盛 慧,趙智輝

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物化學(xué)與生物制品研究所,江蘇省分子與醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點實驗室,江蘇 南京 210023)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)作為一種常見的消化道惡性腫瘤之一,根據(jù)2018年中國癌癥統(tǒng)計的結(jié)果顯示,中國結(jié)直腸癌發(fā)病數(shù)占全球24.3%,死亡數(shù)占全球22.9%,并呈逐年上升趨勢[1]. 由于臨床表現(xiàn)不典型,多數(shù)結(jié)直腸癌患者在初診時已經(jīng)發(fā)展為局部晚期或晚期,導(dǎo)致治愈率和生存率較低[2-3],目前的主要治療手段并不能使大多數(shù)患者顯著獲益[4-5]. 伴隨免疫學(xué)和腫瘤學(xué)發(fā)展,腫瘤免疫療法已成為治療癌癥的新趨勢,主要有癌癥疫苗、細胞療法、細胞因子和免疫檢查點抑制劑治療[6-8]. 腫瘤疫苗具有副作用少、抗腫瘤特異性強等諸多特點,在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)方面也具有優(yōu)勢[9-11]. 開發(fā)治療性腫瘤疫苗的關(guān)鍵是確定抗原,理想的抗原應(yīng)具有較強腫瘤特異性的新抗原,能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的抗腫瘤T細胞反應(yīng). 但是,由于鑒定具有免疫原性的腫瘤新抗原以及相應(yīng)的腫瘤疫苗研制周期和成本等問題,很難造福晚期腫瘤患者[12]. DCs是自然界中已發(fā)現(xiàn)的功能最強大的抗原提呈細胞(antigen presenting cells,APC),也是唯一能夠活化初始型T細胞的APC,其表面分子能夠處理提呈腫瘤細胞,分泌多種細胞因子,是特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)的始動者[13-14]. 同時,細胞表面的免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)Fcγ 受體(Fc gamma receptors,FcγRs)通過介導(dǎo)抗原-抗體免疫復(fù)合物與免疫細胞及其他細胞間的相互作用,引起多種免疫應(yīng)答[15-16]. 腫瘤細胞膜上糖鏈的高度唾液酸化修飾會使得腫瘤細胞黏附、侵襲、遷移等多種功能發(fā)生變化[17-19]. 另外,利用生物正交反應(yīng)將兩種可以發(fā)生特異性反應(yīng)的化學(xué)基團分別修飾待綴合的分子,兩種標記后的分子可以在接近生理條件下通過正交基團共價結(jié)合[20-22]. 從研究策略上,將特定的激活性吞噬受體的配體和廣譜腫瘤抗原直接綴合.

基于此,本研究課題通過構(gòu)建重組表達載體pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker,表達出可以靶向DCs表面激活性吞噬受體FcγRI的融合蛋白mlgG1Fc,接著,進行化學(xué)修飾,使其標記上炔烴,再N3-TAg進行點擊反應(yīng),制備出個性化且可以靶向DCs的結(jié)直腸癌腫瘤疫苗.

1 材料與方法

1.1 主要試劑

F-12K培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基購自Gibco,抗生素(Penicillin-Streptomycin Mixed solution(100×))購自北京博奧森生物科技公司,RPMI Medium Modified培養(yǎng)基購自Hyclone公司,胎牛血清購自康源生物,0.25%細胞胰酶消化液購自碧云天公司,蛋白Marker購自南京思科捷公司,Lipofectamine 2000購自 Invftrogen 公司,蛋白酶抑制劑購自Bimake公司,Protein G 4ff chromatography column購自翊圣生物,BCA試劑盒、Protein A+G beads、Rabbit Anti-Goat IgG(H+L)-HRP、IGF-1R Polyclonal Antibody、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)-HRP均購自南京Bioworld公司,Goat IgG anti-Mouse IgG1(Fc)antibody購自德國Dianova公司,Click-iT? DIBO-amine、Alexa Fluor? 488 Azide(Alexa Fluor? 488 5-Carboxamido-(6-Azidohexanyl),Bis(Triethyl ammonium Salt)),5-isomer購自Thermo fisher,構(gòu)建質(zhì)粒所需試劑均由南京Bioworld提供,結(jié)合緩沖液、RIPA裂解液均由本實驗室配制,tetraacetylated N-Azidoacetyl-D-Mannosamine(Ac4ManNAz)由北京大學(xué)藥學(xué)院李中軍教授課題組合成.

