孫文娟 龍毅

摘要：通過比較不同黑骨藤提取物對淋巴細胞增殖抑制作用的影響，確定其提取物制備的最佳方法及有效成分的預(yù)測。采取不同比例水—醇混合物提取的方式，獲得6種不同的黑骨藤提取物，將這些提取物進行淋巴細胞增殖抑制試驗，確定最佳提取方法。檢測各提取物中杠柳苷系列化合物含量，以了解該指標是否與黑骨藤免疫抑制活性存在關(guān)系，明確杠柳苷系列化合物對黑骨藤免疫抑制活性的影響。結(jié)果表明，極性較小的提取體系更有利于獲得免疫抑制能力強的黑骨藤提取物，同時黑骨藤提取物的免疫抑制能力與其杠柳苷系列化合物的含量正相關(guān)。杠柳苷系列化合物很可能是黑骨藤的免疫抑制有效成分，有必要進一步研究其作為黑骨藤質(zhì)量鑒定指標的可能性。

關(guān)鍵詞：黑骨藤;提取;有效成分;杠柳苷

中圖分類號：R284.2

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2022）02-0088-005

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.02.014

黑骨藤是蘿藦科杠柳屬植物西南杠柳Periploca forrestii Schltr.的干燥根或全株，主要分布于我國西南地區(qū)[1]，是苗族常用藥材，收載于《中華本草苗藥卷》[2]。黑骨藤具有通經(jīng)活絡(luò)、活血和祛風除濕等功效，常用于治療風濕、類風濕、骨折、閉經(jīng)等病癥[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗風濕、鎮(zhèn)痛、強心及抗腫瘤等藥理活性[5-10]。民間多以煎煮或酒制的方式入藥，但何種炮制方法最為有效并未明確。黑骨藤的研究眾多，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍未明確。在眾多黑骨藤有效成分的相關(guān)研究工作中，F(xiàn)eng等[11]的一項研究引人注目。在這項研究中，四種孕甾糖苷從黑骨藤乙醇提取物中分離出來。后續(xù)的細胞試驗證明了這些孕甾糖苷對T淋巴細胞的增殖有抑制作用。事實上，這并非天然孕甾糖苷化合物的免疫抑制作用被首次證實。早在1987年，日本化學家便首次從杠柳中分離鑒定出了一類孕甾糖苷化合物——杠柳苷[12]，隨后的體內(nèi)外試驗就證明了這類化合物具有顯著的免疫抑制活性[13]，佐證了該中藥風濕癥的治療功效。之后，很多天然藥物研究者都將這類糖苷作為研究重點。黑骨藤中同樣含有杠柳苷[14]，黑骨藤與杠柳同為杠柳屬植物，且同為治療風濕免疫疾病的植物藥，杠柳苷是杠柳的有效活性成分，，很可能也是黑骨藤中的重要的免疫抑制成分。

本研究計劃采取不同比例水醇混合物提取的方式，獲得黑骨藤提取物，將這些提取物進行淋巴細胞增殖抑制試驗，確定最佳提取方法。其后，檢測各提取物中杠柳苷系列化合物含量，以了解該指標是否與黑骨藤免疫抑制活性存在關(guān)系，明確杠柳苷系列化合物對黑骨藤免疫抑制活性的影響。查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，黑骨藤中含有多種以杠柳苷元為母核的杠柳苷類化合物（如杠柳苷、periplogenin 3-O-β-D-dig、periplogenin 3-O-β-D-cym和periplogenin 3-O-β-D-glul（ 1→4）-O-β-D-dig）[15]，它們的主要區(qū)別在配糖位置上，為了全面了解這類杠柳苷系列化合物對黑骨藤免疫抑制作用的影響，本試驗計劃采用酸水解反應(yīng)使黑骨藤提取物中的糖苷水解，通過測定水解產(chǎn)物中杠柳苷元的含量，推測出杠柳苷系列化合物的總含量。現(xiàn)有的相關(guān)研究大多是以杠柳苷單獨作為檢測指標[14]，目前未見同時檢測黑骨藤中具有相同母核結(jié)構(gòu)的杠柳苷類化合物的方法。本研究計劃建立同時檢測黑骨藤中以杠柳苷元為母核的杠柳苷類化合物總含量的方法，以期為建立黑骨藤的質(zhì)量控制標準提供新的理論依據(jù)，為后期臨床應(yīng)用提供可靠的試驗參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器

EX225DZH電子天平，準確度等級I，奧豪斯儀器（常州）有限公司;高效液相色譜儀，型號Waters2690，美國Waters公司;醫(yī)用離心機，型號TDZ4-WS，湖南平凡科技有限公司;二氧化碳培養(yǎng)箱，型號3111，賽默飛世爾科技有限公司;FACS CantoII流式細胞儀，美國BD公司。

