李永華 鹿樹軍

1 濱州醫(yī)學(xué)院 山東 煙臺 264003； 2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 山東 濱州 256603

卒中后認知障礙(post-stroke cognitive impairment，PSCI)是除阿爾茨海默病外的最常見的癡呆類型，腦卒中發(fā)生后大腦血管病變導(dǎo)致記憶和認知功能的逐漸衰退。在老年人群中，PSCI的患病率約為5%，年齡每增加5.3歲，患病率增加1倍[1-3]。PSCI患者存在不同程度的認知功能損害，部分或完全需要他人照顧，給家庭、社會造成沉重的經(jīng)濟和精神負擔。目前的治療手段主要包括治療原發(fā)性腦血管疾病和腦功能恢復(fù)，然而治療效果均欠佳。PSCI主要是由遺傳—環(huán)境因素共同作用引起，腸道微生物可能是被忽略的一個重要的環(huán)境危險因素[4-5]。動脈粥樣硬化、腦血管病變、神經(jīng)炎癥、代謝綜合征等是腦卒中的常見病因及發(fā)病機制，而腸道菌群與這些因素緊密相關(guān)[6-8]。本研究通過分析中國山東某地PSCI患者腸道菌群的組成特點，分析腸道菌群與PSCI的相關(guān)性，從而為腸菌影響PSCI的發(fā)生發(fā)展及糞菌移植治療PSCI提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2020年7月—2021年7月在高密市人民醫(yī)院診斷為PSCI患者29例，卒中組患者18例，對照組20例。參與者是從高密市人民醫(yī)院收治患者中招募的。其中，PSCI組納入標準為：符合PSCI的診斷標準；影像學(xué)顯示有明確的梗死病灶；漢密爾頓抑郁量表(HAMD)評分<10分；患者或患者家屬知情同意，志愿參與并簽署知情同意書。卒中組納入標準為：符合2018年AHA/ASA急性缺血性腦卒中患者的早期治療指南；首次發(fā)病，有神經(jīng)系統(tǒng)定位體征，頭顱CT或MRI顯示有梗死病灶；無相應(yīng)認知障礙癥狀，且HAMD評分≥10分。對照組為為我院同期查體健康者，無急性缺血性腦卒中臨床表現(xiàn)，經(jīng)頭顱CT或MRI除外梗死病灶。排除標準為：3個月內(nèi)使用益生菌或抗生素；炎癥性腸病、消化道惡性腫瘤、消化道手術(shù)病史等疾?。灰鹫J知障礙的其他神經(jīng)精神疾病，如腦外傷、帕金森病、癲癇、精神分裂癥等；合并嚴重原發(fā)疾病，如心臟衰竭、腎衰竭、肝癌等。

1.2 資料收集與認知功能評估 收集患者性別、年齡、既往史等基礎(chǔ)資料，由經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)人員通過MMSE、MoCA進行評估測定。MMSE評分參考的癡呆嚴重程度分級為：輕度≥21分；中度10～20分；重度≤9分。 MoCA評分參考≥26分為正常。

1.3 糞便標本的采集 將其糞便標本保存至已消毒的大便杯子，于1 h內(nèi)置于-80°C冰箱保存用于后續(xù)檢測，避免反復(fù)凍融。

1.4 糞便樣本DNA的提取 采用強力糞便DNA提取試劑盒法進行。從-80℃冰箱取出糞便樣品，提取0.15 g左右到Dry Bead Tube中，60℃水浴直至全部溶解，65℃水浴加熱10 min、13 000 g離心1 min。依次加入250 μL C2、C3、C4、C5、C6溶液。用Epoch分光光度計檢測DNA濃度及純度，美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行Illumina Miseq測序。

1.5 糞便DNA的16s rRNA V3-V4的擴增及測序 PCR擴增，按指定測序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。16s rRNA V3-V4區(qū)引物(338F-806R)鑒定細菌的多樣性。其中，引物序列為：338F ACTCCTACGGGAGGCAGCA 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT。

1.6 生物信息學(xué)分析

1.6.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控 MiSeq測序得到雙端序列數(shù)據(jù)，首先依據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接成1條序列，同時對reads的質(zhì)量和拼接的效果進行質(zhì)控和過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode及引物序列來區(qū)分樣品從而得到有效序列，接著對序列方向進行校正，即為優(yōu)化數(shù)據(jù)。使用軟件為FLASH和Trimmomatic。

1.6.2 物種注釋與評估 運算分類單位(operational taxonomic units,OTU)是通過聚類操作，把序列根據(jù)彼此的相似性歸類為許多小組，1個小組就是1個OTU。一般在97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學(xué)分析。

1.6.3 Alpha多樣性分析 反映群落豐富度(community richness)的指數(shù)有sobs、Chao、Ace。反映群落多樣性(community diversity)的指數(shù)有Shannon、Simpson、Coverage。本研究選擇Ace及Shannon進行研究。組間Alpha多樣性指數(shù)差異檢驗應(yīng)用方差分析法，檢測不同分組間的指數(shù)值是否具有顯著性差異。

1.6.4 物種Venn圖分析 Venn圖可用于統(tǒng)計多組或多個樣本中所共有和獨有的物種(如OTU)數(shù)目，可以比較直觀地表現(xiàn)環(huán)境樣本的物種(如OTU)數(shù)目組成相似性及重疊情況。在通常情況下，選用相似水平為97%的OTU或其他分類學(xué)水平的樣本表。

