柏為娟，馬超，巫榮華，劉炎，劉梅***

(1江蘇省鹽城市中心血站血液檢測(cè)中心，鹽城 224005；2南通大學(xué)教育部/江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心)

中樞神經(jīng)損傷修復(fù)是長(zhǎng)期未能解決的醫(yī)學(xué)難題，如何提高損傷后神經(jīng)再生能力一直是神經(jīng)再生研究領(lǐng)域中最受關(guān)注的熱點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)哺乳動(dòng)物成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元損傷后軸突不能再生，但發(fā)育中的神經(jīng)元，或某些成體的周圍神經(jīng)的損傷軸突卻是可再生的。這種再生能力的差異被認(rèn)為與內(nèi)在再生能力和外部抑制因素有關(guān)[1]。

神經(jīng)元是一個(gè)極性細(xì)胞，細(xì)胞突起結(jié)構(gòu)維持和遠(yuǎn)距離軸漿運(yùn)輸都依賴于微管骨架網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)神經(jīng)損傷軸突斷裂后，軸突順行、逆行運(yùn)輸中斷，遠(yuǎn)端軸突潰變，近端軸突回縮。當(dāng)中樞神經(jīng)軸突損傷后，由于微管網(wǎng)絡(luò)排列紊亂，近端軸突往往形成一個(gè)回縮球；而周圍神經(jīng)軸突損傷后，軸膜封閉頂端的細(xì)胞骨架卻可以動(dòng)態(tài)重構(gòu)為一個(gè)活躍的生長(zhǎng)錐[2]。生長(zhǎng)錐的形成是受精細(xì)調(diào)控的微絲和微管有序重構(gòu)的過(guò)程，發(fā)育過(guò)程中主要包括微絲介導(dǎo)的突起起始、膨大及隨后微管介導(dǎo)的突起固化和延伸。但對(duì)于損傷后的軸突而言，該過(guò)程更加復(fù)雜，生長(zhǎng)錐重構(gòu)的前提是要阻止損傷后微管的逆行坍塌，隨后還需要微管骨架的重新活化，才能實(shí)現(xiàn)突起的重新形成和延伸。因此對(duì)于損傷軸突而言，微管的動(dòng)態(tài)重構(gòu)能力顯得尤為重要。研究[3]表明，周圍神經(jīng)損傷后的軸突內(nèi)存在組蛋白脫乙酰酶5，可調(diào)節(jié)損傷軸突頂端的微管動(dòng)態(tài)變化，使穩(wěn)定的乙?；⒐苋ヒ阴；黾硬环€(wěn)定性，促進(jìn)軸突再生。然而在脊髓損傷后，有研究[4-5]采用微管穩(wěn)定劑Taxol 或Epothilone B 穩(wěn)定了逆行塌陷的微管，在損傷軸突頂端發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)錐樣的結(jié)構(gòu)，再生能力得到改善。這些結(jié)果提示在中樞和周圍神經(jīng)、以及不同發(fā)育階段的神經(jīng)元中微管骨架的動(dòng)態(tài)調(diào)控可能存在差異，且這種調(diào)控對(duì)損傷軸突再生能力有重要影響。

目前認(rèn)為影響微管骨架穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)改變的因素主要包括：微管相關(guān)蛋白(microtubule associated proteins,MAPs)，如tau、MAP2 等，可結(jié)合在微管網(wǎng)格上抑制微管解聚[6-7]；微管的翻譯后修飾，常見(jiàn)使微管穩(wěn)定的乙酰化、去酪氨酸化、多聚谷氨?；龋€有使微管動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定的酪氨酸化等[8]；微管切割蛋白，是一類以AAA 為特征的酶，可切斷長(zhǎng)微管產(chǎn)生短微管，增加動(dòng)態(tài)性；馬達(dá)蛋白Kinesin 和Dynein 等，它們以微管為軌道進(jìn)行軸漿運(yùn)輸或通過(guò)在滑行的微管間產(chǎn)生力的作用，對(duì)微管骨架的組織起調(diào)節(jié)作用[9-10]。這些對(duì)微管骨架動(dòng)態(tài)性產(chǎn)生調(diào)控作用的微管調(diào)控蛋白在神經(jīng)元獨(dú)特的細(xì)胞骨架系統(tǒng)穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[11]。

