王飛飛　王夏雯　金倩　張智慧　王澤平　田勝營　王信海

摘要： 采用高通量測序技術(shù)，利用16S rRNA序列信息，研究了不同養(yǎng)殖溫度條件下克氏原螯蝦腸道菌群的多樣性。測序結(jié)果顯示：15 ℃、19 ℃、23 ℃、27 ℃、31 ℃養(yǎng)殖水溫下，變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門為腸道主要菌門，叢毛單菌屬和鞘脂單胞菌屬為主要菌屬。養(yǎng)殖水溫不同，腸道優(yōu)勢菌群所占比例不同，叢毛單菌屬在水溫 15 ℃處理組占比最高，鞘脂單胞菌屬19 ℃處理組占比最高。Alpha多樣性分析結(jié)果顯示， 23 ℃處理組克氏原螯蝦腸道菌群Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著高于15 ℃、19 ℃、27 ℃處理組（P<0.05），23 ℃處理組檸檬酸桿菌和氣單胞菌豐度較高，是其特有菌屬，也是蝦類主要致病菌。試驗(yàn)結(jié)果初步顯示，溫度是影響克氏原螯蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)而導(dǎo)致病害發(fā)生的重要因素之一。

關(guān)鍵詞： 克氏原螯蝦;腸道菌群;溫度;高通量測序

中圖分類號： S966.12 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2022）01-0157-08

Abstract： Using high-throughput sequencing technology and 16S rRNA sequence information， the intestinal flora diversity of Procambarus clarkii under different temperatures was studied. The sequencing results showed that Proteobacteria， Bacteroidetes and Firmicutes were the dominant flora at the phylum level at 15 ℃，19 ℃，23 ℃， 27 ℃and 31 ℃， Curvibacter and Sphingomonas were the dominant genera at the genus level. The proportion of these dominant intestinal flora was different with different temperatures. Curvibacter had the largest proportion in 15 ℃ group，and Sphingomonas had the largest proportion in 19 ℃ group. Alpha diversity analysis results indicated that Simpson index and Shannon index in 23 ℃ group were significantly higher than those in 15 ℃， 19 ℃， 27 ℃ groups （P<0.05）. Particular bacteria in the 23 ℃ group were Aeromonas and Citrobacter， which were also the main pathogenic bacteria of shrimp. The above research results preliminarily explain the effects of temperature on the microbial community and disease outbreak of Procambarus clarkii.

Key words： Procambarus clarkii;gut microbiota;temperature;high-throughput sequencing

克氏原螯蝦 （Procambarus clarkii） ，屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）甲殼綱（Crustacea），俗稱小龍蝦，近年來已成為中國重要的養(yǎng)殖水產(chǎn)品。2018年中國克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積超過1.10×106 hm2，出口超過1.00×106 t[1]。養(yǎng)殖規(guī)模不斷提高的同時，病害問題也日益突出，導(dǎo)致養(yǎng)殖效益大幅下降，環(huán)境污染時有發(fā)生，克氏原螯蝦的質(zhì)量安全也受到較大的影響，產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展受到挑戰(zhàn)。研究結(jié)果表明細(xì)菌感染是導(dǎo)致克氏原螯蝦死亡的重要原因，腸道菌群與克氏原螯蝦健康息息相關(guān)，保持腸道菌群的動態(tài)平衡有助于抵抗病原體侵入，有效預(yù)防病害發(fā)生[2]。

水產(chǎn)品腸道菌群動態(tài)平衡與溫度有著密切的聯(lián)系。全紫嬌等[3]研究發(fā)現(xiàn)，隨著水溫的改變，刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)變化顯著。Liu等[4]研究發(fā)現(xiàn)秋季克氏原螯蝦腸道菌群多樣性和豐度高于夏季。有研究者認(rèn)為克氏原螯蝦病害集中爆發(fā)的“五月瘟”是由于水溫的變化引起克氏原螯蝦腸道菌群失衡而導(dǎo)致的[5]。養(yǎng)殖水溫與克氏原螯蝦腸道菌群多樣性之間有何聯(lián)系，水溫變化與克氏原螯蝦疾病爆發(fā)有何關(guān)聯(lián)，目前尚未見到相關(guān)報(bào)道，克氏原螯蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)與溫度關(guān)系缺乏系統(tǒng)性的研究。

