亓文霞 王勝蘭 楊 桁 孫鈺迪 王云騰 徐美琳 張 靜

濱州醫(yī)學院藥學院 山東 煙臺 264003

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是惡性腫瘤死亡的主要原因之一，且發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]。肝癌的治療途徑包括手術(shù)、化療和放療等，其中化療是目前肝癌治療的主要手段。然而，紫杉醇(paclitaxel，PTX)等化療藥物往往存在非特異性體內(nèi)分布導致全身性毒副作用、生物利用度低、長期使用易產(chǎn)生腫瘤耐藥等缺陷，臨床使用療效不佳[2]。近年來，大量納米給藥系統(tǒng)已被應(yīng)用于化療藥物的遞送中，并被證實可以通過增強滲透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR效應(yīng))攜帶藥物被動靶向到腫瘤部位，從而提高藥物在腫瘤部位的有效濃度，同時降低藥物的全身性毒副作用[3]。此外，納米給藥系統(tǒng)還被證實在改善疏水性藥物的溶解性、提高藥物的生物利用度、實現(xiàn)藥物緩控釋和聯(lián)合給藥等方面均表現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力，有望改善腫瘤化療效果[4]。

人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)是一種天然生物大分子，半衰期長且含有許多配體結(jié)合位點，作為疏水性藥物的體內(nèi)轉(zhuǎn)運載體具有水溶性好、可生物降解、無毒、免疫原性低等優(yōu)點[5]。HSA與化療藥物PTX自組裝形成的白蛋白-PTX納米粒Abraxane?作為基于蛋白質(zhì)的納米藥物遞送系統(tǒng)最成功的案例，己通過美國食品和藥物管理局的批準并用于多種癌癥的治療，且抗腫瘤效果顯著[6]。全反式維甲酸(invitroall-transretinoic acido，RA)是維生素A的主要天然代謝物，作為一種低毒性的細胞分化劑被證實可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞分化和細胞凋亡等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，在惡性腫瘤治療中具有重要作用[7]。RA可通過上調(diào) E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達、下調(diào)波形蛋白(vimentin)表達增加細胞間的相互作用來逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，誘導腫瘤干細胞分化，降低 PTX 耐藥細胞的侵襲和遷移能力等多途徑聯(lián)合抑制 PTX 引起的腫瘤耐藥和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，提高腫瘤細胞對化療的敏感性，顯著改善 PTX 對多種實體瘤的治療效果[8-9]。

本研究旨在以RA修飾白蛋白為載體構(gòu)建紫杉醇白蛋白納米給藥系統(tǒng)PTX@HSA-RA(圖1)，并從2D和3D細胞水平上對該納米給藥系統(tǒng)對肝癌細胞HepG2的體外增殖抑制效果進行研究，探討其作為抗腫瘤藥物遞送體系的可行性。

圖1 PTX@HSA-RA的制備與抗腫瘤作用示意圖

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 HSA購自美國 Sigma-Aldrich 公司；N,N′二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，PTX和RA購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Hoechst 33342購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。Nano ZS90納米激光粒度分析儀購自英國 Malvern 公司；JEM-1400透射電子顯微鏡購自日本電子株式會社；高效液相色譜購自美國Thermo Fisher Scientific公司；TGA/DSC 3+熱重及同步熱分析儀購自瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Frontier傅里葉變換紅外光譜儀購自美國PerkinElmer公司；FACS Canto II流式細胞儀購自美國BD公司；TCS SPE激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國LEICA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HSA-RA的合成與表征

1.2.1.1 HSA-RA的合成 以DCC/NHS為縮合劑，通過酰胺化反應(yīng)將RA接枝到 HSA[10]。稱取20 mg HSA溶解于9 mL 含0.05 M NaCl 的 0.1 M PBS (pH值為 8.0)中。稱取RA(HSA與RA的投料摩爾比分別為1∶5、1∶10和1∶20)溶解于0.2 mL DMSO中，加入NHS和DCC(RA、NHS、DCC的摩爾比為1∶1.2∶1.2)室溫下避光攪拌活化24 h。將活化后的RA溶液滴加入HSA溶液中，室溫下避光攪拌反應(yīng)24 h后，將反應(yīng)液于去離子水中透析(MWCO 14 000 Da)48 h，5 000 r/min離心10 min，上清液冷凍干燥即得HSA-RA。