因此，本研究旨在檢測(cè)周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)發(fā)育和損傷后酪氨酸化、去酪氨酸修飾的微管蛋白表達(dá)水平是否存在差異，為理解微管骨架動(dòng)態(tài)重構(gòu)能力與神經(jīng)再生之間可能存在的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，本研究方案經(jīng)南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(S20200330-005)。

1.2 海馬神經(jīng)元和背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元培養(yǎng) 孕18 d SD 大鼠常規(guī)麻醉消毒處理。超凈臺(tái)里取出胎鼠，在體視顯微鏡下，解剖取出海馬區(qū)和DRG 備用。按照課題組之前的研究方法[12]分離、純化神經(jīng)元。過(guò)400 目篩網(wǎng)后，計(jì)數(shù)按照操作研究植入經(jīng)Poly-L-Lysin 包被的皿中，4～6 h 后換Neurobasal 神經(jīng)元培養(yǎng)基，16～18 h 后加入阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞增殖。

1.3 模型建立

1.3.1 大鼠脊髓挫傷模型的制備 動(dòng)物隨機(jī)分組，行大鼠脊髓挫傷。用復(fù)合麻醉劑(3 mg/kg)腹腔注射麻醉，在背側(cè)后部作正中縱行切口，鈍性分離至胸椎T9～T11椎骨棘突，剝離周圍肌肉、筋膜，清潔手術(shù)視野。用眼科剪打開(kāi)T9～T11中的一節(jié)椎板，使用脊髓損傷儀，用160 N 力打擊脊髓，形成中等脊髓損傷模型。局部使用青霉素后逐層關(guān)閉切口。術(shù)后腹腔注射青霉素3 d，4 萬(wàn)U/(d·只-1)，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代養(yǎng)。假手術(shù)組，直接暴露T9段脊髓后縫合皮膚。

1.3.2 大鼠坐骨神經(jīng)夾傷模型的制備 動(dòng)物隨機(jī)分組，行大鼠坐骨神經(jīng)夾傷術(shù)。使用復(fù)合麻醉劑腹腔注射麻醉，暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)，在平行股骨處夾傷坐骨神經(jīng)10 s×3 次，然后縫合皮膚。假手術(shù)組，直接暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)后縫合皮膚。

1.4 Western Blot 分別取脊髓T9段上下1 cm 組織和坐骨神經(jīng)中間段約1 cm 組織。加蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)(1∶100)混合液，冰上裂解5～10 min，勻漿。4 ℃條件，13 000 g 離心15 min。小心吸取上清液置于另一離心管中，并測(cè)定蛋白濃度，樣品加6×上樣緩沖液煮沸5 min，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取等量蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)，經(jīng)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉。一抗(α-tubulin 1∶1 000 Abcam 公司,ab18251;tyr-tubulin 1∶1 000 Abcam 公司,ab6160;detyr-tubulin 1∶1 000 Abcam 公司,ab24622)4 ℃過(guò)夜；二抗孵育；電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)顯色，X-光片壓膜，掃描，ImageJ 分析。

1.5 活細(xì)胞攝像 原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元和DRG 神經(jīng)元至第2 天，加入阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞，純化神經(jīng)元；待皿底長(zhǎng)滿后消化重新接種細(xì)胞至活細(xì)胞專用培養(yǎng)皿中，貼壁培養(yǎng)2 h 后，活細(xì)胞工作站連續(xù)拍攝10 h，5 min 記錄1 次。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，統(tǒng)計(jì)神經(jīng)元n=5，計(jì)算軸突生長(zhǎng)速率。采用ImageJ Manual Tracking插件對(duì)細(xì)胞胞體的運(yùn)動(dòng)速率進(jìn)行測(cè)量。