本研究對不同溫度下克氏原螯蝦腸道細(xì)菌微生物16S rRNA基因序列進(jìn)行測定，以期找出養(yǎng)殖水溫與克氏原螯蝦腸道細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及多樣性之間的內(nèi)在聯(lián)系，明確易致病細(xì)菌菌群隨溫度變化規(guī)律，為克氏原螯蝦疾病預(yù)防提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)開始于2020年3月20日，克氏原螯蝦來自宿豫玲瓏水產(chǎn)公司養(yǎng)殖基地，捕撈后置于充氧水箱中，30 min內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，暫養(yǎng)7 d，水溫設(shè)置在15 ℃左右。然后從中選擇活力強(qiáng)、大小均勻的克氏原螯蝦用于試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)5個溫度梯度，依次為15 ℃、19 ℃、23 ℃、27 ℃、31 ℃，每組3次重復(fù)，試驗(yàn)水箱容量20 L，均裝有控溫電熱棒，箱內(nèi)放置10 cm 長的 PVC 管作為克氏原螯蝦躲避物，每個水箱放幼蝦15尾，規(guī)格為每尾1 g左右，共計(jì)225尾。水溫初始均為15 ℃，然后以0.5 ℃/h逐漸升溫至試驗(yàn)溫度。試驗(yàn)期間，每天吸污、換水各1次，換水量約為原水量的20%，換水溫度與試驗(yàn)溫度一致。養(yǎng)殖時間為21 d，其間，每天上午、下午各喂料1次，投喂量為蝦總質(zhì)量的3%～4%。

1.2 樣品制備

試驗(yàn)達(dá)到養(yǎng)殖天數(shù)后，停止喂料24 h，從每個水箱隨機(jī)取5只克氏原螯蝦，在無菌環(huán)境下，取出腸道內(nèi)容物并充分混合后，置于無菌離心管，作為一個樣品處理。共獲得樣品15個，每個樣品在處理完成后，立即放入準(zhǔn)備好的干冰盒中，送至鑫普華生物公司進(jìn)行處理及測序，處理方法參照文獻(xiàn)[6]中的方法進(jìn)行，16S rRNA測序在Illumina MiSeq PE300平臺完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序后，用Pandaseq軟件、PRINSEQ軟件、Usearch軟件分別進(jìn)行序列拼接、質(zhì)控處理及去除嵌合體，選擇Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

使用Excel 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。利用SPSS 18.0軟件分析數(shù)據(jù)，利用R語言制作相關(guān)圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下克氏原螯蝦腸道菌群測序結(jié)果

測序結(jié)果（表1）顯示，不同溫度處理組15個樣品共計(jì)獲得有效序列1 920 880條，平均128 058.6條，有效序列占比均超過80%，符合分析要求。為了保證分析結(jié)果合理，各樣品統(tǒng)一按照最低樣本數(shù)量（62 607）進(jìn)行分析，一致性97%以上的序列作為同一個分類操作單位OTU（Operational taxonomic units）處理，15個樣品共計(jì)聚類8 216個OTU。測序深度99.05%～99.46%，測序效果良好。Alpha多樣性分析結(jié)果（表2）顯示，31 ℃組中，Chao1指數(shù)顯著高于其他4組（P<0.05），Observed-sopecies指數(shù)顯著高于15 ℃、19 ℃、27 ℃處理組，表明溫度在31 ℃時克氏原螯蝦腸道菌群的豐富度比其他養(yǎng)殖溫度腸道菌群高，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)在23 ℃處理組顯著高于15 ℃、19 ℃、27 ℃處理組，表明該溫度下腸道菌群的多樣性比其他養(yǎng)殖溫度高。

2.2 不同養(yǎng)殖溫度下克氏原螯蝦腸道菌群組成分析

在門分類水平上，選取豐度靠前的20個物種進(jìn)行分析（圖1），發(fā)現(xiàn)變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（ Bacteroidetes） 和厚壁菌門（Firmicutes）是各溫度組克氏原螯蝦腸道的主要菌群。其中變形菌門占比均超過50%，在15 ℃、19 ℃處理組所占比例超過90%，在23 ℃處理組占比最低（52.6%）。擬桿菌門在27 ℃處理組占比例最大（5.6%），15 ℃處理組占比最低（0.9%）。厚壁菌門在23 ℃處理組占比例較大（8.7%），15 ℃處理組占比最?。?.1%）。

在屬分類水平上（圖2），叢毛單菌屬（Curvibacter）是15 ℃、27 ℃和31 ℃處理組的優(yōu)勢菌屬，不同溫度下各處理組所占比重差別較大，15 ℃處理組所占比例最大（68.2%），23 ℃處理組所占比例最少（3.1%）。鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）受溫度影響也較大，在15 ℃、19 ℃、31 ℃處理組占比較大，其中19 ℃處理組占比最大（36.8%）;在23 ℃、27 ℃處理組占比較小，其中23 ℃處理組占比最少（1.3%）。氣單胞菌屬（Aeromonas）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）在23 ℃處理組占比分別為11.2%、7.7%，在其他處理組別中占比較少。

