李 田, 劉昊宇, 王隔敏, 李亞騰, 余華獻(xiàn), 嚴(yán)東生,郭 雨, 張?zhí)? 陳 萍,*

(1. 西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院, 重慶 400715; 2. 西南醫(yī)科大學(xué)藥物研究中心, 四川瀘州 646000;3. 重慶市蠶業(yè)管理總站, 重慶 400020; 4. 重慶市合川區(qū)經(jīng)濟(jì)作物發(fā)展指導(dǎo)站, 重慶 401520)

家蠶Bombyxmori血淋巴系統(tǒng)不僅是各個組織器官滋養(yǎng)中心、廢物排泄清除場所，而且是抗擊外物入侵的主要陣地(Iwama and Ashida, 1986; 錢惠田, 1995; Giliespieetal., 1997; 王蔭長, 2004)。血細(xì)胞承擔(dān)了血淋巴的重要功能，尤其在先天免疫以及血細(xì)胞通過吞噬、小結(jié)和包囊等執(zhí)行細(xì)胞免疫反應(yīng)，通過產(chǎn)生酚氧化酶、凝集素、溶菌酶和抗菌肽等參與體液免疫反應(yīng)(Wago, 1980; Taniaietal., 1997; 吳姍和凌爾軍, 2009; Lietal., 2019)。

家蠶血細(xì)胞有兩種來源，一種是胚胎時期產(chǎn)生的血液祖母細(xì)胞的增殖分化，另一種是造血器官的造血作用(Tepassetal., 1994; Nakaharaetal., 2010)。家蠶血細(xì)胞分為原血細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、擬絳色細(xì)胞以及小球細(xì)胞5類，顆粒細(xì)胞主要參與吞噬和包囊，漿細(xì)胞主要參與包囊和黑化反應(yīng)，擬絳色細(xì)胞主要產(chǎn)生黑化作用的酚氧化酶(Akai and Sato, 1973; Lavine and Strand, 2002; Lingetal., 2005)。從野蠶馴化而來的家蠶丟失了野外生存力，防御抵抗力低。侵襲家蠶的病原物有細(xì)菌、真菌、病毒和節(jié)肢動物等。養(yǎng)蠶生產(chǎn)常常因蠶病暴發(fā)損失巨大(金偉和魯興萌, 2001; Horietal., 2013)。雖然許多研究表明昆蟲血細(xì)胞在先天免疫防御中起主導(dǎo)作用(Wago, 1980; Taniaietal., 1997; 吳姍和凌爾軍, 2009; Lietal., 2019)，但血細(xì)胞與家蠶實(shí)際抗性(生存力)的關(guān)系還沒有相關(guān)探究。本研究對家蠶血細(xì)胞密度及其抗性關(guān)系進(jìn)行了分析，以期對家蠶抗性育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試蠶品種有野生型大造以及實(shí)用蠶品種純種限1、秋豐、932、芙蓉、夏芳、601、9919、781A、限2、782、7532、湘輝、白玉B、瀟、碚和854B，實(shí)用蠶品種一代雜交種兩廣二號。供試蠶在常規(guī)溫濕度條件下(24～26℃，相對濕度70%～85%，光周期12L∶12D)桑葉飼養(yǎng)。同一品種同一時期內(nèi)選用大小相近的個體試驗(yàn)。大造品系血細(xì)胞數(shù)目隨時期的變化、時節(jié)性蠶品種(菁松×皓月和兩廣二號)血細(xì)胞數(shù)目的調(diào)查研究開展于2020年5月春蠶期；不同蠶品系血細(xì)胞數(shù)目和高溫抗性的研究開展于2020年10月秋蠶期。用無菌針刺破幼蟲腹腳采集血淋巴。

1.2 血細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)

