劉春苗 孟雁欣 張志敏 楊揚(yáng) 王亞男 張海娟

脊髓肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)因脊髓前角α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化變性引起的一組以緩慢進(jìn)行性加重肌無(wú)力、肌萎縮為主要臨床特征的常染色體隱性遺傳性骨骼肌疾病，繼杜興型肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)之后第二常見(jiàn)嬰幼兒致死性骨骼肌遺傳病[1,2]。研究指出 95% 因 SMN1 純合缺失(“0+0”型)致病，5% 因SMN1復(fù)合雜合突變(“0+1”型)致病[3]。部分研究證實(shí)白種人群中存在雙等位基因均為微小變異致病[4]。因此，SMN1雙等位基因致病性變異作為SMA發(fā)病機(jī)制，也是診斷SMA金標(biāo)準(zhǔn)。SMN2與SMN1序列具有高度同源性且均分布在5q13.2，作為公認(rèn)的SMA修飾因子，研究指出患者攜帶 SMN2 拷貝數(shù)越多表型越輕，盡管其與表型的相關(guān)性不完全一致，但國(guó)內(nèi)外SMA管理共識(shí)中仍將SMN2 拷貝數(shù)作為 SMA 診斷的標(biāo)準(zhǔn)步驟之一[5]。全美醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)(american college of medical genetics,ACMG)早在2008年即推薦將SMA攜帶者/產(chǎn)前篩查納入常規(guī)孕前檢查項(xiàng)目，并建議對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)夫婦妊娠胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷或植入前診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)[6]。本研究基于SMA分子致病特征，將高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)作為SMN1/SMN2拷貝檢測(cè)手段，同時(shí)聯(lián)合一代測(cè)序技術(shù)對(duì)患者序慣性進(jìn)行點(diǎn)突變檢測(cè)，以證實(shí)DHPLC聯(lián)合一代測(cè)序技術(shù)在脊髓肌萎縮癥攜帶者/產(chǎn)前篩查中有重要臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年1月至2019年1月因孕前篩查于石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診患者3 544例，其中男1 399例，女2 145例。簽署知情同意書，抽取外周血3 ml。

1.2 分子生物學(xué)分析

1.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增：抽取3 ml外周血，天根DNA提取試劑盒獲得基因組DNA，NanoDrop1000微量核苷酸蛋白多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Gene公司)定量分析(OD260/OD280比值1.8～2.0)，-80℃保存余DNA樣本。Prime 6 軟件設(shè)計(jì)引物，覆蓋SMN1/KRIT1/CYBB全長(zhǎng)，包括目的基因片段各個(gè)外顯子及與內(nèi)含子交界區(qū)，Pubmed blast比對(duì)引物。KRIT1/CYBB為內(nèi)參基因。PCR擴(kuò)增參數(shù)：95℃ 10 min熱啟動(dòng)預(yù)變性，95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 60 s，共25個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸 10 min。2% 瓊脂糖凝膠電泳，100 V，30 min。見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增片段及引物序列

1.2.2 DHPLC分析：樣本完成PCR擴(kuò)增進(jìn)行DHPLC檢測(cè)。5 μl PCR 反應(yīng)樣本上機(jī)(美國(guó)環(huán)球基因公司)，選擇類型DS Multiple Fragment，溫度50℃，上樣、洗脫。應(yīng)用儀器自帶軟件計(jì)算SMN1/KRIT1比值，SMN1/KRIT1等于0純合缺失，雜合缺失或攜帶為0.5，正常人為1。以SMN1/KRIT1 比值作為校正系數(shù)，所有比值按照校正系數(shù)進(jìn)行比對(duì)后得出數(shù)據(jù)。

1.2.3 SMN1 測(cè)序分析：美國(guó)ABI 3730XL(Applied Biosystems,Foster City,CA)自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。Sequencher v4.90 (Gene Codes,Ann Arbor,MI,USA) 比對(duì)分析，致病變異位點(diǎn)進(jìn)行家系成員靶向檢測(cè)分析。分析變異序列與疾病表型有無(wú)共分離現(xiàn)象，進(jìn)行基因變異位點(diǎn)定位、明確氨基酸變化及功能改變。

