姚新轉(zhuǎn) 張寶會(huì) 陳湖芳 呂立堂

摘要：油菜素類固醇（BRs）是必不可少的植物激素，在植物的生長(zhǎng)、繁殖以及逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。為了驗(yàn)證該基因的功能，本文構(gòu)建了植物遺傳表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法遺傳轉(zhuǎn)化矮牽牛，獲得29 株轉(zhuǎn)基因植株;轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)為節(jié)間縮短，分枝增多，生長(zhǎng)后期表現(xiàn)出葉片延遲衰老;葉綠素含量、可溶性總糖含量、酶活明顯高于野生型， MDA 含量明顯低于野生型;BAS1基因在矮牽牛中的超表達(dá)可以提高矮牽牛植株中衰老相關(guān)基因的表達(dá)，從而延緩了轉(zhuǎn)基因矮牽牛的衰老。因此，BAS1可用作調(diào)控植物花衰老和延長(zhǎng)花壽命的潛在候選基因。

關(guān)鍵詞：BAS1基因;矮牽牛;抗氧化酶活性;相關(guān)基因表達(dá);衰老

中圖分類號(hào)：Q812

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2022）02-0038-006

國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.02.006

BAS1基因編碼具有羥化酶活性的細(xì)胞色素P450單加氧酶，該酶催化油菜素固醇（BR）C-26的羥基羥化作用，導(dǎo)致BR生理活性的降低或喪失[1]。作為成年植物，BR突變體基本上表現(xiàn)出缺少紅光受體phyB突變體的相反表型。 BR突變體是深綠色，生長(zhǎng)緩慢，葉片萎縮且莖短小。另外，BAS1突變體表現(xiàn)出延遲衰老[2]。過(guò)表達(dá)BAS1的轉(zhuǎn)基因植物顯著降低BR含量，從而導(dǎo)致葉片萎縮，葉片深綠和莖短[3-4]。BAS1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的葉片衰老與煙草植物中細(xì)胞分裂素過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的表型非常相似。

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPT）催化細(xì)胞分裂素合成的限速步驟。 Gan等[5]研究表明，通過(guò)精確控制IPT表達(dá)來(lái)引發(fā)特定的發(fā)育反應(yīng)。SAG12啟動(dòng)子僅在衰老開(kāi)始時(shí)才激活I(lǐng)PT表達(dá)，這種激活導(dǎo)致衰老過(guò)程的抑制[5-6]。通過(guò)IPT表達(dá)抑制葉片衰老導(dǎo)致衰老特異性啟動(dòng)子的減弱[7]，從而防止了細(xì)胞分裂素的過(guò)量產(chǎn)生，干擾了發(fā)育的其他方面[8]。在SAG12-IPT煙草中，葉片的衰老得到了有效控制，而沒(méi)有其他發(fā)育異常[9]。隨后，該方法成功用于水稻[10]、花椰菜[11]、矮牽牛[12]和生菜[13]。

姚新轉(zhuǎn)等[14]使用衰老特異性SAG12啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)煙草中BAS1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)SAG12-BAS1基因植物和野生型植物的生長(zhǎng)相似。然而，轉(zhuǎn)基因煙草葉片顯示出延遲衰老的特性，主要表現(xiàn)為植物葉片呈深綠色、葉綠素含量增加、保護(hù)酶活性增加、細(xì)胞分裂素含量增加、葉片綠色滯留時(shí)間延長(zhǎng)和延遲的衰老[14]。本研究構(gòu)建了植物遺傳表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法遺傳轉(zhuǎn)化矮牽牛衰老延遲，為研究園藝植物奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

矮牽牛植物均在貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所的溫室中生長(zhǎng)。PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口的分析純化學(xué)品。

1.2矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植物鑒定

利用葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化[15]。經(jīng)GUS組織化學(xué)染色和PCR鑒定，獲得轉(zhuǎn)BAS1基因矮牽牛，轉(zhuǎn)BAS1基因矮牽牛出現(xiàn)三種表型（如圖2，按葉片性狀分為表型1：TP28;表型2：TP40;表型3：TP41），本試驗(yàn)選擇具有相似表型的野生型WT和轉(zhuǎn)基因植物表型1用于隨后的試驗(yàn)。

1.3生理指標(biāo)的測(cè)定

利用分光光度法（721可見(jiàn)分光光度計(jì)）測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD），過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性和丙二醛（MDA）、葉綠素、可溶性糖含量。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）。