1.2.1.2 HSA-RA的表征 利用傅立葉變換紅外(FT-IR)光譜對HSA-RA的結(jié)構(gòu)進行確證。利用紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜測定RA的偶聯(lián)度，將HSA-RA溶液適當稀釋后，于349 nm處測定其吸光度值并計算其中RA濃度，利用BCA法測定其中HSA的濃度，根據(jù)以下公式計算RA的偶聯(lián)度(m)。式中，WRA為溶液中 RA的質(zhì)量，WHSA為溶液中HSA的質(zhì)量。

1.2.2 載藥納米粒PTX@HSA-RA的制備與表征

1.2.2.1 PTX@HSA-RA的制備 采用自組裝法制備載藥納米粒PTX@HSA-RA[11]。稱取10 mg HSA-RA溶解于10 mL含0.05 M NaCl 的 0.1 M PBS (pH值為8.0)中。稱取1 mg PTX溶解于1 mL無水乙醇中，邊攪拌邊將PTX的無水乙醇溶液滴加至HSA-RA溶液中。將反應(yīng)液去離子水中透析(MWCO 14 000 Da)48 h，5 000 r/min離心10 min，上清液即為載藥納米粒PTX@HSA-RA懸液。

1.2.2.2 PTX@HSA-RA的表征 利用納米激光粒度分析儀測定PTX@HSA-RA的粒徑分布和表面Zeta電位，透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察其形貌。利用HPLC檢測PTX@HSA-RA的包封率及載藥量。取1 mL PTX@HSA-RA懸液分別置于37℃、含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基和4℃、pH值為7.4 PBS中孵育7 d，檢測其粒徑分布與表面Zeta電位變化情況，考察其體內(nèi)穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性。分別取PTX、HSA-RA、PTX@HSA-RA以及PTX與HSA-RA混合物，在 25～300℃范圍內(nèi)，升溫速率10℃/min，氮氣流量 20 mL/min 條件下進行差示熱量掃描(DSC)分析。

1.2.3 PTX@HSA-RA的藥物負載與釋放研究

1.2.3.1 PTX@HSA-RA的包封率與載藥量測定 取PTX@HSA-RA懸液 1 mL，加入 9 mL 乙腈超聲提取其中的PTX，12 000 r/min離心15 min，利用HPLC測定上清液中PTX的含量。取1 mL PTX@HSA-RA懸液冷凍干燥，測定納米粒的總質(zhì)量。根據(jù)以下公式計算PTX@HSA-RA的包封率(entrapment efficiency，EE)和載藥量(drug loading，DL)。式中，WNPs為PTX@HSA-RA中PTX的質(zhì)量，WPTX為PTX的投藥量，Wtotal為PTX@HSA-RA的總質(zhì)量。

1.2.3.2 PTX@HSA-RA的體外藥物釋放研究 分別配制含0.2% Tween-80的不同pH值的PBS作為釋放介質(zhì)，研究PTX@HSA-RA在不同pH值條件下的體外藥物釋放情況[12]。取3 mL PTX@ HSA-RA懸液加入透析袋(MWCO 14000 Da)中，置于含30 mL 釋放介質(zhì)的棕色瓶中，37℃恒溫振蕩，于設(shè)定的時間點取樣3 mL，并補充3 mL新鮮釋放介質(zhì)。利用HPLC 測定移出的釋放介質(zhì)中PTX 的含量，根據(jù)以下公式計算PTX@HSA-RA的累積藥物釋放率(cumulative drug release，%)，并繪制藥物釋放曲線。式中，M0為PTX@HSA-RA中PTX的總量，V為釋放介質(zhì)的總體積，n為取樣次數(shù)，Vi為Ti時移出釋放介質(zhì)的體積，Ci為Ti時釋放介質(zhì)中PTX的濃度。