1.2 主要方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

小鼠CT26.WT結(jié)直腸癌細胞株(購自武漢普若賽)在37 ℃、5%CO2條件下,用含10%FBS和1×抗生素的RPMI Medium Modified培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng).

CHO-K1細胞株(購自上海中國科學(xué)院細胞庫)在37 ℃、5%CO2條件下,用含10%FBS和1×抗生素的 F-12K培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng).

1.2.2 pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker的構(gòu)建

從Uniprot和NCBI數(shù)據(jù)庫調(diào)取小鼠IgG1Fc基因編碼序列和蛋白序列,進行比對分析.選用編碼序列與Linker序列以及信號肽序列進行拼接,同時在拼接片段兩端加上與表達載體克隆位點相應(yīng)的酶切位點序列(包含保護堿基),設(shè)計一對含KpnI(5′-GGTACC-3′),EcoRI(5′-GAATTC-3′)酶切位點的PCR引物,用以亞克隆mlgG1Fc-linker基因序列.

上游引物:5′-AAACGACACCCCCATCTGTC-3′,

下游引物:5′-ATGGTGAGCACATCCTTGGG-3′.

PCR擴增含酶切位點的mlgG1Fc-linker基因,將正確大小的目的條帶割膠后進行純化回收,通過瓊脂糖凝膠電泳實驗來鑒定回收片段. 將正確大小的回收產(chǎn)物和pcDNA3.1(+)表達載體進行雙酶切反應(yīng),T4連接酶連接pcDNA3.1載體及目的片段. 將已構(gòu)建的重組表達載體pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌,涂布于含抗生素的LB板子上,于37 ℃振蕩搖床上培養(yǎng)12 h,用槍頭挑取單克隆菌落,經(jīng)小提后的質(zhì)粒送至公司測序,測序結(jié)果與設(shè)計的目的基因片段進行序列比對分析,將構(gòu)建的重組表達載體命名為pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker.

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳

稱取0.2 g瓊脂糖于錐形瓶中,加入20 mL 1×TAE電泳緩沖液,放置微波爐里加熱煮沸,共3次,再加入1 μL核酸染料,將緩沖液轉(zhuǎn)移至凝膠板中,裝上梳子,凝固后,將質(zhì)粒DNA樣品、DNA Marker按照合適的順序進行上樣,125 V電泳25 min,將電泳結(jié)束后的凝膠置于成像儀中觀察實驗結(jié)果.

1.2.4 mlgG1Fc-linker的表達

按DNA質(zhì)量與Lipo2000體積比9 μg∶20 μL,將pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker轉(zhuǎn)染CHOK1細胞,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)6 h后,更換新鮮的F-12K完全培養(yǎng)基,分時段收集細胞培養(yǎng)上清液,加入1/100體積的蛋白酶抑制劑,保存于-80 ℃冰箱中.

1.2.5 mlgG1Fc-linker的純化

收集一定量表達mlgG1Fc的CHOK1細胞培養(yǎng)液上清,按上清液量加入1/10體積的1 mmol/L Tris-HCI(pH 8.5)的緩沖液,調(diào)節(jié)樣品pH值至偏堿性. 連接蠕動泵和Protein G 4FF Chromatography Column預(yù)裝柱,依次進行上樣、PBST洗雜、Glycine-HCI洗脫、中和液中和,將含有目的蛋白mlgG1Fc的洗脫液進行BCA定量后,保存于-80 ℃冰箱中.