1.4矮牽牛葉片相關(guān)基因表達(dá)分析

總RNA提取，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)成cDNA。使用ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）進(jìn)行定量RT-PCR。通過(guò)使用QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒（目錄號(hào)208054;Qiagen，德國(guó)）進(jìn)行熒光定量分析，按照2-△△CT法計(jì)算和分析基因的表達(dá)水平。每個(gè)試驗(yàn)3次重復(fù)，引物序列見(jiàn)表1。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2017軟件（Microsoft，Redmond，USA）和SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。

2結(jié)果與分析

2.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株獲得

在植株 3～5葉期對(duì)野生型矮牽牛和抗性矮牽牛的葉片進(jìn)行 GUS 組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示野生型矮牽牛植株未檢測(cè)到 GUS 活性，抗性矮牽牛植株中檢測(cè)到了 GUS 活性（圖1-a）。分別提取野生型矮牽牛和 GUS 組織化學(xué)染色陽(yáng)性矮牽牛植株的 DNA，以BAS1基因引物進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，在野生型矮牽牛植株中未擴(kuò)增出目的條帶，而轉(zhuǎn)基因植株中獲得了預(yù)期的 419 bp 的目的條帶。證明外源BAS1基因已成功整合到矮牽?；蚪M中（圖1-b）。

2.2 矮牽牛植物表型以及BAS1基因的表達(dá)分析

野生型和轉(zhuǎn)基因矮牽牛在相同條件下生長(zhǎng)，觀察到轉(zhuǎn)基因矮牽牛有三種表型（圖2-a）。轉(zhuǎn)基因植物表型1和野生型表型相似（本試驗(yàn)選擇表型1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，包括TP12，TP28和TP38）。與野生型（WT）植物相比，SAG12-BAS1轉(zhuǎn)基因植物（表型2和表型3）表現(xiàn)出較矮小，生長(zhǎng)緩慢，較深的綠葉和延遲衰老。表型3顯示最深的綠葉。表型2和表型3中的啟動(dòng)子可能未受到嚴(yán)格控制，類似于轉(zhuǎn)基因植物中的IPT過(guò)表達(dá)表型（圖2-a）。圖2-b顯示了三種轉(zhuǎn)基因植物中BAS1基因表達(dá)的分析。在表型1和表型2植物中BAS1基因的表達(dá)相似，而在表型3中BAS1基因的表達(dá)更高（圖2-b）。

2.3 SAG12-BAS1轉(zhuǎn)基因矮牽牛的葉和花衰老

SAG12-BAS1轉(zhuǎn)基因矮牽牛的開(kāi)花時(shí)間為11 d，而野生矮牽牛的開(kāi)花時(shí)間僅為5 d（圖3-a）。生長(zhǎng)70 d后，帶有轉(zhuǎn)基因SAG12-BAS1基因的植物被深綠色的葉子完全覆蓋，而野生矮牽牛的葉子為黃色，沒(méi)有新的葉子生長(zhǎng)。105 d后，WT矮牽牛植物的葉中央部分明顯發(fā)黃，而轉(zhuǎn)基因植物不明顯（圖3-b）。WT矮牽牛幾乎死了，只有幾片黃色的葉子，而轉(zhuǎn)基因矮牽牛正常的生長(zhǎng)和發(fā)育。因此，與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的衰老被延遲了超過(guò)10～15 d。與野生矮牽牛相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛具有更多的分支，更短的莖和更多的花。

2.4轉(zhuǎn)SAG12-BASA1基因?qū)Π珷颗Ｉ碇笜?biāo)的影響

轉(zhuǎn)基因矮牽牛的葉綠素和可溶性糖含量（平均值）分別比野生型高42.89%和116.8%（圖4）（P<0.05）。轉(zhuǎn)基因矮牽牛的SOD，POD和CAT活性（平均值）分別比野生矮牽牛高82.74%，131.8%和135%。轉(zhuǎn)基因矮牽牛的MDA含量（平均值）比野生矮牽牛的MDA含量低46%（圖5）。因此，在轉(zhuǎn)基因植物中保護(hù)酶的活性得到增強(qiáng)，提高了活性氧清除和防止膜脂質(zhì)過(guò)氧化以及減少M(fèi)DA積累。SAG12-BAS1基因的表達(dá)增強(qiáng)了矮牽牛植物的抗氧化能力，從而降低了植物膜被破壞的程度，同時(shí)提高了植物的抗逆性。

2.5 轉(zhuǎn)基因株系BAS1基因表達(dá)及相關(guān)基因的表達(dá)

