]。并且,注射 10 IU 的孕馬血清促性腺激素(PMSG)和 10 IU 人絨毛膜促性腺激素(hCG)的劑量組合獲得受精卵最多,即雌鼠受孕率最高,效果最好;注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)的時(shí)間間隔為48 h時(shí)促排卵效果最好;不同品系的實(shí)驗(yàn)鼠,其最佳的促排卵周齡不同,周齡過小或者周齡過大均會導(dǎo)致卵母細(xì)胞變少、卵母細(xì)胞異常受精率增高,從而導(dǎo)致雌鼠受孕率下降。在國外的實(shí)驗(yàn)室,一般采用3~6周齡的雌鼠進(jìn)行超數(shù)排卵;處于不同動情周期的雌鼠也會產(chǎn)生不同的超數(shù)排卵的效果,而超數(shù)排卵效果最好的動情周期是雌鼠的動情初期和動情間期,發(fā)情初期和發(fā)情間期的卵母細(xì)胞獲得數(shù)量和卵母細(xì)胞受精率明顯高于動情期和動情后期。除此之外,雌鼠的體重也在一定程度上影響著超數(shù)排卵的效果,體重過輕或者過重都會對雌鼠的超數(shù)排卵產(chǎn)生不利影響,而體重和雌鼠的周齡、營養(yǎng)水平和飼養(yǎng)條件密切相關(guān),通常在適宜的營養(yǎng)供給狀態(tài)和飼養(yǎng)條件的基礎(chǔ)下,雌鼠4周齡左右時(shí)的體重能達(dá)到最好的超數(shù)排卵效果[31-33]。
在各種實(shí)驗(yàn)動物種群中,實(shí)驗(yàn)鼠由于管理飼養(yǎng)方便、可操作性強(qiáng)、妊娠周期短、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn),在各類實(shí)驗(yàn)研究中被廣泛使用。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)鼠繁殖培育工作或者動物實(shí)驗(yàn)的過程中,雌鼠的受孕率直接或間接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)進(jìn)度、實(shí)驗(yàn)效率和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,在雌雄鼠交配繁殖實(shí)驗(yàn)中,要善于利用內(nèi)在以及外在有利因素、規(guī)避不利因素。在實(shí)驗(yàn)過程中,可以通過誘導(dǎo)雌鼠進(jìn)入動情周期或直接選擇處于動情周期的雌鼠完成交配實(shí)驗(yàn);采用實(shí)驗(yàn)條件下最適用的雌雄配比;選擇適宜日齡的雌雄鼠進(jìn)行交配繁殖;適當(dāng)延長合籠天數(shù)并且避免使用胎間隔時(shí)間過長的雌鼠和交配間隔時(shí)間過長的雄鼠;飼養(yǎng)過程使用材質(zhì)安全、對實(shí)驗(yàn)鼠繁殖性能影響較小的墊料;保證實(shí)驗(yàn)鼠生活環(huán)境的溫濕度、光照、噪音等條件溫和且適宜;飼養(yǎng)過程中保證適宜的營養(yǎng)供給;及時(shí)更換雌鼠配偶、低種群密度飼養(yǎng)雌鼠等方法,達(dá)到提高雌鼠受孕率的目的,進(jìn)而有效保證充足的實(shí)驗(yàn)鼠來源以及穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)進(jìn)度和效率。本綜述通過總結(jié)和探討提高雌鼠受孕率的方法,為歸納實(shí)驗(yàn)鼠的生長生殖性能的影響因素、探索實(shí)驗(yàn)鼠繁殖培育方式以及環(huán)境調(diào)控手段提供了新的理論依據(jù),也為哺乳動物的飼養(yǎng)、繁育提供新了的思路和方法。
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Research Progress on Methods for Improving Pregnancy Rate in Female Rat
Laboratory rats are the experimental animals with the widest range and the largest number of applications in scientific experiments, as well as the most important research objects in life science research. The development and progress of the life sciences are inseparable from the development of laboratory zoology. In order to improve the accuracy, scientificity and statistical significance of experimental research, a large number of experimental animal models are often used in scientific experiments. Therefore, how to effectively improve the pregnancy rate of female rats to expand the population, promote experimental progress, and improve experimental efficiency has become an important issue in scientific research. This paper reviews the research progress of methods to improve the pregnancy rate of female mice by referring to relevant literature records in the database and combining with empirical rules in the laboratory.
female rat; pregnancy rate; estrous cycle
Q953
A
1008-1151(2022)12-0076-04
2022-09-06
廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2020GXNSFAA259011,2019JJA140246);廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目(2021KY0291);廣西一流學(xué)科建設(shè)開放課題(2019XK137);廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室子項(xiàng)目(GXZYKF2019-5,GXZYKF-201708);2020年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(202010600018);廣西中醫(yī)藥大學(xué)校級科研項(xiàng)目(2019MS001);廣西一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目重點(diǎn)課題(2018XK023,2018XK024)。
劉鑫(1993-),女,河北石家莊人,廣西中醫(yī)藥大學(xué)在讀碩士研究生,研究方向?yàn)橹胁菟幏乐蜗嚓P(guān)疾病。
岑妍慧(1980-),女,廣西北海人,廣西中醫(yī)藥大學(xué)教授,研究方向?yàn)橹胁菟幏乐蜗嚓P(guān)疾病。