2 結(jié)果

2.1 3 544 DHPLC結(jié)果 3 544例攜帶者檢測(cè)樣本中，共檢測(cè)出63例攜帶者，包含男33例，女30例，拷貝缺失攜帶者檢出率1.78%。我們進(jìn)一步對(duì)63例SMA攜帶者配偶進(jìn)行SMN1檢測(cè)，測(cè)得SMN1變異11例。SMN1缺失變異攜帶者9例(SMN1∶SMN2=1∶1)，SMN1轉(zhuǎn)換成SMN2 2例(SMN1∶SMN2=1∶3)。見(jiàn)圖1。

圖1 DHPL檢出SMN1缺失攜帶者；A SMN1∶SMN2為1∶1;B SMN1∶SMN2為1∶2; D SMN1∶SMN2=1∶3; SMN1∶SMN2=1∶0

2.2 Sanger測(cè)序結(jié)果 SMN1 缺失分析檢測(cè)后，對(duì)3 544 例樣本進(jìn)行SMN1 靶向測(cè)序分析，通過(guò)分析明確2例樣本為SMN1點(diǎn)突變變異攜帶者。經(jīng)Sequence 4.90及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析證實(shí)1例為p.Q164X為致病突變攜帶者，對(duì)其配偶分別進(jìn)行SMN1拷貝缺失及點(diǎn)突變檢測(cè)未見(jiàn)異常。余1例為5號(hào)內(nèi)含子位置SNP位點(diǎn)，數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)無(wú)顯著致病意義。其他3 542例被檢樣本未檢出致病意義明確變異位點(diǎn)。見(jiàn)表2，圖2、3。

表2 受檢人群、配偶及產(chǎn)前診斷胎兒 SMN1∶SMN2 基因型統(tǒng)計(jì) 例

圖2 SMN1 exon4發(fā)生:p.Q164X(C>T)變異，編碼氨基酸堿基提前終止

圖3 SMN1 5 號(hào)內(nèi)含子 (第5外顯子下游 59 位：基因組(Hg19)為：chr 5:70,240,639)存在 1 個(gè) SNP(rs754465849)

2.3 產(chǎn)前診斷檢測(cè)結(jié)果 夫婦雙方知情同意并簽署知情同意書后，我們對(duì)11對(duì)夫婦雙方均為SMN1攜帶者胎兒于孕18周進(jìn)行胎兒羊水染色體檢查。測(cè)得2例胎兒SMN1純合缺失，即SMA患者，1例胎兒缺失變異攜帶者SMN1∶SMN2=1∶1，1例胎兒為SMN1(p.Q164X)變異點(diǎn)突變攜帶者。余胎兒檢出結(jié)果未見(jiàn)異常。后期隨訪過(guò)程中，我們分別對(duì)11例高危胎兒隨訪，2例SMN1純合缺失胎兒夫婦選擇雙方終止妊娠。余胎兒分娩后未見(jiàn)顯著異常。

2.4 不同SMN1∶SMN2基因變異攜帶者比較 不同SMN1∶SMN2比例攜帶者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，證實(shí)SMN1∶SMN2=1∶1最為常見(jiàn)，與其他組別比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 不同SMN1∶SMN2基因變異攜帶者檢出率比較 n=78,例(%)