Cumulative drug release(%)=

1.2.4 溶血實驗 利用新西蘭兔紅細胞對PTX@HSA-RA的血液相容性進行評價。將提取的新鮮兔血與生理鹽水混勻后離心、清洗并稀釋為2%的紅細胞懸液。分別向2.5 mL HSA-RA溶液或PTX@HSA-RA懸液中加入2.5 mL紅細胞懸液，以生理鹽水為陰性對照，蒸餾水為陽性對照，37℃孵育2 h。2 500 r/min離心10 min，取上清液于545 nm 處測定吸光度值，根據(jù)以下公式計算溶血率(Hemolysis，%)。

式中，ODsample為各樣品組吸光度值，ODnc為陰性對照組吸光度值，ODpc為陽性對照組吸光度值。

1.2.5 體外細胞攝取實驗

1.2.5.1 熒光標記FITC@HSA-RA的制備與表征 參照1.2.2中方法，將異硫氰酸熒光素(FITC)的無水乙醇溶液滴加至HSA-RA溶液中，制備熒光標記納米粒FITC@HSA-RA，并對其粒徑分布及表面電位進行測定。

1.2.5.2 FITC@HSA-RA的體外細胞毒性研究 為避免FITC@HSA-RA懸液的細胞毒性對細胞攝取實驗結(jié)果的影響，利用MTT法對FITC@HSA-RA懸液對HepG2細胞的體外細胞毒性進行研究。將HepG2細胞接種于96孔板中于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，將各孔中培養(yǎng)液分別更換為200 μL不同濃度的FITC@HSA-RA懸液，以培養(yǎng)液為陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。向各孔中加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去各孔中溶液，加入150 μL DMSO充分溶解甲臜，于酶標儀490 nm下測定各孔的吸光度值，根據(jù)以下公式計算HepG2細胞的存活率(Cell viability，%)。

式中，ODsample為樣品組吸光度值，ODnc為陰性對照組吸光度值。

1.2.5.3 激光共聚焦顯微鏡觀察 將HepG2細胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，將各皿中培養(yǎng)液分別更換為1 mL不同濃度的FITC@HSA-RA懸液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。棄去各皿中溶液，PBS漂洗細胞 3 次，4%多聚甲醛固定后加入Hoechst 33342 染色。PBS漂洗后，將培養(yǎng)皿置于激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)下觀察并拍照。

1.2.5.4 流式細胞儀檢測 將HepG2細胞接種于6孔板中于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，將各孔中培養(yǎng)液分別更換為2 mL不同濃度的FITC@HSA-RA無血清培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間。棄去各孔中溶液，PBS漂洗細胞3次，胰酶消化后離心收集細胞并重懸于0.5 mL PBS中，進樣流式細胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測。

1.2.6 體外細胞毒性實驗 參照1.2.5.2中方法，HepG2細胞于96孔板中培養(yǎng)過夜后，將各孔中培養(yǎng)液分別更換為200 μL不同濃度的PTX@HSA-RA懸液，以培養(yǎng)液為陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，利用MTT法研究PTX@ HSA-RA對HepG2細胞的體外細胞毒性。

