張順， 莊君龍， 邱雪峰， 金晶， 郭宏騫

前列腺癌是世界范圍內(nèi)男性發(fā)病率第二，病死率第五的癌種[1]。2015年我國(guó)腫瘤登記地區(qū)前列腺癌新發(fā)患者數(shù)超過(guò)6萬(wàn)人，位列男性惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)的第6位[2]。一項(xiàng)北上廣等地的調(diào)查研究顯示，我國(guó)54%前列腺癌初診患者有骨轉(zhuǎn)移或內(nèi)臟轉(zhuǎn)移[3]，發(fā)現(xiàn)即晚期因此錯(cuò)過(guò)根治手術(shù)時(shí)間[4-5]。最初的轉(zhuǎn)移性患者在初始治療階段都屬于轉(zhuǎn)移性激素敏感性前列腺癌(metastatic hormone sensitive prostate cancer, mHSPC)，但在內(nèi)分泌治療一段時(shí)間發(fā)生進(jìn)展后將轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC)?；颊咭坏┻M(jìn)入mCRPC階段，預(yù)后一般較差。因此，及時(shí)篩選出mHSPC階段不良預(yù)后患者，并采取更積極的治療，將有助于延長(zhǎng)患者生存期。

隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)已揭示了部分前列腺癌預(yù)后相關(guān)基因，如CDK12[6]、PTEN[7]、TP53[8]等。CDK12屬于細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白，可通過(guò)調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)相關(guān)基因來(lái)控制基因組穩(wěn)定性[6]。有研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)人CDK12突變的比例為15.4%[9]，顯著高于先前報(bào)道的高加索人的突變頻率5%～7%[10-12]。另外，相較于mHSPC，CDK12突變頻率在mCRPC患者當(dāng)中比例更高[6]。目前針對(duì)CDK12突變的研究大多屬于mCRPC階段。因此，探索中國(guó)人群中mHSPC患者的CDK12突變頻率，有助于明確其對(duì)mHSPC階段的預(yù)后作用。

本研究收集了91例mHSPC階段的患者，通過(guò)第二代測(cè)序NGS檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)分析患者的胚系和體系突變情況，篩選出有CDK12胚系或體系有害突變的患者，并對(duì)患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，通過(guò)患者進(jìn)展至mCRPC階段的時(shí)間分析CDK12突變的預(yù)后作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院泌尿外科2019年1月至2020年11月間臨床資料齊全且病理組織石蠟標(biāo)本能滿足基因檢測(cè)要求的91例病例，均為行前列腺癌穿刺活檢初診為mHSPC?；颊叽_診時(shí)年齡42～86歲，平均(68.35±6.80)歲。按照國(guó)際泌尿病理協(xié)會(huì)(ISUP)分級(jí)分組1組1例，2組3例，3組8例，4組41例，5組38例。臨床病理分期按照美國(guó)癌癥分期聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)確定，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M分期中M1a期22例， M1b期60例，M1c期9例。臨床治療方案以雄激素剝奪治療(androgen-deprivation therapy，ADT)為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療方案為主，主要包括ADT聯(lián)合比卡魯胺、ADT聯(lián)合醋酸阿比特龍及ADT聯(lián)合多西他賽。依據(jù)前列腺癌臨床試驗(yàn)工作組3(the Prostate Cancer Clinical Trials Working Group 3,PCWG3)的標(biāo)準(zhǔn)，收集患者從mHSPC進(jìn)展至mCRPC階段時(shí)間。

1.2 組織、血液樣本采集 組織樣本采集：收集mHSPC患者腫瘤穿刺組織1～2條或白片10～15片。血液標(biāo)本采集：使用 Streck采血管采集治療前≥10 ml外周血，采血后立即輕柔顛倒 10 次使血液與管內(nèi)成分混勻。

1.3 NGS測(cè)序法 采用Nanodrop 檢測(cè) DNA 的純度(OD260/280比值)；DNA的降解程度用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，并用該電泳同時(shí)判斷是否有蛋白質(zhì)以及RNA的污染；通過(guò)Qubit熒光計(jì)對(duì)DNA濃度進(jìn)行高靈敏度、高特異性以及高精確度的定量分析；利用破碎儀將基因組DNA進(jìn)行隨機(jī)打斷，打斷后的片段長(zhǎng)度在180～280 bp之間， 隨后對(duì)打斷的片段進(jìn)行末端修復(fù)以及加A尾，處理完畢后通過(guò)在片段的兩端連上接頭，進(jìn)而制備DNA文庫(kù)。構(gòu)建好文庫(kù)后，基因片段便帶有特異性標(biāo)簽。將生物素標(biāo)記的探針與index文庫(kù)進(jìn)行液相雜交，再加入帶鏈霉素的磁珠抓取雜交復(fù)合狀態(tài)的DNA，在洗脫緩沖液中洗脫目標(biāo)文庫(kù)，并得到基因組中的外顯子片段，通過(guò)PCR進(jìn)行線性擴(kuò)增，擴(kuò)增后再對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，檢測(cè)合格后上機(jī)測(cè)序。通過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)量、比對(duì)率、錯(cuò)誤率等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，進(jìn)而評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，判斷建庫(kù)測(cè)序是否達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)，如果符合標(biāo)準(zhǔn)則進(jìn)行后續(xù)的分析，不符合標(biāo)準(zhǔn)者重新建庫(kù)或加測(cè)。將高質(zhì)量的序列與人參考基因組進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)樣本中的變異信息，包括點(diǎn)突變、插入/刪除、拷貝數(shù)變異，并對(duì)檢出的變異進(jìn)行分析解讀。通過(guò)血液中白細(xì)胞的對(duì)照，同時(shí)分析胚系和體系突變情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用IBM SPSS Statistics 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析。其中正態(tài)分布的計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析組間差異。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以四分位數(shù)表示，采用秩和檢驗(yàn)分析組間差異。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)分析組間差異。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

