袁園， 戴美云， 徐浩

近年來我國結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)的術(shù)后復發(fā)及不可控的腫瘤轉(zhuǎn)移是導致患者預后不良乃至死亡的關(guān)鍵因素，CRC的早發(fā)現(xiàn)、早確診對于改善患者預后具有重要意義[1]。層粘連蛋白β1(Lamininβ1，LAMβ1)與胃癌、肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3復合體4(actin-related protein 2/3 complex 4，ARPC4)為Arp2/3復合體的亞基之一，Arp2/3復合體在構(gòu)成細胞骨架、維持細胞形態(tài)及運動等多種與肌蛋白有關(guān)的生理活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]，ARPC5的上調(diào)對多發(fā)性骨髓瘤等惡性腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移有促進作用[4]，但對于ARPC4的研究相對較少。間隙連接蛋白26(connexin 26，Cx26)參與構(gòu)成細胞間隙連接并發(fā)揮細胞增殖、分化的調(diào)控作用，Cx26、Cx43等Cx蛋白與腫瘤惡性程度有一定的聯(lián)系[5]。本研究對CRC組織中LAMβ1、ARPC4、Cx26的表達及與臨床病理特征的關(guān)系進行了探究，分析這三種指標對CRC侵襲、轉(zhuǎn)移的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

100例結(jié)直腸癌手術(shù)切除的腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁正常組織(距腫瘤組織5 cm外的腸黏膜組織)，均置入液氮中冷凍保存。所有標本由2位病理科醫(yī)師共同診斷。100例中男59例，女41例；年齡32～84歲，平均(62.5±3.8)歲；結(jié)腸癌46例，直腸癌54例；腫瘤直徑<3 cm 41例，≥3 cm 59例；分化程度：低分化43例,中35例,高22例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟2009年發(fā)布的第7版結(jié)直腸癌TNM分期：Ⅰ期14例,Ⅱ期24例,Ⅲ期39例,Ⅳ期23例；浸潤深度：黏膜下層浸潤(T1)11例,固有肌層浸潤(T2)22例,侵犯無腹膜覆蓋的結(jié)直腸旁組織或穿至漿膜下層(T3)48例,穿透腹膜臟(T4)19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0)44例，1～3個區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1)48例，4個及以上區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例；遠處轉(zhuǎn)移:有35例，無65例。本研究獲得醫(yī)學倫理委員會批準通過。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 實時熒光定量PCR試劑盒購自美國Promega公司，Trizol試劑盒購自美國Thermo公司，光學顯微鏡購自日本Olympus公司，LAMβ1、Cx26兔抗人多克隆抗體購自美國Sigma公司,ARPC4兔抗人ARPC4多克隆抗體購自英國Abcam公司，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自美國R&D公司，BD-BRV1凝膠電泳儀購自博弗瑞德公司，LG2080凝膠成像系統(tǒng)購自杭州朗基科學儀器有限公司，免疫組化SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司、免疫組化二抗試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測腫瘤組織及癌旁正常組織LAMβ1、ARPC4、Cx26的mRNA表達 從液氮中取出適量組織，放入勻漿器中充分研磨并加入1 ml的Trizol，室溫靜置5 min，參照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，變性凝膠電泳檢測RNA完整性和純度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA,加入相應(yīng)目的基因引物(LAMβ1、ARPC4、Cx26引物均由上海生工生物工程有限公司提供)，行實時熒光定量PCR檢測，參照2-△△Ct公式計算mRNA相對表達水平。

1.2.3 Western blot檢測腫瘤組織及癌旁組織LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表達 取體積0.5 cm3或細胞數(shù)1×106的腫瘤組織或癌旁正常組織加入100 μl的裂解液，采用BCA試劑盒定量分析蛋白含量，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗和二抗，DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯像，以GAPDH為對照。

1.2.4 免疫組化法檢測腫瘤組織及癌旁正常組織LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表達 取適量組織石蠟包埋，常規(guī)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，去除內(nèi)源性過氧化物酶后于37 ℃及3%H2O2環(huán)境下孵育10 min，PBS沖洗3次，抗原修復，加入枸櫞酸緩沖液中煮沸15～20 min，室溫冷卻，PBS沖洗，封閉10 min，加入一抗和二抗，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB染色，蘇木精復染，乙醇脫水至二甲苯透明，干燥后樹脂封片。PBS作為對照，染色標準判斷以腫瘤細胞質(zhì)和細胞膜著色為基準：統(tǒng)計20個高倍視野(×400)下免疫組化染色細胞，染色面積：著色范圍≤10%為0分，10%<著色范圍≤25%為1分，25%<著色范圍≤50%為2分，50%<著色范圍≤75%為3分，著色范圍>75%為4分；染色強度：無色0分，弱染色1分，中染色2分，強染色3分。以兩種積分之和0分為陰性，1～2分為弱陽性(+)，3～5分為陽性(++)，>5分為強陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果比較

RT-PCR結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中LAMβ1、ARPC4、Cx26的mRNA表達高于癌旁組織，(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表達高于癌旁組織，(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 Western blot檢測結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中LAMβ1、ARPC4、Cx26表達

表1 癌旁組織及結(jié)直腸癌組織中LAMβ1、ARPC4、Cx26 mRNA表達比較

2.2 免疫組化結(jié)果比較

免疫組化結(jié)果顯示，LAMβ1、ARPC4、Cx26著色主要分布于腫瘤細胞的細胞膜和細胞質(zhì)中。LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達以陽性為主，在癌旁正常組織中表達以陰性為主，結(jié)直腸癌組織中LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表達高于癌旁正常組織(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中LAMβ1、ARPC4、Cx26表達免疫組化檢測結(jié)果比較[例(%)]