血細(xì)胞密度指單位體積血淋巴中的血細(xì)胞數(shù)目，是家蠶重要的生理狀態(tài)指標(biāo)。血細(xì)胞密度變化趨勢是家蠶生長發(fā)育的生理特征之一。本研究以家蠶幼蟲血淋巴中單位體積內(nèi)的血細(xì)胞數(shù)目代表血細(xì)胞密度，調(diào)查家蠶大造不同齡期(4齡第1-4天、5齡第1-8天和上蔟期)幼蟲血細(xì)胞數(shù)目。將10 μL剛采集的新鮮血淋巴滴在25×16型細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，蓋上玻片后在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)正中及左上、左下、右上、右下4角中5個中方格內(nèi)的血細(xì)胞總數(shù)N。10 μL血淋巴的血細(xì)胞數(shù)目為：N/80×400×104。血細(xì)胞類型根據(jù)參考傅吉濤等(2005)中描述的血細(xì)胞形態(tài)特征辨別和統(tǒng)計(jì)。每個品種調(diào)查20頭幼蟲。菁松、皓月、兩廣二號、932、芙蓉、7532和湘輝5齡第1天幼蟲血細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)同上。12個實(shí)用蠶品種(日本系統(tǒng)品種和中國系統(tǒng)品種各6個) 5齡第1天幼蟲血細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)同上，其中日系品種中春用品種1個(782)、夏秋用品種5個(限2、白玉B、瀟、碚和854B)，中系品種中春用品種1個(9919)、春秋兼用品種1個(781A)、夏秋用品種4個(夏芳、限1、601和秋豐)，并利用限1、限2具有斑紋限性能區(qū)分幼蟲性別的特點(diǎn)，雌和雄幼蟲個體分別進(jìn)行調(diào)查。

1.3 翅原基和造血器官大小估算

家蠶幼蟲造血器官較小，作為循環(huán)血細(xì)胞的重要來源，其嵌于翅原基內(nèi)(Tanetal., 2013)。翅原基為扁平扇形狀。為了觀察家蠶幼蟲造血器官大小的變化，用75%的酒精對已冷麻大造品種蠶體表擦抹后，用無菌刀片在蠶體第2和3胸節(jié)附近切開體壁，取出翅原基在0.1 mol/L PBS (pH 7.4)中充分去除雜物，然后平鋪于體視顯微鏡下(50×)拍照。采集的橫截面成像圖片用ImageJ軟件設(shè)定長度標(biāo)尺，圈出待測區(qū)域并測量其相對面積(圖1)，用橫截面面積作為體積特征值來估算造血器官與翅原基的體積。

圖1 家蠶翅原基(A)與造血器官(B)大小測量Fig. 1 Measurement of the size of wing disc (A) and hematopoietic organs (B) of Bombyx mori

1.4 造血調(diào)控因子和免疫相關(guān)基因表達(dá)的qRT-PCR檢測

將1.1節(jié)采集的皓月和兩廣二號5齡第1天幼蟲血淋巴加入Trizol (Invitrogen)，參照Solarbio總RNA提取試劑盒說明書提取血淋巴總RNA，隨后用ezDNase與樣品RNA在37℃孵育2 min去除基因組DNA，再用oligo dT寡核苷酸為引物和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。

基于造血調(diào)控因子基因BmBCFI,BmUsh,BmGATA和BmLz(Drevetetal., 1994, 1995; Xuetal., 2015)以及免疫相關(guān)基因(Imd通路上NF-κB轉(zhuǎn)錄因子基因BmRelish和細(xì)胞吞噬作用激活因子基因BmPGRP-LE、Toll通路活化基因BmSpzl和NF-κB結(jié)合調(diào)控基因BmCactus)序列，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。 用SYBR Green (Thermofisher)熒光染料標(biāo)記，以BmTIF4基因?yàn)閮?nèi)參基因，反應(yīng)體系: 2×SYBR Green qRT-PCR Mix 10 μL, cDNA 2 μL, 正反向引物(100 μmol/L)各0.4 μL, ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)在ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)上完成，反應(yīng)條件: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 95℃ 15 s。每個樣本設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.5 大腸桿菌侵染

將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌EscherichiacoliDH5α在4℃條件下7 000×g離心10 min，用0.1 mol/L PBS (pH 7.4)洗滌沉淀兩次，之后調(diào)整OD600值約為0.8，4℃?zhèn)溆?。用自制毛?xì)針通過大造5齡第1和3天幼蟲第3環(huán)節(jié)氣孔將10 μL菌液快速注入幼蟲血腔，以注射0.1 mol/L PBS為對照，盡量避免出血。分別于注射后1, 3, 6, 9, 12, 18和24 h統(tǒng)計(jì)血細(xì)胞數(shù)目(方法同1.2節(jié))，并利用qRT-PCR檢測造血調(diào)控因子基因BmBCFI,BmUsh,BmGATA和BmLz的表達(dá)量(方法同1.4節(jié))，探究血細(xì)胞數(shù)目是否與造血調(diào)控因子有關(guān)。