因有研究顯示CDK12突變型患者進(jìn)展至mCRPC的中位時(shí)間在9～10個(gè)月，而CDK12野生型患者進(jìn)展至mCRPC的中位時(shí)間在13～18個(gè)月[6，13-14]。因此本研究將mHSPC患者初始治療后12個(gè)月內(nèi)是否進(jìn)展作為預(yù)后觀察指標(biāo)。CDK12是否突變與mHSPC患者是否在12月內(nèi)進(jìn)展為mCRPC的關(guān)系采用連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)分析。對(duì)mHSPC患者在12個(gè)月內(nèi)進(jìn)展至mCRPC的相關(guān)危險(xiǎn)因素進(jìn)行單因素及多因素Logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 NGS測(cè)序結(jié)果及CDK12突變型或野生型兩組患者基線資料 91例mHSPC患者中存在有害突變或臨床意義未明突變頻率排名前五的分別是FOXA1(31例，34.06%)，SPOP(19例，20.89%)，CDK12(19例，20.89%)，BRCA2(18例，19.78%)，TP53(16例，17.58%)(圖1)。19例CDK12突變患者中有11例檢測(cè)出胚系或體系的有害突變，突變頻率為12.09%。

注：圖中左側(cè)條狀列出了檢測(cè)到的所有突變基因及對(duì)應(yīng)的突變頻率，該頻率包括有害突變或臨床意義未明突變；圖中右側(cè)彩色方格代表突變形式，每例患者每個(gè)基因的突變形式都縱向體現(xiàn)在圖中的方格中；圖中上方對(duì)應(yīng)的是每例患者的突變密度圖1 91例 mHSPC患者的突變圖譜

兩組患者確診時(shí)候的年齡、前列腺特異性抗原(PSA)、ISUP分組、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M分期情況、隨訪時(shí)間及mHSPC期間治療情況比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 91例mHSPC患者的臨床信息

2.2 CDK12突變狀態(tài)與mHSPC患者進(jìn)展至mCRPC階段時(shí)間的關(guān)系 對(duì)91例mHSPC患者進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)CDK12突變型患者在12個(gè)月內(nèi)進(jìn)展至mCRPC的有7例，進(jìn)展率為63.64%(7/11)；CDK12野生型患者在12個(gè)月內(nèi)進(jìn)展至mCRPC的有18例，進(jìn)展率為22.50%(18/80)。CDK12突變狀態(tài)與mHSPC患者進(jìn)展至mCRPC階段的時(shí)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.278，P=0.012)。

2.3 其他臨床特點(diǎn)與進(jìn)展至mCRPC階段時(shí)間相關(guān)因素單因素和多因素分析 將表1中相關(guān)因素作為協(xié)變量，以mHSPC在12個(gè)月內(nèi)是否發(fā)生進(jìn)展作為因變量進(jìn)行Logistic回歸分析：CDK12突變型(OR=6.03，95%CI：1.59～22.93，P=0.015)及ISUP分組(OR=2.81，95%CI：1.23～6.92，P=0.013)是mHSPC患者在12個(gè)月內(nèi)發(fā)生進(jìn)展的獨(dú)立影響因素，具體參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 mHSPC進(jìn)展至mCRPC階段時(shí)間相關(guān)因素的Logistic回歸分析

3 討論

周期蛋白依賴(lài)性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)是調(diào)節(jié)幾個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞過(guò)程的重要激酶，可調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展和調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[6]。其中細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白12(cyclin-dependent kinase 12，CDK12)是轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因，由不同的功能結(jié)構(gòu)域組成：一個(gè)位于中心位置的結(jié)構(gòu)域，N-末端附近的幾個(gè)精氨酸/絲氨酸序列，以及一個(gè)富含脯氨酸的序列[15]。CDK12可以調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)基因在內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄，當(dāng)CDK12蛋白功能失活時(shí)，DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)缺陷，易引起基因融合增加和基因表達(dá)顯著差異，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，其變異頻率在CDK家族中是最高的[6]。實(shí)體瘤中，前列腺癌發(fā)生CDK12基因變異的頻率最高[6]，3%～7%的mCRPC患者存在CDK12基因突變[16]。本研究結(jié)果顯示，在中國(guó)人群mHSPC患者中，CDK12有害突變的頻率為12.09%。而高加索人在mCRPC階段CDK12的突變頻率僅為5～7%[10-12]。中國(guó)人群CDK12突變頻率是高加索人的1.7～2.4倍。另外，CDK12突變頻率在mCRPC患者中的比例要比mHSPC階段更高[6]。中國(guó)人群在CDK12突變頻率偏低的mHSPC階段的數(shù)據(jù)，都已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了高加索人在mCRPC階段的數(shù)據(jù)。由此可見(jiàn)，中國(guó)人群和高加索人在基因組學(xué)上存在較大差異，CDK12基因在中國(guó)人群中的突變頻率遠(yuǎn)高于外國(guó)人群。