1.2.6 在固相系統(tǒng)中完成對mlgG1Fc化學(xué)標記

取80 μL Protein A+G beads于0.6 mL EP管中,4 ℃,2 000 rpm離心3 min. 將其均分至2個0.6 mL EP管中,一管作為實驗組,加入50 μg mlgG1Fc蛋白;另外一管作為對照組,4 ℃振蕩孵育4 h. 棄上清,200 μL活化緩沖液清洗Protein A+G beads 2次,加入活化緩沖液400 μL,4 ℃,振蕩孵育2 h. 離心,保留少量液體,并定量. 取出 EDAC和 NHSS儲備液,室溫融化,渦勻. 吸2 μL EDAC和2 μL NHSS加到上述0.6 mL EP管中,補加活化緩沖液至液體終體積100 μL(EDAC終濃度為2 mmol/L,NHSS終濃度為5 mmol/L),渦旋混勻,置于冰上活化1 h. 向上述100 μL溶液中加 200 μL偶聯(lián)緩沖液,振蕩,4 ℃,2 000 rpm離心3 min,重復(fù)3次. 加入偶聯(lián)緩沖液400 μL,4 ℃,振蕩孵育2 h. 4 ℃,2 000 rpm離心3 min,保留液體,并定量. 加入3 μL Click-iT? DIBO-amine,補加偶聯(lián)緩沖液使得溶液的終體積為100 μL,(Click-iT? DIBO-amine終濃度為1.8 mmol/L),輕輕渦旋,4 ℃反應(yīng)過夜. 交聯(lián)結(jié)束的反應(yīng)液,加入200 μL DPBS,4 ℃,2 000 rpm離心3 min,棄上清,重復(fù) 3次,使Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO 終體積約50 μL.

各取5 μL Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO于PCR管中. 加入1 μL Alexa Fluor? 488 Azide(終濃度約100 μmol/L). 4 ℃,避光反應(yīng)1 h. 加入200 μL DPBS,4 ℃,2 000 rpm離心3 min,棄上清,重復(fù)3次. 取Protein A+G beads置于96孔板中,在熒光顯微鏡下觀察實驗現(xiàn)象及采集圖像.

1.2.7 制備疊氮化腫瘤抗原

收集CT26.WT結(jié)直腸癌細胞,進行計數(shù),按細胞4×106個/mL接種于10 cm培養(yǎng)皿中,取5.825 mL細胞培養(yǎng)基于15 mL離心管中,加入175 μL 20 mmol/L Ac4ManNAz充分混勻(Ac4ManNAz終濃度為0.5 mmol/L),加至10 cm培養(yǎng)皿中,于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h. 次日更換新培養(yǎng)基,即棄掉細胞培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基,加7 mL含700 μL 20 mmol/L Ac4ManNAz的細胞培養(yǎng)基(Ac4ManNAz終濃度為2 mmol/L),于37 ℃、5%CO2條件下再培養(yǎng)24 h.

1.2.7.1 N3-TAg與Alexa Fluor? 488 Azide的結(jié)合

向培養(yǎng)皿中加終濃度為5 μmol/L的Alexa Fluor? 488 Azide. 室溫,避光反應(yīng)1 h. DPBS清洗細胞3次,熒光顯微鏡下觀察并采集圖像.

1.2.7.2 N3-TAg的獲得

待細胞密度達90%時,棄培養(yǎng)基,1×PBS清洗細胞2次,加入 1 mL RIPA裂解液和10 μL蛋白酶抑制劑于細胞培養(yǎng)皿中,冰上裂解0.5 h,每隔10 min晃動培養(yǎng)皿一次,收集細胞裂解液于1.5 mL EP管中,4 ℃、12 400 rpm離心11 min,收集上清,加入10倍體積的冰乙醇沉淀N3-TAg,置于-80 ℃冰箱中,靜置過夜.

1.2.8 mlgG1Fc-DIBO與N3-TAg的生物正交反應(yīng)

次日,取出醇沉蛋白N3-TAg,4 ℃、12 500 rpm離心10 min. 棄掉冰乙醇上清,并清洗蛋白沉淀一次,置于冰上,待乙醇揮發(fā)干凈,每管用100 μL的結(jié)合緩沖液復(fù)融N3-TAg,將溶于結(jié)合緩沖液中的N3-TAg 在高溫下變性6 min,立即置于冰上5 min,加入蛋白酶抑制劑,渦旋混勻.

將N3-TAg加入1.2.6步驟的Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO中,渦旋混勻,室溫,振蕩孵育1 h,用200 μL DPBS清洗Protein A+G beads,4 ℃,2 000 rpm離心3 min,重復(fù)3次. 50 μL 1×Loading Buffer重懸Protein A+G beads,99 ℃煮樣6 min,4 ℃、12 500 rpm離心3 min,上樣,進行免疫印跡檢測,由此確定生物正交反應(yīng)的發(fā)生.