物種熱圖更加直觀顯示不同樣品優(yōu)勢菌群之間的差異。由圖3可知，變形菌門是各組的優(yōu)勢菌群，23 ℃、27 ℃、31 ℃處理組主要菌群豐度較高。由圖4可知，在屬水平上，23 ℃處理組菌群結(jié)構(gòu)與其他組有較大差異，優(yōu)勢菌群不同于其他處理組。叢毛單菌屬、鞘脂單胞菌屬是15 ℃、19 ℃、27 ℃、31 ℃處理組優(yōu)勢菌群。

2.3 不同溫度下克氏原螯蝦腸道菌群相似性分析

根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果，構(gòu)建韋恩圖（圖5）。圖5直觀展示了各組OTU數(shù)目組成的特有性與相似性，5個樣品共有875個OTU，占總數(shù)8.5%。說明克氏原螯蝦腸道菌群受溫度影響較大，15～31 ℃獨(dú)有的OUT數(shù)量分別為212、374、617、225、915。31 ℃處理組獨(dú)有的OUT最多，說明31 ℃處理組克氏原螯蝦腸道菌群最復(fù)雜。

主坐標(biāo)分析結(jié)果（圖6）顯示，同一處理均落在相同區(qū)域，說明樣品具有較好的重復(fù)性;15 ℃、27 ℃處理組呈現(xiàn)區(qū)域性聚集，19 ℃、23 ℃、31 ℃處理組呈現(xiàn)區(qū)域性聚集，說明腸道菌群受溫度影響較大。

3 討論

3.1 溫度對克氏原螯蝦腸道菌群多樣性的影響

采用高通量測序技術(shù)對不同溫度條件下克氏原螯蝦腸道樣品進(jìn)行測序，5個樣品共獲得克氏原螯蝦腸道細(xì)菌菌群33門、60綱、140目、265科、955屬，測序深度達(dá)到99%以上，其結(jié)果可以有效反映出克氏原螯蝦腸道細(xì)菌菌群組成。水產(chǎn)品腸道微生物菌群多樣性受溫度影響較大，如吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）腸道菌群在水溫22 ℃和28 ℃時豐度顯著高于其他溫度[7]。Sha等[8]研究發(fā)現(xiàn)水溫為14 ℃時不同規(guī)格的養(yǎng)殖海參（Apostichopus japonicus）腸道組織中均檢測不到弧菌屬（Vibrio），而其他溫度下存在弧菌屬，說明養(yǎng)殖海參腸道內(nèi)弧菌菌群與養(yǎng)殖溫度息息相關(guān)。溫度也是影響水產(chǎn)品養(yǎng)殖水體生物菌群多樣性重要因素，如擬穴青蟹（Scylla paramamosain）養(yǎng)殖水溫過高或過低均會導(dǎo)致水體菌群豐度和多樣性顯著減小[9]。本研究結(jié)果顯示，蝦腸道菌群多樣性在23 ℃時最高，31 ℃時腸道菌群的豐富度最高。

3.2 基于門水平的不同溫度克氏原螯蝦菌群組成分析

由聚類分析結(jié)果可知，變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門是克氏原螯蝦腸道主要菌群。這與陳一鳴等[10]、Liu等[4]研究結(jié)果一致，但本研究中變形菌門占比較大，優(yōu)勢明顯，其余門類占比較小，推測可能與養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)。變形菌門是水產(chǎn)動物如大黃魚（Larimichthys crocea）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei ）等[11-13]腸道中的優(yōu)勢菌群。本研究結(jié)果顯示克氏原螯蝦腸道中變形菌門豐度隨著溫度升高表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，在23 ℃時菌群豐度最低。研究者認(rèn)為甲殼動物腸道變形菌門比例升高會增加爆發(fā)疾病的風(fēng)險，中華絨螯蟹、凡納濱對蝦等[14-15]感染白斑綜合征（WSSV）后變形菌門相對豐度會明顯上升，但陳一鳴等[10]研究發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦患病前后變形菌門相對豐度未見顯著變化。本試驗(yàn)養(yǎng)殖期間未發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦患病，因此不能推斷變形菌門豐度變化與克氏原螯蝦患病之間的聯(lián)系。研究結(jié)果表明擬桿菌門豐度與碳水化合物代謝呈正相關(guān)關(guān)系，厚壁菌門豐度與營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)呈正相關(guān)關(guān)系[16]，擬桿菌促進(jìn)能量代謝，厚壁菌促進(jìn)營養(yǎng)吸收。本研究中擬桿菌門和厚壁菌門豐度隨著溫度的升高先上升后下降。擬桿菌門和厚壁菌門豐度在23 ℃和27 ℃時較高，說明在23 ℃和27 ℃克氏原螯蝦吸收和代謝水平較其他溫度高。