目前CDK12在細(xì)胞中的具體作用機(jī)制還不完全清楚，但它在DDR通路中有著不可替代的作用[17]。據(jù)報(bào)道，CDK12 在維持同源重組修復(fù)轉(zhuǎn)錄活性、保持基因組穩(wěn)定性以及促進(jìn)DNA損傷修復(fù)過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。DNA 損傷累積和DDR破壞是惡性腫瘤的典型特征之一[18]，因此CDK12突變與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展緊密相關(guān)。目前已有不少研究顯示，CDK12突變與前列腺癌的不良預(yù)后相關(guān)。Nguyen等[6]將CDK12突變組患者與CDK12野生型患者相比，發(fā)現(xiàn)CDK12突變組患者從診斷轉(zhuǎn)移性前列腺癌開(kāi)始的總生存期較短，并且進(jìn)展至CRPC的時(shí)間較短。Warner等[13]將12例CDK12缺陷的患者與187例未檢測(cè)到胚系/體系CDK12缺陷的轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者相比，發(fā)現(xiàn)CDK12缺陷的患者從ADT開(kāi)始到CRPC進(jìn)展的時(shí)間顯著縮短，且在mCRPC一線新型內(nèi)分泌治療后的PSA進(jìn)展時(shí)間較短。且CDK12突變的患者進(jìn)展至mCRPC的中位時(shí)間在9～10個(gè)月，而CDK12野生型患者進(jìn)展至mCRPC的中位時(shí)間在13～18個(gè)月[6，13-14]。因此，本研究將mHSPC患者初始治療后在12個(gè)月內(nèi)是否進(jìn)展作為預(yù)后觀察指標(biāo)?；谥袊?guó)人群，對(duì)mHSPC階段CDK12基因突變患者進(jìn)行了臨床特征分析。通過(guò)χ2檢驗(yàn)以及Logistic回歸多因素分析的研究結(jié)果顯示，CDK12突變與mHSPC患者進(jìn)展至mCRPC階段的時(shí)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具有CDK12突變的mHSPC患者的預(yù)后情況普遍較差，與先前的報(bào)道結(jié)果一致。在Logistic回歸的多因素分析中，除了CDK12突變以外，ISUP分組也是mHSPC患者在12個(gè)月內(nèi)發(fā)生進(jìn)展的獨(dú)立影響因素。

CDK12突變的mHSPC表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性行為，患者預(yù)后較差，且前列腺癌中CDK12的突變又在中國(guó)人群中有較高的比例，因此，CDK12值得引起泌尿外科的高度重視。對(duì)CDK12突變的前列腺癌患者，使用新型內(nèi)分泌治療的療效往往不佳[9，13]。本研究結(jié)果也提示CDK12突變型mHSPC患者一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括ADT聯(lián)合比卡魯胺或醋酸阿比特龍或多西他賽均療效欠佳。但CDK12會(huì)影響DNA損傷修復(fù)，表現(xiàn)為“類(lèi)同源重組修復(fù)缺陷”作用，從而增加新抗原負(fù)荷和T細(xì)胞浸潤(rùn)，引起免疫應(yīng)答[19]。CDK12 基因影響DNA 的修復(fù)包括同源重組修復(fù)和炎癥相關(guān)表型。因此，有研究報(bào)道有CDK12突變的前列腺癌患者對(duì)鉑類(lèi)化療和免疫治療有較好的響應(yīng)[9，20]。那么后續(xù)對(duì)有CDK12突變的mHSPC患者，是否可以使用鉑類(lèi)或免疫等更加積極的治療方式，進(jìn)而延長(zhǎng)患者生存期，值得進(jìn)一步研究和探討。

本研究仍存在一些不足，因目前基因檢測(cè)費(fèi)用較高，收集樣本量有限且非連續(xù)人群，存在一定的選擇偏倚。另外因隨訪時(shí)間偏短，無(wú)法得到所有患者進(jìn)展至mCRPC的具體時(shí)間，所以采用治療12個(gè)月內(nèi)是否進(jìn)展作為療效觀察指標(biāo)也存在一定的偏差。這需要在后續(xù)收集更多的樣本和更長(zhǎng)的隨訪時(shí)間，為指導(dǎo)中國(guó)人群中mHSPC患者的CDK12突變頻率及臨床意義提供更詳實(shí)、可靠的依據(jù)。