1.6.5 群落組成分析 根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果可以了解不同分組(或樣本)在各分類水平(如域、界、門、綱、目、科、屬、種、OTU等)上的群落結(jié)構(gòu)組成情況。本研究在門和屬的水平上比較各組的群落組成情況。

2 結(jié)果

2.1 一般資料的比較 PSCI組MMSE、MoCA評分水平低于對照組(P<0.01)，而在年齡、性別、高血壓病史、糖尿病史、吸煙史、飲酒史、血糖水平、高脂血癥史，各組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

2.2 腸道菌群Alpha多樣性分析 Alpha多樣性是對單樣本中物種多樣性的分析，反映了微生物群落的豐度和多樣性。圖1顯示，對照組較PSCI組微生物群落(腸道菌群)更多樣化。與卒中組相比，PSCI組的Shannon指數(shù)值升高(t=0.11，P<0.05)，且Ace指數(shù)值升高(t=42.0，P<0.01)；與對照組相比，PSCI組的Shannon指數(shù)值升高(t=3.9，P<0.05)，且Ace指數(shù)值升高(t=21.4，P<0.01)。

表1 3組一般資料的比較

兩兩比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 物種Venn圖分析 圖2顯示，3組有533個共有OTU，即3組樣品具有較高的相似性，PSCI組有35個特有OTU，卒中組有45個特有OTU，對照組有38個特有OTU，提示3組分布存在差異性。

圖2 腸道菌群的物種Venn圖分析

2.4 物種差異分析 本研究應(yīng)用Kruskal-Wallis H分析法比較3組間的菌群物種差異。圖3顯示，PSCI 組與卒中組、對照組的腸道菌群結(jié)構(gòu)具有明顯的不同。PSCI組中多種條件致病菌(例如Faecalibacterium/糞桿菌屬、Bacteroides/擬桿菌屬擬桿菌，Pseudomonas/假單胞菌屬等)明顯増加(P<0.05)，而Ruminococcus/瘤胃球菌屬等有益菌群明顯減少(P<0.05)。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

PSCI是指由腦血管病的高危因素(高血壓病、糖尿病、高脂血癥和高同型半胱氨酸血癥等)、顯性腦血管病(腦梗死和腦出血等)及非顯性腦血管病(白質(zhì)疏松和慢性腦缺血等)引起的一組從輕度認知損害到癡呆的臨床綜合征，其病因和發(fā)病機制尚未明確[9-10]。近年來隨著對腸道微生物認識的深入，腸道菌群作為重要的環(huán)境因素在調(diào)節(jié)代謝性疾病的發(fā)生中的作用已被熟知。腸菌與糖尿病、動脈粥樣硬化等PSCI危險因素的致病機制關(guān)系密切。然而，PSCI與腸道菌群的直接相關(guān)性尚未有相關(guān)研究涉及。

腸菌的Alpha多樣性分析表明PSCI組的Ace指數(shù)值和Shannon指數(shù)值均小于對照組。無癥狀性動脈粥樣硬化患者的腸道菌群與對照組相似[11]，而本研究也發(fā)現(xiàn)存在這種現(xiàn)象，這可能是與3組間的腸菌結(jié)構(gòu)相似有關(guān)，但是需要擴大樣本量進一步去除混雜因素。

3組有533個共有OTU，即3組樣品具有較高的相似性，PSCI組有35個特有OTU，卒中組有45個特有OTU，對照組有38個特有OTU。這些結(jié)果表明，PSCI患者腸道菌群的分布與非PSCI人群存在差異性。本研究分析群落組成發(fā)現(xiàn)，PSCI組中多種條件致病菌(例如Faecalibacterium/糞桿菌屬、Bacteroides/擬桿菌屬擬桿菌，Pseudomonas/假單胞菌屬等)明顯増加，而有益菌(Ruminococcus/瘤胃球菌屬)降低。Bacteroides/擬桿菌屬擬桿菌屬于變形菌門，變形菌門的高豐度是潛在的菌群紊亂和疾病風險的識別標記[12]。百歲老人中血漿促炎細胞因子的高水平與腸道菌群中變形桿菌的富集及幾種產(chǎn)丁酸菌的減少相關(guān)，而高齡是PSCI的一個主要危險因素[13-14]。Burton等[15]對比多發(fā)性硬化患者與健康家庭成員/雙胞胎的糞便菌群發(fā)現(xiàn)，Acinetobacter calcoaceticus(乙酸鈣不動桿菌)在多發(fā)性硬化患者中增加，模型小鼠的研究亦驗證了該發(fā)現(xiàn)，這可能與刺激IL-10表達誘導(dǎo)促炎反應(yīng)相關(guān)。Ruminococcus/瘤胃球菌屬是主要的纖維降解菌，其產(chǎn)生的短鏈脂肪酸對于宿主的營養(yǎng)和健康有重要意義[16]。

綜上所述，本研究通過16s rRNA測序及相關(guān)生物信息學(xué)分析對腸道菌群進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)PSCI患者具有獨特的菌群結(jié)構(gòu)特點，這為腸菌影響PSCI的發(fā)生發(fā)展及糞菌移植治療PSCI提供理論依據(jù)。