3 討論

3.1 DHPLC應(yīng)用于SMA攜帶者篩查中的優(yōu)勢(shì) SMA是嬰幼兒死亡最常見(jiàn)常染色體隱性神經(jīng)骨骼肌遺傳疾病，臨床多依據(jù)臨床表型、心肌酶、肌電圖及骨骼肌活檢進(jìn)行初步診斷，由于缺乏特異性表型特征而多出現(xiàn)誤診、漏診等情況[7]。與臨床診斷依據(jù)比較，SMA基因檢測(cè)因特異性強(qiáng)且取材方便的特征，逐漸被廣大臨床醫(yī)生及受檢者接受。迄今，已報(bào)道的SMA基因檢測(cè)方法眾多，如最早的單基因靶向測(cè)序技術(shù)、多重連接依賴性探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)、短片段多重定量PCR(QMMPSF)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)、聚合酶鏈?zhǔn)较拗菩蚤L(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)(PCR-RFLP)、變性DHPLC等分子檢測(cè)技術(shù)，此外，近年高分辨溶解曲線技術(shù)(HRMA)及液相微珠陣列技術(shù)(liquid microbead arrays)等也逐步開(kāi)始應(yīng)用于臨床檢測(cè)分析[8-10]。已知的上述技術(shù)手段不同程度的存在消耗成本高、耗時(shí)、點(diǎn)突變變異不靈敏、漏診、誤診率高等問(wèn)題，因此很難完全在臨床廣泛開(kāi)展。

DHPLC技術(shù)作為高通量、自動(dòng)化基因突變檢測(cè)技術(shù)極具代表性，最早多應(yīng)用于癌癥靶點(diǎn)、藥物研發(fā)等領(lǐng)域，與其他測(cè)序技術(shù)相比較，不需要制備凝膠，且具備全自動(dòng)、高效、快速、準(zhǔn)確、省時(shí)省力、成本低等特點(diǎn)。伴隨分子技術(shù)向臨床應(yīng)用的廣泛轉(zhuǎn)化，DHPLC技術(shù)逐漸應(yīng)用于小片段外顯子缺失檢測(cè)。本研究應(yīng)用DHPLC對(duì)3 544例樣本進(jìn)行SMA攜帶者篩查，共檢出61例缺失變異攜帶者，檢出率約為1.72%。既往研究指出SMA攜帶者基因型變異主要分4種：[0+1]型、[2+0]型、[1+1d]及[2+1d]型，肯定攜帶者人群中以[1+0]型最為常見(jiàn)，即一條染色體SMN1等位基因正常而另一條染色體SMN1缺失的等位基因最為常見(jiàn)[10]。我們檢出的攜帶者中均為[0+1]型，這與既往龔波章等[11]報(bào)道一致。

SMN1與SMN2堿基序列同源性高達(dá) 99%,由于二者且均分布在5q13.2，因此SMN1與SMN2間基因拷貝數(shù)可以相互轉(zhuǎn)化并參與SMA疾病表型，即SMN2拷貝數(shù)增加可以減輕SMA臨床表型[12]。通過(guò)檢測(cè)SMN1及SMN2 拷貝數(shù)可從基因型及臨床表型兩方面綜合評(píng)估SMA形成緣由及臨床表型嚴(yán)重程度，而SMN1及SMN2 拷貝數(shù)變異比值的明確也可為遺傳咨詢提供依據(jù)。DHPLC技術(shù)除定性分析外，亦能通過(guò)確定SMN1與SMN2比值進(jìn)行定量分析。我們研究中61例拷貝缺失變異攜帶者中，31例SMN1∶SMN2 =1∶1，11例 SMN1∶SMN2 =1∶2。DHPLC還明確檢測(cè)出17例攜帶者為SMN1轉(zhuǎn)換成SMN2(SMN1∶SMN2=1∶3)及2例攜帶者SMN1∶SMN2=1∶0。

基于上述攜帶者檢測(cè)基礎(chǔ)，我們同時(shí)對(duì)61例缺失攜帶者配偶進(jìn)行SMN變異檢測(cè)，測(cè)得11例SMN1變異[9例(SMN1∶SMN2=1∶1]；2例(SMN1∶SMN2=1∶3)。以DHPLC對(duì)上述夫婦雙方均為攜帶者高危胎兒進(jìn)行SMN檢測(cè)分析，檢測(cè)結(jié)果證實(shí)2例胎兒為SMN1 純合缺失，1例胎兒缺失變異攜帶者SMN1∶SMN2=1∶1。由此不難發(fā)現(xiàn)DHPLC對(duì)SMA攜帶者篩查或產(chǎn)前診斷均有重要意義，可有效減少相關(guān)患兒的出生[13]。