3.3 基于屬水平的不同溫度克氏原螯蝦腸道菌群組成分析

根據(jù)聚類分析結(jié)果，不同溫度處理組樣品中均發(fā)現(xiàn)叢毛單菌屬和鞘脂單胞菌屬，但其豐度受溫度影響較大。研究發(fā)現(xiàn)叢毛單胞菌屬細(xì)菌豐度常與水體有機(jī)物濃度呈正相關(guān)，叢毛單菌屬大部分細(xì)菌可分解酚類物質(zhì)、硝基苯類化合物、銨態(tài)氮等物質(zhì)[17-18]，鞘脂單胞菌屬細(xì)菌常被用來降解有機(jī)污染物[19]。彭輝輝等[20]研究發(fā)現(xiàn)常規(guī)稻田水體叢毛單菌屬細(xì)菌高于養(yǎng)鯉魚稻田水體，主要是因?yàn)槌Ｒ?guī)稻田水體中有機(jī)物濃度較高。羅金飛[9]研究發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹水體中的鞘脂單胞菌屬細(xì)菌豐度在22 ℃時最高，且與銨態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)。本試驗(yàn)中克氏原螯蝦幼蝦腸道叢毛單菌屬細(xì)菌豐度隨溫度的升高表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，在23 ℃時占比最小，且遠(yuǎn)低于其他溫度。有研究者認(rèn)為蝦類自身微生物生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境關(guān)系密切[21-23]，推測本試驗(yàn)中23 ℃時有機(jī)物濃度較低，導(dǎo)致水體叢毛單菌屬、鞘脂單胞菌屬細(xì)菌豐度較低，進(jìn)而影響克氏原螯蝦腸道中叢毛單菌屬、鞘脂單胞菌屬細(xì)菌含量。

本研究發(fā)現(xiàn)23 ℃組氣單胞菌屬和檸檬酸桿菌屬占比較大，在其他處理組中占比較小。氣單胞菌和檸檬酸桿菌是淡水養(yǎng)殖主要致病菌，氣單胞菌感染魚類后容易引發(fā)敗血癥、腸炎及皮膚潰爛壞死等癥狀[24-28]。氣單胞菌也是引起蝦類發(fā)病的主要病原菌[29]。陳一鳴等[10]研究發(fā)現(xiàn)患病克氏原螯蝦腸道氣單胞菌屬細(xì)菌豐度顯著高于健康蝦。郁維娜等[30]研究發(fā)現(xiàn)感染白斑綜合征病毒的凡納濱對蝦腸道中氣單胞菌屬等菌群數(shù)量顯著升高。有研究者認(rèn)為克氏原螯蝦五月份集中發(fā)病的主要原因是由于氣單胞菌等病菌感染所致[31]。本研究中23 ℃處理溫度接近五月份克氏原螯蝦池塘養(yǎng)殖水溫，23 ℃處理組克氏原螯蝦腸道氣單胞菌豐度高于其他溫度處理組，說明溫度可能是影響氣單胞菌豐度的重要因素。目前已有檸檬酸桿菌感染中華鱉（Trionyx sinensis）、棘胸蛙（Quasipaa spinosa）和青魚（Mylopharyngodon piceus）等引發(fā)疾病的報(bào)道[32-34]。檸檬酸桿菌屬細(xì)菌是從爆發(fā)疾病的克氏原螯蝦、紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）、凡納濱對蝦等蝦蟹品種中分離出來的主要致病菌之一[35-37]。Liu等[4]研究不同季節(jié)克氏原螯蝦腸道菌群發(fā)現(xiàn)秋季精養(yǎng)池塘中克氏原螯蝦腸道檸檬酸桿菌屬細(xì)菌豐度比夏季顯著升高。本研究中23 ℃處理組克氏原螯蝦腸道檸檬酸桿菌豐度遠(yuǎn)高于31 ℃處理組，說明溫度可能是影響檸檬酸桿菌屬細(xì)菌豐度的重要因素。綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果表明溫度可能是造成克氏原螯蝦腸道氣單胞菌屬和檸檬酸桿菌屬等致病菌增加的主要原因。

本研究初步闡明了水溫對克氏原螯蝦腸道菌群特別是一些致病菌群的影響，下一步將繼續(xù)研究不同溫度對克氏原螯蝦機(jī)體生理生化指標(biāo)的影響，進(jìn)一步探討溫度與克氏原螯蝦疾病爆發(fā)之間的理論機(jī)制。

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（責(zé)任編輯：張震林）

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