1.2.7 PTX@HSA-RA對HepG2細胞3D模型的生長抑制實驗 參照文獻[14]，利用HepG2細胞構(gòu)建體外3D細胞模型(multicellular tumor spheroids，MTCSs)，研究PTX@HSA-RA對HepG2-MTCSs的體外生長抑制情況。將HepG2細胞接種于96孔超低粘附培養(yǎng)板中，1 000 r/min離心5 min后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至HepG2-MTCSs直徑約為300 μm。向含有 HepG2-MTCSs 的孔中分別加入PTX濃度為10 μg/mL的游離PTX溶液或PTX@HSA-RA懸液，以培養(yǎng)液為陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng) 4 d。倒置相差顯微鏡觀察 HepG2-MTCSs的形態(tài)，測量其最長直徑(a)和最短直徑(b)，根據(jù)以下公式計算HepG2-MTCSs的體積(V)和生長抑制率(inhibiting rate，IR,%)。式中，Vt表示游離PTX和PTX@HSA-RA懸液作用t時間后HepG2-MTCSs的體積，Vc表示相同作用時間后陰性對照組HepG2-MTCSs的體積。

2 結(jié)果

2.1 HSA-RA的表征 通過改變HSA與RA的投料摩爾比，分別合成了載體材料HSA-RA(1∶5)、HSA-RA(1∶10)和HSA-RA(1∶20)。

2.1.1 HSA-RA的FT-IR表征 HSA、RA和HSA-RA的FT-IR譜圖(圖2)。HSA的FT-IR光譜給出了蛋白質(zhì)類的共有吸收峰，包括3 289、1 658、1 546 cm-1處酰胺結(jié)構(gòu)的特征吸收和2 960、2 915 cm-1處甲基的不對稱伸縮振動吸收峰。RA的FT-IR光譜顯示2 930 cm-1處甲基的特征吸收峰和1 658 cm-1處羧基中C=O的特征吸收，以及922、873、825、694 cm-1處烯氫的彎曲振動峰。制備得到的HSA-RA(1∶5)、HSA-RA(1∶10)和HSA-RA(1∶20)的FT-IR光譜均給出蛋白質(zhì)的特征吸收，并且HSA-RA(1∶5)在944、860 cm-1處，HSA-RA(1∶10)在954、857 cm-1處，HSA-RA(1∶20)在943、858cm-1處均出現(xiàn)烯氫的彎曲振動峰，證實RA與HSA成功偶聯(lián)。

A. HSA；B. RA；C. HSA-RA(1∶5)；

2.1.2 HSA-RA的紫外—可見光譜表征 HSA-RA(1∶5)、HSA-RA(1∶10)和HSA-RA(1∶20)的紫外-可見光譜(圖3)。HSA僅在280 nm處有最大吸收波長，而RA在349 nm處出現(xiàn)特征吸收峰。HSA-RA(1∶5)、HSA-RA(1∶10)和HSA-RA(1∶20)的譜圖中均可明顯看到RA和HSA的特征峰，證實HSA-RA的成功制備。隨著RA與HSA的投料比的增加，引入HSA主鏈中的RA數(shù)目增加，利用紫外分光光度法測得HSA-RA(1∶5)、HSA-RA(1∶10)和HSA-RA(1∶20)中RA的偶聯(lián)度分別為18.5、39.1和82.1 μg/mg。

圖3 各樣品的紫外-可見吸收光譜

2.2 PTX@HSA-RA的表征 載藥納米粒PTX@HSA-RA的粒徑分布、多分散系數(shù)(PDI)、表面Zeta電位及包封率和載藥量的檢測結(jié)果(表1)。隨著RA與HSA投料比的增加，PTX@HSA-RA的平均粒徑從(127.0±1.1)nm增加至(155.2±2.9)nm，且包封率和載藥量隨之增加，這可能是由于RA偶聯(lián)度增加導致HSA的疏水性增強，有利于實現(xiàn)對疏水性PTX的負載。在白蛋白自組裝過程中，pH值<7.0且在其等電點附近時會導致蛋白質(zhì)聚集，pH值>9.0時蛋白質(zhì)分子間排斥力增大，都不利于納米粒形成，因此，載藥納米粒PTX@HSA-RA在pH值為8.0條件下制備[15]。此時體系pH值高于HSA等電點，因此PTX@HSA-RA表面為負電性，且Zeta電位的絕對值隨RA投料量的增加而增大，這可能與HSA表面氨基被RA取代有關(guān)。當納米粒的粒徑<200 nm時易于通過EPR效應(yīng)富集于腫瘤組織周圍[16-17]，因此選擇粒徑為(155.2±2.9)nm、RA的偶聯(lián)度和PTX的包封率和載藥量均較高的HSA-RA(1∶20)樣品用于后續(xù)載藥納米粒的實驗研究。