1.6 個體基因干涉

用1.4節(jié)制備的cDNA為模板，用含T7啟動子序列的引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增BmBCFI,BmUsh和BmLz，膠回收(Axygen)目的條帶并測序，以測序驗(yàn)證正確的回收產(chǎn)物為模板，參照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System (Promega)試劑盒說明書合成dsRNA，用DNase Ⅰ去除DNA后，回收dsRNA溶于RNase-free Water至濃度為3.2 μg/μL。從大造5齡第1天幼蟲左側(cè)第3個氣孔注射dsRNA， 每頭蠶注射10 μL， 以 pMD19-T-EGFP為模板合成dsEGFP，以注射等量dsEGFP為對照。注射后24, 48和72 h檢測靶基因的表達(dá)量(方法同1.4節(jié))。取RNAi后48 h幼蟲注射1.5節(jié)制備的大腸桿菌菌液(方法同1.5節(jié))，將注射大腸桿菌后的幼蟲正常飼養(yǎng)6 h后取血淋巴提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR檢測靶基因和免疫相關(guān)基因BmRelish,BmCactus,BmSpzl和BmPGRP-LE的表達(dá)量(方法同1.4節(jié))，統(tǒng)計(jì)不同類型血細(xì)胞數(shù)目(方法同1.2節(jié))。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.7 高溫飼養(yǎng)試驗(yàn)

35℃高溫飼養(yǎng)12個實(shí)用蠶品種5齡第1天幼蟲，其中日系品種中春用品種1個(782)、夏秋用品種5個(限2、白玉B、瀟、碚和854B)，中系品種中春用品種1個(9919)、春秋兼用品種1個(781A)、夏秋用品種4個(夏芳、限1、601和秋豐)，濕度為75%。每試驗(yàn)區(qū)30頭，1個品種3個試驗(yàn)區(qū)。每隔8 h記錄死亡蠶頭數(shù)1次(共80 h調(diào)查記載10次)、清除廢物1次、給桑1次，品種限1和限2分雌雄試驗(yàn)。每個蠶品種的對照為同等條件下的常溫(25℃)飼養(yǎng)。

各個高溫飼養(yǎng)時間長度給與的死亡權(quán)重系數(shù)和死亡估算方法如表2。死亡指數(shù)=權(quán)重系數(shù)×死亡頭數(shù)/觀察頭數(shù)；死亡指數(shù)值(%)=100×∑死亡指數(shù)，即：100×各個觀察時間段死亡指數(shù)總和。借鑒臨床醫(yī)學(xué)研究中對疾病預(yù)后生存率的統(tǒng)計(jì)方法(顏虹, 2010)，利用SPSS軟件繪制12個實(shí)用蠶品種的生存曲線。

表2 死亡權(quán)重系數(shù)Table 2 Weighting coefficient on death

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Duncan氏檢驗(yàn)分析不同品種家蠶血淋巴中血細(xì)胞數(shù)目間的差異顯著性。基因相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算(Livak and Schmittgen, 2001),利用SPSS軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。高溫飼養(yǎng)幼蟲存活率分析設(shè)定高溫經(jīng)歷時間越短的權(quán)重系數(shù)越高，高溫經(jīng)歷時間越長的權(quán)重系數(shù)越低。對各個觀察時期死亡指數(shù)求和得到該試驗(yàn)區(qū)的死亡指數(shù)值。 死亡指數(shù)值越高，存活率越低，高溫抗性越差；反之，死亡指數(shù)值越低，存活率越高，高溫抗性越好。生存曲線采用Kaplan-Meier分析方法分析。

2 結(jié)果

2.1 大造幼蟲血細(xì)胞數(shù)目和造血器官大小

結(jié)果顯示，4齡第1天幼蟲的血細(xì)胞數(shù)目為3.33×106，4齡第2天幼蟲的血細(xì)胞數(shù)目為3.52×106，整個4齡期幼蟲血細(xì)胞數(shù)目隨幼蟲生長呈逐漸上升趨勢。5齡第1天幼蟲的血細(xì)胞數(shù)目為4.64×106，達(dá)到頂峰， 5齡第2天幼蟲血細(xì)胞數(shù)目為4.45×106，開始下降，這種下降一直持續(xù)到5齡第6天，然后保持一種平穩(wěn)狀態(tài)，直至游走期出現(xiàn)小幅升高(圖2: A)。