3.2 DHPLC聯(lián)合一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)應(yīng)用于SMA攜帶者篩查的必要性及優(yōu)勢(shì) SMA 患者95%因SMN1外顯子7/8純合缺失致病，5% SMN1點(diǎn)突變與缺失復(fù)合雜合致病[14]，提示點(diǎn)突變檢測(cè)對(duì)SMN必不可少。盡管DHPLC對(duì)拷貝缺失變異檢測(cè)極為靈敏，但技術(shù)上仍有不足之處，如對(duì)PCR要求高，不能直接檢測(cè)出純合突變，只能提供個(gè)體樣本無(wú)突變信息，但無(wú)法得出具體突變類型。因此，對(duì)點(diǎn)突變變異檢測(cè)常會(huì)出現(xiàn)漏診或誤診的可能[15]。一代測(cè)序技術(shù)作為單基因疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，以單基因單變異作為檢測(cè)靶點(diǎn)，檢測(cè)靈敏度、特異性毋庸置疑，且同樣具備省時(shí)低成本的優(yōu)勢(shì)[16]。本研究技術(shù)聯(lián)合中依據(jù)SMA分子致病特點(diǎn)，選擇一代測(cè)序技術(shù)作為聯(lián)合方法對(duì)樣本進(jìn)行SMN1點(diǎn)突變變異分析。研究檢出1例樣本攜帶SMN1 p.Q164X，1例樣本發(fā)生SMN 1 多態(tài)性變異位點(diǎn)。因此本研究共計(jì)檢出62例SMA攜帶者，DHPLC與一代測(cè)序技術(shù)的聯(lián)合使攜帶者檢出率由1.72%提高至1.75%，一定程度上提高了SMA攜帶者檢出率。我們以同樣的技術(shù)聯(lián)合方式對(duì)夫婦雙方均為攜帶者的高危胎兒進(jìn)行SMA產(chǎn)前診斷篩查，測(cè)得2例胎兒為SMA患者及2例攜帶者[1例胎兒缺失變異攜帶者SMN1∶SMN2=1∶1，1例胎兒為SMN1(p.Q164X)變異點(diǎn)突變攜帶者]。再次提示SMA攜帶者篩查的重要性及技術(shù)聯(lián)合的必要性。

3.3 河北地區(qū)SMN1攜帶者變異特征 研究數(shù)據(jù)指出SMA人群攜帶率1/100～1/45，亞洲人群攜帶率約1/48，SMA患者同胞攜帶率為66.67%，發(fā)病無(wú)性別差異[2]。本研究3 544例樣本共計(jì)檢測(cè)出62例(61例缺失變異帶+1例點(diǎn)突變變異)SMN1變異為致病攜帶者，人群攜帶率約1.75%，與我國(guó)宋昉[4]報(bào)道北方人群1/60攜帶率一致。但低于既往報(bào)道的上海、香港、臺(tái)灣等南方地區(qū)人群攜帶率，提示SMA除具有較高人群攜帶率外還存在較強(qiáng)的南北地區(qū)差異性[17]。我們檢出62例攜帶者中約98.38%為缺失攜帶，男女比例1∶1,證實(shí)河北地區(qū)SMA攜帶不存在男女性別差異。

綜上所述，SMA分子診斷對(duì)于預(yù)防及減少此類患兒出生有重要意義，規(guī)范、精準(zhǔn)SMA攜帶篩查流程建立可有效降低缺陷患兒出生，也是實(shí)現(xiàn)SMA二級(jí)預(yù)防的有效途徑。同時(shí)技術(shù)聯(lián)合可顯著提高SMA攜帶者/患者檢出率，有效減少臨床誤診、漏診。