表1 PTX@HSA-RA的表征

利用TEM 觀察PTX@HSA-RA的形貌見圖4。PTX@HSA-RA呈規(guī)整的球形，粒徑約為100 nm。PTX@HSA-RA懸液泛淡黃色乳光，無不溶性顆粒物，而游離RA幾乎不溶，表明HSA與RA偶聯(lián)后顯著改善了RA的溶解性。PTX@HSA-RA分別于37℃、含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基和4℃、pH值為7.4的PBS中儲存7 d后，粒徑分布和表面電位均無顯著變化，表明PTX@HSA-RA具有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性。PTX和HSA-RA與PTX的混合物在220℃和237℃處均出現(xiàn)明顯的熔融吸收峰和分解放熱峰，表明PTX以結(jié)晶狀態(tài)存在。而HSA-RA和PTX@HSA-RA的曲線中PTX的熔融吸收峰和分解放熱峰均消失，表明PTX由晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)，證實PTX被負載于PTX@HSA-RA中(圖4)。

A. TEM照片；B. 實物圖；C. 穩(wěn)定性；D. DSC圖

2.3 PTX@HSA-RA的體外藥物釋放研究 分別模擬正常生理環(huán)境(pH值為7.4)、腫瘤細胞外環(huán)境(pH值為6.5)和腫瘤細胞內(nèi)溶酶體環(huán)境(pH值為5.0)對PTX@HSA-RA的體外藥物釋放行為進行研究。PTX@HSA-RA的藥物釋放具有一定的緩釋效果和pH 敏感性，至72 h時pH值為5.0條件下PTX的累積釋放率(63.9%)顯著高于pH值為7.4(22.2%)和pH值為6.5(41.7%)條件下PTX的累積釋放率，有利于減少藥物在血液循環(huán)中的損失，促進 PTX 聚集在腫瘤組織并加快藥物釋放，從而減少PTX對正常組織的損傷(圖5)。

圖5 PTX@HSA-RA的體外藥物釋放曲線

2.4 溶血實驗 通過體外紅細胞溶血實驗考察載體材料HSA-RA和PTX @HSA-RA的溶血率(圖6)。在實驗設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，HSA-RA和PTX@HSA-RA的溶血率隨濃度的增加均略有上升，但均低于5%，表明兩者用于靜脈注射給藥具有良好的安全性[18]。

圖6 HSA-RA和PTX@HSA-RA的溶血率

2.5 體外細胞攝取實驗

2.5.1 熒光標記FITC@HSA-RA納米粒的表征 FITC@HSA-RA的粒徑分布及表面Zeta電位(圖7)。FITC@HSA-RA的平均粒徑為(175.4±3.4)nm，粒徑呈正態(tài)分布，分布范圍較窄，表面Zeta電位為(-20.1±1.5)mV，與PTX@HSA-RA的粒徑和Zeta電位檢測結(jié)果相似。

A. 粒徑及表面Zeta電位；B. 體外細胞毒性

2.5.2 FITC@HSA-RA納米粒的體外細胞毒性實驗 MTT法檢測FITC@HSA-RA的體外細胞毒性(圖7)。當FITC的濃度在25～200 μg/mL范圍內(nèi)時，F(xiàn)ITC@HSA-RA與HepG2細胞作用24 h后細胞的相對增殖率均高于95%，表明該濃度范圍內(nèi)FITC@HSA-RA對HepG2細胞無毒性，不會對細胞攝取實驗結(jié)果造成影響。