BAS1基因在矮牽牛中表達(dá)以及相關(guān)基因表達(dá)如圖6所示。結(jié)果表明，與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素 PhARR2基因和細(xì)胞分裂素受體組氨酸蛋白激酶 PhHK的平均表達(dá)量分別顯著增加了2.35倍和2.41倍。與野生型植物相比，矮牽牛 PhGA2ox1和PhGA2ox3的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因植物中更顯著（分別為11倍和3倍）（P<0.01）。與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因植物中的生長(zhǎng)素應(yīng)答因子 PhARF4基因表達(dá)水平降低了0.74倍。

3結(jié)論與討論

植物衰老是一個(gè)受基因調(diào)控的高度復(fù)雜和有序的過(guò)程，具有多層次、多途徑的特點(diǎn)，葉片衰老是植物衰老的主要表現(xiàn)形式[16-18]。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因矮牽牛延長(zhǎng)了10～15 d，同時(shí)，影響葉片的衰老信號(hào)和保護(hù)酶SOD、POD和CAT的活性，與野生矮牽牛相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛葉片中的SOD，POD和CAT活性都提高了。在植物衰老期間，SAG12-BAS1基因的表達(dá)提高了植物中保護(hù)酶的活性并增強(qiáng)了除氧活性。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛的MDA含量低46%，表明轉(zhuǎn)基因矮牽牛的細(xì)胞膜未受到破壞。此外，轉(zhuǎn)基因矮牽牛葉中的葉綠素和可溶性糖含量高于野生型植物。

擬南芥應(yīng)答調(diào)節(jié)器（ARR）基因家族的A型成員的過(guò)表達(dá)可以產(chǎn)生負(fù)作用調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素途徑[19]。在本研究中，PhARR2在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)增加比野生植物提高了2.35倍，表明ARR2正調(diào)控細(xì)胞分裂素的水平。細(xì)胞分裂素受體組氨酸激酶AHK2，AHK3和CREI/AHK4/WOODEN LEG（WOL）與細(xì)胞分裂素結(jié)合并自磷酸化[20]。隨后經(jīng)過(guò)其他過(guò)程進(jìn)入細(xì)胞核并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到一系列ARR中調(diào)節(jié)下游細(xì)胞分裂素的反應(yīng)，并產(chǎn)生了一系列調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的生化作用[21]。試驗(yàn)結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛中PhAHK的平均表達(dá)高2.41倍。 GA2ox表達(dá)降低內(nèi)源GA3濃度不僅導(dǎo)致植物矮化，而且改變了種子休眠時(shí)間和葉綠素濃度[22]。結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛中PhGA2ox1和PhGA2ox3的平均表達(dá)分別增加了11倍和3倍。在這項(xiàng)研究中，與野生型矮牽牛植物相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛中的PhARF4基因表達(dá)被下調(diào)，這表明ARF轉(zhuǎn)錄因子抑制了植物生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

總之，研究表明，在正常狀態(tài)下生長(zhǎng)的SAG12-BAS1轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出一系列表型變化，包括花蕾數(shù)增加，分支和節(jié)間長(zhǎng)度增加，開(kāi)花延遲，保護(hù)酶活性增加以及BAS1相關(guān)基因的表達(dá)變化，衰老相關(guān)基因的調(diào)控可能會(huì)增加細(xì)胞分裂，降低乙烯含量，并延緩矮牽牛的衰老。但是，作用機(jī)理仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Turk E M，F(xiàn)ujioka S，Seto H，et al.CYP72B1 inactivates brassinosteroid hormones：an intersection between photomorphogenesis and plant steroid signal transduction[J].Plant Physiology，2003，133（4）：1643-1653.

[2]Chory J.Light modulation of vegetative development[J].The Plant Cell，1997，9（7）：1225-123.

[3]鄒冰杰，呂立堂，趙德剛.超量表達(dá)擬南芥油菜素內(nèi)酯基因 BAS1 對(duì)煙草維管組織發(fā)育的影響[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016，35（6）：1487-1492

[4]章家長(zhǎng)，孫振遠(yuǎn)，李召虎，等.轉(zhuǎn) P（SAG12）-ipt基因結(jié)縷草的獲得及其衰老特性分析[J].自然科學(xué)進(jìn)展，2005，7：818-823.

[5]Gan S，Amasino R M.Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin[J].Science，1995，270：1986-1988.

[6]鄧澤宜，宋想，洪艷，等.啟動(dòng)子在觀賞植物基因工程中的應(yīng)用綜述[J].園藝學(xué)報(bào)，2021，48（6）：1250-1264.

[7]Gan S，Amasino R M.Making sense of senescence.Molecular genetic regulation of leaf senescence[J].Plant Physiology，1997，113：313-319.

[8]Medford J I，Horgan R，El-sawi Z，et al.Alterations of endogenous cytokinins in transgenic plants using a chimeric isopentenyl transferase gene[J].The Plant Cell，1989，1：403-413.