2.3 臨床病理特征與LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表達的關(guān)系

不同性別、年齡、腫瘤大小結(jié)直腸癌患者LAMβ1、ARPC4、Cx26的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同分化程度、臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者LAMβ1、ARPC4、Cx26的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 結(jié)直腸癌患者臨床病理特征與LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表達的關(guān)系[例(%)]

注：1A為LAMβ1 在癌旁正常組織中的表達，2A為LAMβ1在結(jié)直腸癌組織中的表達；1B為ARPC4 在癌旁正常組織中的表達，2B為ARPC4在直腸癌組織中的表達；1C為Cx26 在癌旁正常組織中的表達，2C為Cx26在直腸癌組織中的表達圖2 結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白免疫組化圖(×400)

2.4 LAMβ1、ARPC4、Cx26 mRNA及蛋白表達相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中LAMβ1與ARPC4(r=0.533)、LAMβ1與Cx26(r=0.528)、ARPC4與Cx26(r=0.510)的mRNA表達存在正相關(guān)性(均P<0.05)；LAMβ1與ARPC4(r=0.571)、LAMβ1與Cx26(r=0.497)、ARPC4與Cx26(r=0.559)蛋白表達之間同樣存在正相關(guān)性(均P<0.05)。

3 討論

結(jié)直腸癌為人類的常見腫瘤，由于各種原因的影響，多數(shù)患者確診時已處于進展期，盡管通過手術(shù)、放化療等綜合治療取得了一定的效果，但患者5年生存率仍不理想。其中，癌細胞轉(zhuǎn)移至肝臟、淋巴結(jié)或腹腔等是治療失敗的重要原因[6]。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個十分復雜的過程，是有多步驟、多基因參與調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織的LAMβ1、ARPC4、Cx26 mRNA表達高于癌旁組織，LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表達也顯著高于癌旁組織，免疫組化染色結(jié)果獲得了同樣的結(jié)果。

層粘連蛋白為細胞外基質(zhì)中的非膠原糖蛋白，是細胞間質(zhì)中基底膜的主要成分，其在胚胎發(fā)生、細胞分化和組織結(jié)構(gòu)支持等方面起重要作用。研究表明[7]，癌細胞對于基底膜的降解、粘附和破壞是浸潤及轉(zhuǎn)移的重要標志，因而層粘連蛋白在介導癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移的過程中具有重要作用。LAMβ1基因位于人體第4號染色體長臂33區(qū)，LAMβ1表達失調(diào)是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因。研究證實，Arp2/3復合體能夠促進結(jié)直腸癌細胞在基質(zhì)中的運動，從而為腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移提供便利[8]。ARPC4為Arp2/3復合體組成的重要亞單位，其參與了細胞骨架重構(gòu)和微絲合成過程。細胞骨架主要由微絲、微管和中間纖維組成，參與細胞增殖、分化、運動等重要活動，因此ARPC4對于腫瘤細胞骨架功能及結(jié)構(gòu)改變影響了腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[9]。細胞間隙連接主要由跨膜的Cx組成，細胞間隙連接允許小分子和細胞代謝產(chǎn)物通過細胞膜孔道進入鄰近細胞，維持細胞的代謝平衡和信息溝通，調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化。Cx異常表達可導致細胞間隙連接障礙，導致細胞間代謝共同體功能變化，這一功能的變化與多種腫瘤增殖、分化關(guān)系密切。Cx26基因主要位于13號染色體上，在機體上皮細胞中有所表達，研究證實，Cx26表達強度與移行細胞癌惡性程度存在密切關(guān)系[10-12]。本研究經(jīng)Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中LAMβ1、ARPC4、Cx26 mRNA表達間存在正相關(guān)性，LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表達之間同樣存在正相關(guān)性。提示，結(jié)直腸癌的LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白存在高度關(guān)聯(lián)性。

李合等[13]研究發(fā)現(xiàn)LAMβ1表達與腫瘤大小存在密切關(guān)系。ARPC4下調(diào)后腫瘤細胞遷移能力出現(xiàn)明顯降低，降低ARPC4表達可抑制癌細胞的侵襲能力[14]。研究發(fā)現(xiàn)[15-16]，肝癌、乳腺癌組織中Cx26持續(xù)表達，證實Cx26能夠促進腫瘤細胞的局部侵襲性。本研究結(jié)果顯示，不同分化程度、臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者的LAMβ1、ARPC4、Cx26表達差異具有統(tǒng)計學意義，隨著腫瘤分化程度、臨床分期升高、浸潤深度增加及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，LAMβ1、ARPC4、Cx26陽性表達均明顯升高。提示，結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展時，LAMβ1、ARPC4、Cx26基因及蛋白表達均轉(zhuǎn)入高活性、高表達狀態(tài)。因此，檢測LAMβ1、ARPC4、Cx26有助于了解結(jié)直腸癌患者腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移情況，可為臨床診斷及治療提供指導及新的潛在靶點。

本研究存在一定的局限性，未對LAMβ1、ARPC4、Cx26表達與結(jié)直腸癌患者長期預后的關(guān)系進行研究，對LAMβ1、ARPC4、Cx26之間的聯(lián)系也未進行深入探究。