2.5.3 FITC@HSA-RA納米粒的體外細胞攝取 利用CLSM對HepG2 細胞對PTX@HSA-RA的體外攝取情況進行觀察(圖8)。細胞核和FITC@HSA-RA分別用 Hoechst 33342 和 FITC標記，顯示為藍色和綠色熒光。FITC@HSA-RA與HepG2細胞作用1 h后，在細胞質(zhì)中可明顯觀察到綠色熒光分布，且隨作用時間延長胞內(nèi)熒光強度逐漸增強，表現(xiàn)出一定的時間依賴性。HepG2細胞對PTX@HSA-RA的攝取具有明顯的濃度依賴性，隨著FITC@HSA-RA濃度的增加細胞內(nèi)熒光強度逐漸增強。FCM檢測結(jié)果與CLSM觀察結(jié)果一致，證實FITC@HSA-RA可被HepG2 細胞快速、持續(xù)攝取，并在細胞質(zhì)中大量聚集，有助于促進藥物的跨膜轉(zhuǎn)運，進而改善腫瘤治療效果。

A. 不同濃度FITC@HSA-RA與HepG2細胞作用2 h的CLSM照片；B. FITC@HSA-RA(FITC濃度100 μg/mL) 與HepG2細胞作用不同時間的CLSM照片；C. 不同濃度FITC@HSA-RA與HepG2 細胞作用2 h的FCM檢測結(jié)果；D. FITC@HSA-RA(FITC濃度100 μg/mL)與HepG2細胞作用不同時間的FCM檢測結(jié)果

2.6 體外細胞毒性實驗 通過MTT法分別對載體HSA-RA、游離PTX和載藥納米粒PTX@HSA-RA的體外細胞毒性進行評價(圖9)。不同濃度HSA-RA與HepG2細胞作用48 h后，細胞的存活率均高于90%，表明HSA-RA作為載體材料具有良好的生物相容性。隨著PTX濃度的升高，PTX@HSA-RA與游離PTX對HepG2細胞的細胞毒性均隨之升高。當PTX濃度為1～10 μg/mL時，PTX@HSA-RA與游離PTX對HepG2細胞的細胞毒性差異無統(tǒng)計學意義。當PTX濃度為0.001～0.1 μg/mL范圍內(nèi)時，PTX@HSA-RA納米粒對HepG2細胞的細胞毒性明顯高于游離PTX，表現(xiàn)出更為顯著的HepG2細胞增殖抑制效果。

兩組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.7 HepG2-MTCSs 的生長抑制實驗 為了進一步研究PTX@HSA-RA的體外抗腫瘤效果，對PTX@HSA-RA對3D細胞模型HepG2-MTCSs的體外生長抑制效果進行研究(圖10)。作用2 d后，可觀察到陰性對照組HepG2-MTCSs 的體積增加，游離PTX處理組HepG2-MTCSs的體積變化較小，而PTX@HSA-RA處理組HepG2-MTCSs的體積明顯減小；作用4 d后，陰性對照組HepG2-MTCSs的體積持續(xù)增加且邊緣輪廓清晰，而游離PTX處理組和PTX@HSA-RA處理組HepG2-MTCSs的邊緣模糊，周圍可見大量細胞游離，表明HepG2-MTCSs完整性受到破壞，且PTX@HSA-RA處理組HepG2-MTCSs 的體積最小。游離PTX和PTX@HSA-RA與HepG2-MTCSs作用2和4 d時，PTX@HSA-RA處理組對HepG2-MTCSs 生長的抑制率均顯著高于游離PTX處理組(P<0.01)，表明PTX@HSA-RA較游離PTX具有更強的HepG2-MTCSs生長抑制作用。