[9] Jordi W，Schapendonk A，Davelaar E，et al.Increased cytokinin levels in transgenic P-SAG12-IPT tobacco plants have large direct and indirect effects on leaf senescence，photosynthesis and N partitioning[J].Plant Cell Environment，2000，23：279-289.

[10]付永彩，丁月云，劉新仿，等.制衰老的嵌合基因在水稻中的轉(zhuǎn)化 [J].科學(xué)通報(bào)，1998，43（18）：1963-1967.

[11]Nguyen K，Jordi W，Dun K V，et al.Delayed senescence in cauliflower transformed with an autoregulated isopentenyl transferase gene[J].International Journal of Plant Sciences，2008，169（3）：339-347.

[12]Clark D G，Dervinis C，Barrett J E，et al.Drought-induced leaf senescence and horticultural performance of transgenic PSAG12-ipt Petunia hybridas[J].Journal of the American Society for Horticultural Science，2004，129：93-99.

[13]Mccabe M S，Garratt L C，Schepers F，et al.Effects of p（sag12）-ipt gene expression on development and senescence in transgenic lettuce[J].Plant Physiology，2001，127（2）：505.

[14]姚新轉(zhuǎn)，呂立堂，趙德剛.轉(zhuǎn)PSAG12-BAS1基因抑制煙草葉片的衰老[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2016，24（12）：1831-1838.

[15]Horsch R B，F(xiàn)ry J E，Hoffmann N L，et al.A simple and general method for transferring genes into plants[J].Science，1985，227：1229-1231.

[16]褚曉潔，蘆濤，葉涵斐，等.水稻葉片衰老基因LPS1的克隆與功能研究[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2021，35（5）：427-438.

[17]高璐，黃瑞華，張盛春.擬南芥BLI基因調(diào)控植物衰老的研究[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2021，53（4）：49-54.

[18]李可昕，張超凡，劉佩冶，等.鮮黃花菜衰老機(jī)制與采后貯藏保鮮技術(shù)研究進(jìn)展[J/OL].食品科學(xué)：1-10[2021-08-31].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20210712.1737.008.html.

[19]Osakabe Y，Miyata S，Urao T，et al.Overexpression of arabidopsis response regulators，arr4/atrr1/ibc7 and arr8/atrr3，alters cytokinin responses differentially in the shoot and in callus formation[J].Biochemical & Biophysical Research Communications，2002，293（2）：806-815.

[20]Kuruma Y，Suzuki T，Ono S，et al.Functional analysis of membranous Fo-a subunit of F1Fo-ATP synthase by in vitro protein synthesis[J].Biochemical Journal，2012，442：631-638.

[21]劉長(zhǎng)洲，張停停，趙娟，等.細(xì)胞分裂素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（25）：12360-12362，12378.

[22]Gargul J，Mibus H，Serek M.Constitutive overexpression of Nicotiana GA2ox leads to compact phenotypes and delayed flowering in Kalancho blossfeldiana and Petunia hybrida[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，2013，115：407-418.

Over-Expression of the BAS1 Gene to Delay Senescence in Transgenic Petunia hybrida

Yao Xinzhuan1，Zhang Baohui1，Chen Hufang1，Lv Litang1，2*

（1.College of Tea Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education）/Institute of Agro-Bioengineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：Brassinosteroids （BRs） are essential hormones that play an important role in plant growth，reproduction and response to adversity.In order to verify the function of the gene，a plant genetic expression vector was constructed in this paper.Agrobacterium-mediated genetic transformation was used to genetically transform petunia to obtain 29 transgenic plants.The transgenic plants showed shortened internodes，increased branches，and obviously delayed leaf senescencein the late growth period.Transgenic petunia chlorophyll content，total soluble sugar content，and enzyme activity were significantly higher than wild-type，and MDA content of transgenic plants was significantly lower than wildtype.Overexpression of BAS1 gene in petunia can increase the expression of senescence-related genes in petunia plants，thereby prolonging the senescence of transgenic petunia.Therefore，BAS1 can be used as a potential candidate gene for regulating plant flower senescence and extending flower life.

Keywords： BAS1 gene;Petunia hybrida ;antioxidant enzyme activity;related gene expression;senescence

收稿日期：2021-05-06;

修回日期：2021-08-31

基金項(xiàng)目：貴州茶產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心（黔科中引第[2017] 4005）

通訊作者：呂立堂（1977—），男，博士，教授，主要從事茶樹(shù)生物學(xué)和基因工程方面的研究，E-mail：ltlv@gzu.edu.cn.

1857501705307