1.2.9 免疫印跡

配置15%的上層膠和4%的下層膠,樣品與loading buffer 按比例混合,99 ℃煮樣6 min,4 ℃、12 500 rpm離心3 min,上樣,調(diào)電壓至85 V電泳約30 min,蛋白Marker分開后,調(diào)電壓至135 V繼續(xù)電泳約1 h,直至溴酚藍散去. 轉(zhuǎn)膜后,在冰浴恒流條件下270 mA電泳1.5 h. 轉(zhuǎn)膜完成后,將PVDF膜浸于封閉液中,室溫振蕩封閉2 h后,敷一抗,4 ℃恒溫振蕩孵育12 h,洗膜后加入二抗,室溫振蕩孵育1.5 h,將顯色液加至PVDF膜表面,使用Tanon 5200 Multi多功能成像系統(tǒng)顯色并采集圖片.

2 結(jié)果與討論

2.1 mlgG1Fc的表達與鑒定

將目的基因mlgG1Fc-linker克隆到pcDNA3.1(+)表達載體上,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker,質(zhì)粒圖譜如圖1-A所示. 將構(gòu)建出的重組表達載體pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌,質(zhì)粒小提后送至公司進行測序,同步,進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,由實驗結(jié)果可知,在6 500 bp左右處有明顯的目的條帶,如圖1-B,構(gòu)建的重組質(zhì)粒與設(shè)計重組質(zhì)粒大小吻合,由此說明已成功構(gòu)建出重組表達載體pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker.

A:重組表達載體pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker圖譜;B:pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker的瓊脂糖凝膠電泳,M:DL1500 DNA Marker;1:pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker圖1 pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker的構(gòu)建Fig.1 Construction of pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker

用pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞,分時段收集細胞培液上清,使用Protein A+G beads負載目的蛋白,通過細胞裂解,分析蛋白表達情況,結(jié)果如圖2所示,收集的培液上清、使用Protein A+G beads富集后的洗脫液和裂解液中均含有目的條帶,分子量約為55 kDa.

pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞,分時段(24 h、48 h)收集培液上清,免疫印跡檢測培液上清、經(jīng)Protein A+G beads負載后的培液上清和裂解液中pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker的表達.圖2 mlgG1Fc的表達Fig.2 Expression of mlgG1Fc

為了鑒定表達收集的mlgG1Fc能否在固相系統(tǒng)中完成DIBO化學(xué)標記,首先使用Protein A+G beads負載mlgG1Fc,經(jīng)活化和偶聯(lián),再與Click-iT? DIBO-amine反應(yīng),使用Alexa Fluor? 488 Azide熒光檢測二者的結(jié)合. 實驗結(jié)果如圖3,相對于對照組來說,實驗組中可以看到很強的熒光,說明結(jié)合有Protein A+G beads的mlgG1Fc成功與Click-iT? DIBO-amine發(fā)生化學(xué)反應(yīng),即證明收集的mlgG1Fc已在固相系統(tǒng)中完成化學(xué)修飾.

取兩組等量的Protein A+G beads,其中一組Protein A+G beads與mlgG1Fc 4 ℃振蕩下孵育4 h,兩組Protein A+G beads分別經(jīng)活化和偶聯(lián)后,再與Click-iT? DIBO-amine 4 ℃反應(yīng)過夜. 最后,再與Alexa Fluor? 488 Azide 4 ℃,避光反應(yīng)1 h. 利用熒光顯微鏡對比兩組實驗中的熒光強度.圖3 Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO與Alexa Fluor? 488 Azide 的結(jié)合Fig.3 The binding of Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO and Alexa Fluor? 488 Azide

2.2 疊氮化腫瘤抗原的制備

經(jīng)疊氮基團修飾的非天然糖能夠通過糖摻入途徑進入到腫瘤細胞膜表面的唾液酸化修飾位點,從而獲得N3-TAg. 在之前的研究中,已證實使用終濃度為0.5 mmol/L Ac4ManNAz與CT26.WT細胞共培養(yǎng) 24 h,再使用終濃度為2 mmol/L Ac4ManNAz與其共培養(yǎng)24 h,通過裂解細胞可以獲得N3-TAg. 利用FITC標記的AIkyne,通過免疫熒光技術(shù)考察腫瘤細胞表面疊氮化修飾的情況. 結(jié)果如圖4所示,實驗組有熒光且非常強烈,而對照組沒有熒光,這表明Ac4ManNAz能通過細胞糖代謝途徑摻入到CT26.WT細胞表面含唾液酸的糖蛋白上,使糖蛋白帶上疊氮基團.