1.6 免疫細(xì)胞熒光 移除細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入200 μL 固定液室溫固定30 min，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)室溫洗滌，封閉，一抗(α-tubulin 1∶1 000 Abcam 公司,ab18251;tyr-tubulin 1∶1 000 Abcam 公司,ab6160;detyr-tubulin 1∶1 000 Abcam 公司,ab24622) 4 ℃過(guò)夜。次日，室溫復(fù)溫20 min，PBS 輕輕洗滌，二抗避光條件下室溫孵育后，加入Hoechst 33342(5 μg/mL)，室溫孵育15 min，PBS 輕輕洗滌，熒光封片劑封片保存于暗盒內(nèi)。Leica和蔡司熒光顯微鏡拍攝。使用Image Pro Plus 軟件分析并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism5 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Student's t 檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)系數(shù)分析統(tǒng)計(jì)分析定位，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元和DRG 神經(jīng)元體外培養(yǎng)過(guò)程中酪氨酸化、去酪氨酸化微管蛋白表達(dá)和定位 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，酪氨酸化修飾微管在DRG 神經(jīng)元種植后1、3 d 的平均熒光強(qiáng)度分別為1.79±0.18、2.14±0.07。在海馬神經(jīng)元中分別為1.16±0.044，0.88±0.03。酪氨酸化修飾微管在DRG 神經(jīng)元種植后1、3 d比海馬神經(jīng)元分別升高50%、120%(圖1A～B)。去酪氨酸化修飾微管在DRG 神經(jīng)元種植后1、3 d 的平均熒光強(qiáng)度分別為1.49±0.07、1.69±0.08。在海馬神經(jīng)元中分別為1.07±0.05、1.78±0.20。去酪氨酸化修飾微管在DRG 神經(jīng)元種植后1 d 比海馬神經(jīng)元升高40%，3 d 時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C～D)。上述結(jié)果顯示在神經(jīng)元體外發(fā)育中，DRG 神經(jīng)元中酪氨酸化和去酪氨酸化微管蛋白均維持較高水平，而海馬神經(jīng)元中去酪氨酸化微管蛋白表達(dá)有升高，但酪氨酸化微管蛋白表達(dá)較低。

圖1 海馬神經(jīng)元和DRG 神經(jīng)元體外發(fā)育中酪氨酸化、去酪氨酸化微管蛋白表達(dá)和定位

在海馬神經(jīng)元軸突頂端有典型的生長(zhǎng)錐形態(tài)，酪氨酸化和去酪氨酸化微管蛋白增強(qiáng)較為明顯；而DRG 神經(jīng)元的生長(zhǎng)錐較小，在胞體和突起均有較高表達(dá)，表明周圍系統(tǒng)神經(jīng)元中微管蛋白的酪氨酸化水平較高。

2.2 DRG 神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元?jiǎng)潅蠹?xì)胞胞體及軸突生長(zhǎng)情況比較 海馬神經(jīng)元和DRG 神經(jīng)元貼壁培養(yǎng)，采用玻璃電極針進(jìn)行神經(jīng)元?jiǎng)潅?圖2A)，結(jié)果顯示，神經(jīng)元軸突劃傷后，在0～20 h 期間，海馬神經(jīng)元和DRG 神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)速率分別為(3.77±0.47) μm/h 和(2.99±0.20) μm/h，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖2B)；同時(shí)采用ImageJ Manual Tracking 插件測(cè)量細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率，結(jié)果表明：在0～20 h 期間，DRG 神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)速率為(5.72±0.54) μm/h，顯著高于海馬神經(jīng)元(2.00±0.28) μm/h(P＜0.05)(圖2C～E)。

圖2 DRG 神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元?jiǎng)潅蠹?xì)胞胞體及軸突生長(zhǎng)情況比較

2.3 脊髓和DRG 在發(fā)育過(guò)程中酪氨酸化、去酪氨酸化微管蛋白表達(dá) Western Blot 結(jié)果顯示，與出生后1 d(標(biāo)化為1)相比，3、7、14 d 坐骨神經(jīng)組織中酪氨酸化微管蛋白的表達(dá)水平較高，分別為1.36±0.08、1.75±0.01、1.60±0.06；而脊髓組織發(fā)育過(guò)程中，1、3、7、14 d 酪氨酸化微管蛋白的表達(dá)水平分別為2.07±0.07、1.52±0.09、1.20±0.08、0.91±0.04，呈明顯下降的趨勢(shì)(圖3A～B)。與出生后1 d(標(biāo)化為1)相比，3、7、14 d 坐骨神經(jīng)組織中去酪氨酸化微管蛋白的表達(dá)水平分別為0.71±0.12、0.79±0.13、0.87±0.08；而脊髓組織發(fā)育過(guò)程中，1、3、7、14 d 去酪氨酸化微管蛋白的表達(dá)水平分別為0.68±0.08、0.66±0.05、0.71±0.08、0.77±0.09；差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A、C)。