1.1.2試劑

杠柳苷元，成都普思特生物科技股份有限公司，質(zhì)量分數(shù)99.90%，批號PS010060;水為二次蒸餾水（自制）;磷酸緩沖鹽溶液（PBS），BI公司，批號2014012;RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco公司，批號8120279;胎牛血清（FBS），BI公司，批號2033119;CFSE，BD公司，批號9326177;二甲亞砜（DMSO），索萊寶公司。乙醇為分析純，乙腈、甲醇均為色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3藥材

黑骨藤購自貴陽太升中藥材名品特產(chǎn)市場，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學生藥學實驗室楊燁博士鑒定為蘿摩科植物西南杠柳Periploca forrestii Schltr.的全株切片。

1.1.4細胞株

人T淋巴細胞系H9，HTB-176，源自美國ATCC細胞庫。

1.2各黑骨藤提取物的制備

取黑骨藤藥材約250 g，粉碎，過80目藥典篩得藥材粉末。準確稱取黑骨藤粉末6份，每份25 g，置于500 mL燒杯中，分別加入水和5%、20%、40%、60%、75%的乙醇溶液450 mL，60 ℃超聲30 min提取2次，合并提取液。分別將6個不同比例提取液過濾后平均分成2份，一份用于水解，55 ℃濃縮至無醇;另一份提取液55 ℃濃縮成浸膏，留樣用于細胞試驗。

1.3HPLC檢測樣本制備

由于植物中的杠柳苷衍生物較多，主要區(qū)別在配糖位置上。為了完整了解以杠柳苷元為母核的杠柳苷類化合物對黑骨藤免疫抑制作用的影響，通過水解反應(yīng)將黑骨藤提取物中的糖苷水解，檢測水解液中的杠柳苷元含量。水解方法如下：分別將提取液濃縮至無醇，加入適量水定容至200 mL，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH=2，60 ℃水解3 h。水解完全后，分別用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，50 ℃濃縮成浸膏。將萃取濃縮浸膏共6份，分別用80%甲醇超聲溶解，定容至50 mL，取樣2 mL用于液相檢測。以杠柳苷元為對照，測量各水解餾分中指標成分的含量。

1.4細胞試驗樣本制備

將黑骨藤6份提取液濃縮浸膏用50%的DMSO水溶液溶解為1 mg/mL的樣本待測。

1.5人T淋巴細胞系H9培養(yǎng)及CFSE檢測

1.5.1細胞培養(yǎng)

人T淋巴細胞系H9培養(yǎng)液為含10% FBS的RPMI-1640，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

1.5.2CFSE溶液配制

將500 μg CFSE溶解于180 μL DMSO中，即得5 mmol/L的儲存液，于-20 ℃避光保存。使用時，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成5 μmol/L的工作液備用。

1.5.3CFSE染色及給藥

將培養(yǎng)瓶中的人T淋巴細胞系H9于1000 r/min離心10 min，用 PBS重懸洗滌2次，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×107個/mL。取1 mL上述細胞懸液中加入CFSE（終濃度為5 μmol/L ），37 ℃避光孵育8 min后，加入2 mL預(yù)冷的含40% FBS的PBS終止染色，1000 r/min離心5 min，用不含F(xiàn)BS的PBS洗滌2次。用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，計數(shù)，將細胞調(diào)整為1×106個/mL，加入6孔板，每孔1 mL細胞懸液，50 μL樣本，終體積為2 mL。試驗樣本分組如下：陰性對照組、水提取物組、5%、20%、40%、60%、75%乙醇提取物組。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育60 h后，收集細胞，用預(yù)冷PBS將細胞洗滌2次，再用1 mL PBS重懸細胞，采用流式細胞儀于FL1通道檢測，判斷各樣本對人T淋巴細胞系H9增殖的影響。

1.6各水乙醇混合體系黑骨藤提取物杠柳苷含量檢測

1.6.1色譜條件

流動相：乙腈-5%聚酰胺（27∶73）;檢測波長：220 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：35 ℃;進樣量：5 μL。色譜柱為Diamonsil C18色譜柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μmol/L）。

1.6.2對照品溶液的制備

精密稱取杠柳苷元對照品3.6 mg置于10 mL容量瓶中，加入80%甲醇超聲溶解，稀釋并定容為0.36 mg/mL的對照品溶液。

1.6.3供試品溶液的制備

制備方法見1.2。

2結(jié)果與分析

2.1各黑骨藤提取物淋巴細胞增殖抑制試驗

各黑骨藤提取物與H9淋巴細胞共孵育后，CFSE染色后流式細胞術(shù)檢測結(jié)果見圖1、圖2。

由上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，極性較小體系更有利于獲得免疫抑制能力強的黑骨藤提取物。水提物雖

然可以明顯抑制免疫細胞增殖，將總增殖細胞比例從94.2%降至71.1%，但在提取體系加入少許乙醇（5%）后，抑制效果更加明顯，第三代細胞的比例與水提取物相比降低了10.3%。當提取體系中的乙醇含量繼續(xù)增加到20%至40%后，第三代細胞的增殖幾乎完全被抑制，總增殖細胞降低到了40%左右。但繼續(xù)提高提取體系中的乙醇含量并不能顯著促進黑骨藤提取物的免疫抑制作用。

