馬 靜 藺婷婷 孫紹偉 賀倩倩 呂文文 滿玉清

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺 264003； 2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部 山東 濱州 256603

復(fù)方三黃酊由黃柏、黃連、黃芩以及冰片等組成，可以有效地治療傷口炎癥、止痛以及消除腫脹等。其可用于治療各期褥瘡、皮膚潰瘍和 Ⅱ 度以下燒燙傷等[1]。濕敷可以讓藥液迅速滲透和發(fā)揮作用[2]。該藥在臨床應(yīng)用中療效顯著，目前對其制藥工藝、含量測定、成分鑒定、體外抑菌活性、臨床療效等方面已經(jīng)進行了較多研究，但對復(fù)方三黃酊發(fā)揮抗菌作用的藥效成分及作用機制缺乏整體的認識。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新的研究模式被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3]。其結(jié)合了計算機技術(shù)、系統(tǒng)生物學(xué)、基因組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)等，可用于研究中藥的潛在藥理活性和作用機制[4]，創(chuàng)建藥物—成分—靶點—通路—疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)拓撲模型。中藥往往存在多種成分，作用于多個靶點，通過多條通道發(fā)揮作用，這就需要對中藥的作用機制進行共同的、系統(tǒng)的研究，所以基于生物信息學(xué)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對研究中藥的作用機制有重要的意義[5-6]。本研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，為進一步研究復(fù)方三黃酊的抗菌作用機制和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 復(fù)方三黃酊化學(xué)成分收集、作用靶點的篩選及疾病靶點基因的預(yù)測 應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmsp-e.com/)收集黃柏、黃連、黃芩和冰片四味中藥各自的化學(xué)成分和產(chǎn)生作用的活性成分靶蛋白。應(yīng)用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫匹配靶蛋白與靶點基因。以“anti-bacterial”作為檢索詞輸入GeneCards網(wǎng)站(https://www.Genecards.org/)，檢索抗菌作用的相關(guān)靶點基因。

1.2 收集成分與疾病的共有靶點 應(yīng)用Venny 2.1.0分析工具收集和成分相關(guān)的對應(yīng)靶點以及疾病對應(yīng)靶點之間的有共有交集靶點。

1.3 構(gòu)建復(fù)方三黃酊的“藥物—成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)體系 應(yīng)用 Cytoscape 3.7.1 軟件繪制復(fù)方三黃酊“藥物—成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)拓撲模型。

1.4 創(chuàng)建復(fù)方三黃酊具有抗菌活性的相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò) 輸入STRING平臺(https://string-db.org/)共有靶點，物種設(shè)置為“智人”，最小交互閾值設(shè)置為“中等置信度”(>0.4)，獲得蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)參數(shù)篩選關(guān)鍵靶點基因。

1.5 關(guān)鍵靶點基因功能分析及信號通路富集分析 為了進一步分析上述選擇的關(guān)鍵靶點基因的生物學(xué)功能，預(yù)測復(fù)方三黃酊的抗菌活性作用機制，本研究將篩選得到的關(guān)鍵靶點基因輸入到Omicshare數(shù)據(jù)庫中(https://www.omicshare.com/tools/)，以物種為人(Homo sapiens)作為篩選條件，進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.6 成分—靶點分子對接 運用分子對接技術(shù)驗證預(yù)測的關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵靶點的相互作用關(guān)系。應(yīng)用PDB(http://www.rcsb.org/)網(wǎng)站查找關(guān)鍵靶點蛋白結(jié)構(gòu)，通過MOE軟件將關(guān)鍵靶點與活性化合物進行分子對接驗證，應(yīng)用Discovery Studio分子建模軟件將與各靶點蛋白結(jié)合能最高的化學(xué)成分對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 疾病對應(yīng)靶點基因 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)復(fù)方三黃酊化學(xué)成分的342個潛在靶點基因。在GeneGards數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了1 878個與抗菌疾病相關(guān)的靶點基因。

2.2 復(fù)方三黃酊中化學(xué)成分對應(yīng)靶點與疾病作用靶點的交集靶點 從具有與抗菌相關(guān)靶點基因中提取出與復(fù)方三黃酊的化學(xué)成分作用靶點的交叉靶點，得到復(fù)方三黃酊-抗菌共同靶點179個(圖1)。