3 討論

化療是肝癌臨床治療中的主要藥物治療手段，PTX是臨床治療中最有效和最常用的化療藥物之一，但存在水溶性差導致生物利用度低、非特異性體內(nèi)分布導致全身性毒副作用、長期使用易產(chǎn)生耐藥等缺陷，嚴重限制其臨床應(yīng)用。本研究構(gòu)建的以RA修飾白蛋白為載體的PTX白蛋白納米給藥系統(tǒng)PTX@HSA-RA具有較小的粒徑(<200 nm)、較高的藥物包封率、載藥量和良好的生物相容性，有利于通過EPR效應(yīng)攜帶PTX被動靶向到腫瘤部位，且可被HepG2細胞快速、持續(xù)攝取并在腫瘤細胞內(nèi)低pH值環(huán)境中促進藥物釋放，從而減少血液循環(huán)中藥物的滲漏，提高腫瘤部位有效藥物濃度，進而改善肝癌的化療效果。

A. HepG2-MCTSs 的顯微鏡觀察；B. 游離 PTX 和 PTX@HSA-RA對HepG2-MCTSs的生長抑制率。兩組比較，**P<0.01。

RA可以通過與特定的細胞受體和核受體相互作用而影響腫瘤細胞的生長、分化和凋亡，對多種惡性腫瘤表現(xiàn)出抗增殖、抗遷移和抗侵襲等活性，在腫瘤防治中具有重要作用[8-9]。因此，載體材料中RA的引入有望與PTX發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，進而提高PTX的化療效果。MTT實驗結(jié)果表明，當PTX濃度為1～10 μg/mL時，由于游離PTX可通過擴散作用直接進入細胞并發(fā)揮作用，PTX@HSA-RA與游離PTX對HepG2細胞的細胞毒性未表現(xiàn)出顯著差異；而當PTX濃度為0.001～0.1 μg/mL時，PTX@HSA-RA對HepG2細胞的細胞毒性明顯高于游離PTX，這可能與PTX@HSA-RA促進PTX通過胞吞作用跨膜轉(zhuǎn)運有關(guān)。此外，PTX@HSA-RA中的RA與PTX也可能發(fā)揮了協(xié)同抗腫瘤作用，因而表現(xiàn)出更為顯著的HepG2細胞增殖抑制效果。

與通過單層細胞培養(yǎng)來研究納米給藥系統(tǒng)對腫瘤細胞的抑制增殖效果的MTT實驗相比， 構(gòu)建3D細胞模型(MTCSs)對納米給藥系統(tǒng)對其生長抑制作用進行研究能夠更準確地模擬體內(nèi)實體瘤內(nèi)細胞—細胞間以及細胞—細胞基質(zhì)間的復(fù)雜結(jié)構(gòu)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)來評價納米給藥系統(tǒng)的體外抗腫瘤效果[19]。PTX@HSA-RA表現(xiàn)出較游離PTX更強的HepG2-MTCSs生長抑制作用，這可能是由于PTX@HSA-RA具備一定的腫瘤深部滲透能力，可以攜帶藥物向 HepG2-MTCSs 中心遞送而不是僅分布在其外表面，從而促進 PTX 對 HepG2-MTCSs 生長的抑制作用，最終導致3D細胞結(jié)構(gòu)完整性的破壞。盡管PTX@HSA-RA作用4 d后HepG2-MTCSs的結(jié)構(gòu)并未被完全破壞，但該結(jié)果仍提示PTX@HSA-RA具有提高PTX體內(nèi)抗腫瘤活性的潛力。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了以RA修飾白蛋白為載體的PTX白蛋白納米給藥系統(tǒng)PTX@HSA-RA，并證實其具有較好的生物相容性和較高的包封率與載藥量，可對PTX進行緩釋且具有一定的pH值敏感性，可被HepG2 細胞快速、持續(xù)攝取而實現(xiàn)PTX的胞內(nèi)遞送，相較游離PTX表現(xiàn)出更強的體外細胞毒性和HepG2-MTCSs生長抑制作用，是一種具有良好研究應(yīng)用潛力的抗腫瘤藥物遞送系統(tǒng)。后續(xù)研究中將結(jié)合動物實驗對PTX@HSA-RA的體內(nèi)抗腫瘤效果進行進一步研究，以期為肝癌治療提供一種新型高效的給藥途徑。