2.2各水—乙醇混合體系黑骨藤提取物杠柳苷系列化合物含量

由前述研究可知，水—乙醇混合提取體系有利于獲得免疫抑制能力強的黑骨藤提取物。但這些提取物之間仍然存在免疫抑制能力差距，為了了解這些提取物的免疫抑制作用是否與杠柳苷系列化合物含量存在聯(lián)系，本試驗使用HPLC方法檢測了各水—乙醇混合體系黑骨藤提取物酸水解后產(chǎn)物的杠柳苷元的含量（圖3和表1）。

從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，當提取體系中加入乙醇后，混合體系制備的提取物的酸水解產(chǎn)物中杠柳苷元含量更高，且該系列糖苷含量與提取體系中乙醇含量正相關(guān)。但當提取體系中的乙醇含量上升至40%后，繼續(xù)提高乙醇含量對黑骨藤提取物的酸水解產(chǎn)物中杠柳苷元含量的促進作用并不明顯。這一變化趨勢與這些提取物的免疫抑制能力趨勢基本相同。

3結(jié)論與討論

隨著對黑骨藤化學成分不斷深入的研究，大量化合物被分離出來，其中甾體類化合物的種類較多，主要分為強心苷類、植物甾醇和C-21甾類[15-18]。之前部分研究者對香加皮中強心苷類化合物杠柳苷的藥理作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有免疫抑制、強心和抗腫瘤等作用[19-22]，但對黑骨藤中杠柳苷的藥理作用研究鮮有報道。由于黑骨藤中與杠柳苷具有相同母核結(jié)構(gòu)的糖苷種類較多[15]，因此，為了了解這一類化合物在黑骨藤中的藥理作用，本試驗對不同黑骨藤提取物中這一類糖苷免疫抑制作用進行了整體的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，黑骨藤提取物中杠柳苷系列化合物含量與其免疫抑制活性正相關(guān)。而提取物中該系列糖苷含量又與提取體系的極性有關(guān)，降低該極性有利于提高黑骨藤提取物中杠柳苷系列化合物的含量。這可能是因為杠柳苷類化合物的苷元部分極性較低造成。但提取體系降低到一定程度后，繼續(xù)降低極性并不能進一步提高上述糖苷含量。這可能是因為糖苷分子中還具有極性較大的配糖結(jié)構(gòu)，這使得整個分子的極性折中，導致這類化合物在極性過低的溶劑中的溶解性并不好。因此，乙醇有利于提高黑骨藤的炮制效果，但乙醇的濃度含量到達40%左右后，上述杠柳苷類化合物含量已達峰值，故選擇濃度40%左右的乙醇溶液提取黑骨藤效果最佳。

本研究還發(fā)現(xiàn)，黑骨藤提取物對免疫細胞的增殖抑制主要發(fā)生在第三代細胞上，這可能是因為黑骨藤的治療通路較長。因此，臨床治療中，該藥物的治療周期可能較長。

本研究證實了極性較小的提取體系更有利于獲得免疫抑制能力強的黑骨藤提取物，同時黑骨藤提取物的免疫抑制能力與其杠柳苷系列化合物的含量正相關(guān)。杠柳苷系列化合物很可能是黑骨藤的免疫抑制有效成分，有必要進一步研究其作為黑骨藤質(zhì)量鑒定指標的可能性。

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Effects of Different Concentrations of Ethanol Solution on Extracts of Periploca forrestii Schltr.

Sun Wenjuan，Long Yi*

（College of Pharmacy，Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Ghuizhou 550025，China）

Abstract：By comparing the effects of different extracts of Periploca forrestii Schltr.on the inhibition of lymphocyte proliferation，the optimal method of extract preparation and the prediction of effective components were determined.In this study，six different extracts of P.forrestii were obtained，using different proportions of Hydro-alcoholic mixture，and these extracts were subjected to lymphocyte proliferation inhibition experiment to determine the best extraction method.Then，the content of periplocin series compounds in each extract was detected to find out whether the index was related to the immunosuppressive activity of P.forrestii，and to clarify the effect of periplocin series compounds on the immunosuppressive activity of P.forrestii.The results showed that the extraction system with less polarity was more conducive to obtain the extract with strong immunosuppressive ability.Meanwhile，the immunosuppressive ability of the extract was positively correlated with the content of periplocin series compounds.Aeries compounds of periplocin are likely to be the immunosuppressive active components of P.forrestii，which is necessary to further study the possibility of using them as quality identification indicators.

Keywords：Periploca forrestii Schltr.; extraction; active ingredients;periplocin

收稿日期：2021-06-18;

修回日期：2021-08-14

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81660710）

通訊作者：龍毅（1980—），男，博士，副教授，主要從事生物醫(yī)藥材料研究，E-mail：2933982231@qq.com.

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