圖1 復(fù)方三黃酊化學(xué)成分作用靶點與抗菌相關(guān)靶點基因的韋恩圖

2.3 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)體系 應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件將179個共有靶點基因構(gòu)建“藥物—成分—靶點”的網(wǎng)絡(luò)體系(圖2)。結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)共有373個節(jié)點，1 673條邊。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)篩選出degree排名前10位的化合物槲皮素、丁香油酚、β-谷甾醇、藥根堿、漢黃芩素、4-羥基肉桂酸、油酸、黃藤素、黃連堿、棕櫚酸。

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建、關(guān)鍵靶點基因篩選結(jié)果 在STRING平臺利用179個交集靶點基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)，其中包含179個節(jié)點和3 817條相互作用連線。根據(jù)度值篩選出INS、AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF、JUN、CASP3、MAPK1、MYC、EGF、EGFR、PTGS2、MMP9、IL1B、CXCL8、ESR1、CCND1、FOS、CAT、CCL2、ACTB、PTEN、IL10、CYCS、MMP2、PPARG、MAPK14、ICAM1、NOS3、ERBB2、IL4、BCL2L1、RELA、HMOX1共35個關(guān)鍵靶點基因。PPI網(wǎng)絡(luò)提示這些蛋白在復(fù)方三黃酊抗菌作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖2 復(fù)方三黃酊“藥物—成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)體系

圖3 復(fù)方三黃酊交集靶點基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果 應(yīng)用Omicshare數(shù)據(jù)庫對35個關(guān)鍵靶點基因的生物過程和代謝通路進行分析，GO功能富集分析得到47條(圖4)，其中生物過程為25個(P<0.05)，主要是生物調(diào)節(jié)、細胞過程、代謝過程、正調(diào)節(jié)生物過程、刺激反應(yīng)等，分子功能為8條，主要包括分子結(jié)合、分子調(diào)節(jié)、催化活性、轉(zhuǎn)錄活性、分子轉(zhuǎn)錄活性等，而細胞組分為14條，主要有細胞器、細胞膜、生物膜內(nèi)環(huán)境、細胞外區(qū)等。KEGG信號通路為152條(P<0.05)，取前20條通路做氣泡圖(圖5)，結(jié)果主要是富集在癌癥通路、人巨細胞病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、MAPK信號通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路、癌癥蛋白聚糖、IL-17信號通路、TNF信號通路等通路上。因此，可以假設(shè)復(fù)方三黃酊的抗菌活性可能是通過這些通路發(fā)揮作用。

2.6 分子對接驗證結(jié)果 分子對接技術(shù)可研究關(guān)鍵化合物與關(guān)鍵靶點的結(jié)合能力，用于驗證網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵化合物及靶點。將核心靶點AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF分別與排名前四的關(guān)鍵化合物槲皮素、丁香油酚、β-谷甾醇、藥根堿進行分子對接驗證。結(jié)合能越低，發(fā)生作用的可能性越大，一般認為結(jié)合能得分<-5.0 kJ·mol-1表明有較好的結(jié)合活性[7]。與AKT蛋白結(jié)合能力最佳的是β-谷甾醇，與IL-6結(jié)合能力最佳的是藥根堿，與TP53結(jié)合能力最佳的是藥根堿，與VEGFA結(jié)合能力最佳的是藥根堿，與TNF結(jié)合能力最佳的是β-谷甾醇(表1，圖6)。

圖4 復(fù)方三黃酊GO功能富集分析圖

圖5 復(fù)方三黃酊KEGG通路富集分析圖

表1 復(fù)方三黃酊的分子對接結(jié)果(kJ·mol-1)

3 討論

復(fù)方三黃酊以黃連、黃芩、黃柏和冰片為主要組方，在抗菌消炎方面療效顯著，可用于治療各種皮膚感染例如皮膚破潰、痔瘡以及燒燙傷等病狀。目前體外研究顯示，復(fù)方三黃酊對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌都有顯著的抑菌殺菌作用，尤其是對金黃色葡萄球菌作用較強[8]。由此可見，復(fù)方三黃酊可抑制多種致病菌生長，有利于感染性疾病的治療，促進傷口的愈合。