將終濃度為0.5 mmol/L Ac4ManNAz與CT26.WT細胞共培養(yǎng)24 h,再用終濃度為2 mmol/L Ac4ManNAz共培養(yǎng)24 h. 利用FITC標記的AIkyne,熒光顯微鏡觀察兩組的熒光強度.圖4 免疫熒光檢測Ac4ManNAz代謝摻入Fig.4 Immunofluorescence detection of Ac4ManNAz metabolic incorporation

2.3 生物正交反應(yīng)

收集Ac4ManNAz代謝摻入的腫瘤細胞蛋白溶液,與Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO室溫振蕩孵育1 h,Western blot檢測兩者結(jié)合情況,實驗結(jié)果如圖5所示. 從圖中可以看出,A實驗組有目的條帶,說明N3-TAg與mlgG1Fc-DIBO通過生物正交反應(yīng)綴合在一起.

將收集的N3-TAg投入到Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO中,渦旋混勻,室溫,振蕩孵育1 h,DPBS清洗Protein A+G beads 3次,1×Loading Buffer 重懸Protein A+G beads,99 ℃煮樣6 min,4 ℃、12 500 rpm離心3 min,上樣,進行免疫印跡檢測.圖5 N3-TAg與mlgG1Fc-DIBO的生物正交反應(yīng)Fig.5 Bio-orthogonal reaction of N3-TAg and mlgG1Fc-DIBO

3 結(jié)論

隨著我國惡性腫瘤發(fā)病率逐年上升,在傳統(tǒng)療法收效甚微時,腫瘤免疫治療為腫瘤患者帶來了福音[23-24]. 腫瘤免疫治療的原理是通過啟動機體免疫系統(tǒng),克服腫瘤免疫逃逸機制,增強腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫力來清除癌細胞,其具有安全性高、耐受性好,極少出現(xiàn)不良反應(yīng)等特點. 目前,腫瘤免疫治療是除外科手術(shù)、化療和放療以外最重要的治療腫瘤的方法[25-26].

在本課題中,首先利用分子生物學(xué)手段成功構(gòu)建并表達出可以靶向FcγRI的融合蛋白mlgG1Fc. 與此同時,為了解決鑒定新抗原難度大、耗時耗力等瓶頸問題,將廣譜全腫瘤抗原通過激活性內(nèi)吞受體途徑遞送給APC,從而實現(xiàn)腫瘤抗原的靶向遞送,更有利于激發(fā)廣泛、特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答. 此外,Ac4ManNAz通過代謝摻入標記CT26.WT結(jié)直腸癌細胞抗原的唾液酸修飾位點,封閉修飾在腫瘤抗原糖鏈上的唾液糖殘基,阻止腫瘤抗原通過抑制性途徑進入機體,避免腫瘤免疫耐受[27-29]的形成.

為了評價制備出靶向DCs的結(jié)直腸癌腫瘤疫苗的療效,需進行體內(nèi)和體外實驗. 在體外實驗中,還需進一步檢測不同腫瘤抗原對DCs表型、共刺激分子表達的影響,經(jīng)抗原致敏后的DCs對淋巴細胞增殖情況以及對小鼠結(jié)直腸癌腫瘤細胞的體外殺傷作用. 在體內(nèi)實驗中,還需進一步驗證腫瘤疫苗對荷瘤小鼠的預(yù)防和治療效果. 總而言之,本研究為制備新型結(jié)直腸癌腫瘤疫苗提供了新的開發(fā)方法和新的理論依據(jù),與此同時,也為下一步體內(nèi)和體外實驗的開展打下了堅實的基礎(chǔ)[29].