圖3 坐骨神經(jīng)和脊髓發(fā)育過(guò)程中酪氨酸化、去酪氨酸化修飾微管蛋白的表達(dá)比較

2.4 脊髓和坐骨神經(jīng)損傷過(guò)程中酪氨酸化、去酪氨酸化微管蛋白表達(dá) 由于在發(fā)育過(guò)程中酪氨酸化、去酪氨酸化修飾微管蛋白差異表達(dá)，考慮在損傷后是否也存在著差異。對(duì)成年SD 大鼠進(jìn)行坐骨神經(jīng)夾傷及脊髓挫傷手術(shù)，提取坐骨神經(jīng)和脊髓蛋白進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)夾傷和脊髓損傷后去酪氨酸化微管蛋白均有顯著升高(圖4A)。將Normal 標(biāo)化為1，在坐骨神經(jīng)夾傷后3、7 d 表達(dá)水平分別為1.48±0.08、1.60±0.13；而在脊髓挫傷后3、7 d表達(dá)水平分別為0.59±0.04、0.63±0.09(圖4B～C)。以上結(jié)果顯示，與脊髓在損傷后酪氨酸化微管蛋白表達(dá)相比，周圍神經(jīng)在損傷后酪氨酸化微管蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。

圖4 坐骨神經(jīng)夾傷和脊髓損傷后酪氨酸化、去酪氨酸化修飾微管蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

微管是細(xì)胞骨架中的一種重要組成成分，微管是由α/β-tubulin 亞基組成，微管發(fā)揮功能往往要經(jīng)過(guò)翻譯后修飾，因此微管蛋白的翻譯后修飾是微管動(dòng)態(tài)性調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)。其中酪氨酸化、去酪氨酸修飾是迄今研究最多的微管蛋白翻譯后修飾形式[13]。細(xì)胞中絕大多數(shù)的α-tubulin 末端有一個(gè)酪氨酸化修飾殘基，所以在細(xì)胞中游離的微管蛋白及新添加到微管正端的微管蛋白多是酪氨酸化修飾的。去酪氨酸化修飾則是對(duì)α-tubulin 蛋白發(fā)生的第1 個(gè)特異性修飾，甚至可以發(fā)生在α/β-tubulin 異二聚體形成之前。有報(bào)道[14]去酪氨酸化是由一類胞質(zhì)羧肽酶負(fù)責(zé)完成的，不僅可以穩(wěn)定微管蛋白，而且還能抵抗低溫解聚和Nocodazole 的解聚作用，而微管蛋白酪氨酸連接酶在去酪氨酸化修飾后可以迅速添加1 個(gè)酪氨酸殘基修飾，完成去酪氨酸化/酪氨酸化循環(huán)。因此酪氨酸化修飾的tubulin 則很不穩(wěn)定，常被作為動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定微管的標(biāo)志物[15]。如果在去酪氨酸化后，αtubulin 的倒數(shù)第2 個(gè)C-末端尾上谷氨酸殘基也被移走(Δ2-tubulin 修飾)，就會(huì)阻止C 末端重新加上酪氨酸，這種修飾的微管非常穩(wěn)定，且富集于中樞神經(jīng)軸突微管[16]。所以推測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中穩(wěn)定微管含量較多，不能通過(guò)動(dòng)態(tài)重構(gòu)完成穩(wěn)定/不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)換，但目前文獻(xiàn)中尚缺少直接的研究數(shù)據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是周圍神經(jīng)系統(tǒng)還是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元在軸突生長(zhǎng)過(guò)程中，去酪氨酸化修飾的微管蛋白都具有較高水平表達(dá)，且軸突損傷后再生速率差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在胚胎期的中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元都具有較強(qiáng)的軸突再生能力。然而周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元具有較強(qiáng)的動(dòng)態(tài)調(diào)整微管骨架能力，不僅表現(xiàn)為其有高水平的不穩(wěn)定微管修飾，還表現(xiàn)為DRG 神經(jīng)元胞體有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性，可以觀察到明顯的胞體遷移，這與海馬神經(jīng)元胞體基本不發(fā)生位移有顯著不同。文獻(xiàn)[17]報(bào)道大部分微管在中心體處成核之后釋放出胞體，但仍然有部分微管連接中心體，這在細(xì)胞的遷移過(guò)程中發(fā)揮很重要的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DRG 神經(jīng)元中高水平的酪氨酸化修飾微管，也支持其在胞體位移中發(fā)揮重要作用。因此，本研究較為系統(tǒng)地分析了周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷再生過(guò)程中微管骨架動(dòng)態(tài)重構(gòu)能力的差異，從一個(gè)新的角度闡明了周圍神經(jīng)具有較強(qiáng)再生能力，同時(shí)也為促進(jìn)軸突再生提供了新的靶點(diǎn)。