復(fù)方三黃酊包含槲皮素、丁香油酚、β-谷甾醇、藥根堿、漢黃芩素、4-羥基肉桂酸、油酸、黃藤素、黃連堿、棕櫚酸等362種化合物，其中前10位是靶向性最強的化合物。秦曉蓉等[9]研究表明，槲皮素抗菌譜廣，對金黃色葡萄球菌、膠質(zhì)芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌等均有較強的抗菌作用。槲寄生的藥理作用廣泛，具有抗氧化、抗菌、炎癥、病毒、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、抗癌、降糖、心血管保護等作用[10]。丁香油酚可影響細胞膜的通透性，減少病原體對宿主細胞的粘附，降低病原體的致病性。此外，丁香油酚可誘導(dǎo)細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細菌和真菌的凋亡[11-12]。Ding等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在以葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，腸上皮細胞、巨噬細胞上抗菌肽的表達在β-谷甾醇作用后顯著增加，傷寒沙門菌的存活率降低。趙小然等[14]研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可與肺炎鏈球菌溶血素上膽固醇的結(jié)合位點結(jié)合，從而抑制肺炎鏈球菌的細胞毒性及基因毒性，具有抗肺炎鏈球菌感染的作用。此外，β-谷甾醇對金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等也具有較強的抑制作用[15]?？傊?，復(fù)方三黃酊中的槲皮素、丁香油酚、β-谷甾醇等在動物實驗和細胞水平上均表現(xiàn)出良好的抗菌作用。

復(fù)方三黃酊發(fā)揮抗菌作用有35個關(guān)鍵靶點，分值由高到低排序依次為INS、AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF等。AKT被激活后參與介導(dǎo)多種復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)，作為重要信號通路參與調(diào)節(jié)細胞生長、代謝、增殖和凋亡[16]。而IL-6、TNF-α在診斷細菌感染中具有重要意義[17]。本研究篩選到的靶標基因包括IL及TNF，驗證了靶標基因參與抗菌作用。TP53參與到修復(fù)DNA、促進細胞凋亡作用等重要過程中，在機體免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮了一定作用[18]。VEGF是一種特異性較高的炎性因子，其具有促進血管內(nèi)皮細胞生長，血管通透性增加，血管形成及維持血管發(fā)揮正常功能等作用[19]。

從GO功能富集結(jié)果看，復(fù)方三黃酊的有效成分靶點主要集中在細胞器、細胞膜、細胞內(nèi)及細胞外，參與生物調(diào)節(jié)、細胞過程、代謝過程、刺激反應(yīng)及生物學(xué)過程的正調(diào)節(jié)等過程。通路富集結(jié)果看靶點基因顯著富集在MAPK信號通路、磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路。轉(zhuǎn)錄因子c-Jun、c-Fos被MAPK信號激活后促使TNF-α、IL-1、IL-6等炎性因子轉(zhuǎn)錄[20]。MAPK信號通路參與了炎癥反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)以及細胞的生長、分化和凋亡等過程[21]。磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路可調(diào)節(jié)活化炎性反應(yīng)細胞、釋放炎性遞質(zhì)等途徑[22]。IL-17A參與調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)，該因子在機體抵御細菌和真菌感染中起到重要作用[23]。TNF是一類可對生物體產(chǎn)生多種影響的細胞因子[24]，與細胞膜上的受體結(jié)合，促進細胞的生長、分化、凋亡及誘發(fā)炎癥等，參與抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等。以上表明，復(fù)方三黃酊抗菌作用可通過多生物途徑、多條信號通路共同實現(xiàn)。分子對接結(jié)果顯示，藥根堿與3個關(guān)鍵靶點結(jié)合能力均最佳，值得進一步深入探索。本研究中所預(yù)測的核心成分與關(guān)鍵靶點之間具有較強的結(jié)合能力，證實了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果的可靠性。

圖6 復(fù)方三黃酊的分子對接結(jié)果

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法探討了復(fù)方三黃酊的抗菌作用機制，結(jié)果表明，復(fù)方三黃酊發(fā)揮抗菌作用是通過多成分、多靶點、多通路。這為復(fù)方三黃酊的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)理論支持，也為中醫(yī)藥抗菌機制研究提供了思路，有利于后續(xù)實驗研究的深入和臨床應(yīng)用的拓展。