大造5齡第1天幼蟲到上蔟期，隨幼蟲生長每天翅原基俯視面積相對值分別為0.22, 0.30, 0.33, 0.42, 0.51, 0.64, 0.78, 0.80和1.11 mm2，是不斷增大的(圖2: C)；造血器官俯視面積從5齡第1天幼蟲的0.037 mm2逐漸增大到5齡第6天幼蟲的0.1 mm2左右，達(dá)到最大，與翅原基變化趨勢一樣，但到5齡第8天陡然下降成0.054 mm2，上蔟期為0.025 mm2，最后解離消失(圖2: B)，與翅原基面積變化完全不同。

圖2 不同齡期家蠶品種大造幼蟲血淋巴中血細(xì)胞數(shù)目(A)以及造血器官(B)和翅原基(C)俯視面積的變化Fig. 2 Changes of hemocyte numbers in the hemolymph (A), and top-view areas of hematopoietic organs (B)and wing disc (C) in Bombyx mori (Dazao) larvae of different instars4L1D-4D: 分別為4齡第1-4天幼蟲Day-1-4 4th instar larva, respectively; 5L1D-8D: 分別為5齡第1-8天幼蟲Day-1-8 5th instar larva, respectively; Wandering: 上蔟期幼蟲 Wandering larva. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。Data in the figure are mean±SD.

2.2 典型時節(jié)性蠶品種血細(xì)胞數(shù)目

血細(xì)胞數(shù)目調(diào)查結(jié)果顯示，兩廣二號及其親本純種932、芙蓉、7532和湘輝5齡第1天幼蟲的血細(xì)胞數(shù)目分別是8.15×106, 7.25×106, 7.23×106, 7.86×106和8.01×106，菁松和皓月5齡第1天幼蟲的血細(xì)胞數(shù)目分別是3.32×106和3.68×106，夏秋用蠶品種純種(兩廣二號、932、芙蓉、7532和湘輝)的血細(xì)胞數(shù)目是春用蠶品種純種(菁松和皓月)的2倍；此外，具有雜交優(yōu)勢、生存力強(qiáng)的兩廣二號5齡第1天幼蟲的血細(xì)胞數(shù)目略高于血細(xì)胞數(shù)目最高的親本湘輝(圖3)。

圖3 不同品種家蠶5齡第1天幼蟲血淋巴中血細(xì)胞數(shù)目Fig. 3 Hemocyte numbers in the hemolymph of the day-15th instar larvae of different varieties of Bombyx mori菁松和皓月為典型春用蠶品種，兩廣二號、932、芙蓉、7532和湘輝為夏秋用蠶品種。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。柱上不同字母示差異顯著(P<0.05, Duncan氏檢驗(yàn))。Jingsong and Haoyue are typical spring varieties and Liangguang 2, 932, Furong, 7532 and Xianghui are summer-autumn varieties. Data in the figure are mean±SD. Different letters above bars indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s test).

2.3 造血調(diào)控因子基因的表達(dá)

qRT-PCR分析造血調(diào)控基因在兩廣二號和皓月5齡第1天幼蟲血淋巴中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BmBCFI,BmUsh和BmLz在兩廣二號中的表達(dá)量顯著高于在皓月中的(P<0.001)，BmGATA表達(dá)量在兩個品種間差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

圖4 不同品種家蠶5齡第1天幼蟲血淋巴中造血調(diào)控因子基因的表達(dá)量Fig. 4 Relative expression levels of hematopoieticregulation factor genes in the hemolymph of theday-1 5th instar larvae of different varietiesof Bombyx mori圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，柱上星號表示同一基因表達(dá)量在兩組間差異顯著(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; t檢驗(yàn))；圖8和9同。Data in the figure are mean±SD. Asterisk above bars indicates significant difference in the expression level of the same gene between two groups (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; t-test). The same for Figs. 8 and 9.

大造5齡第1和3天幼蟲受大腸桿菌侵染免疫攻擊后1 h時血細(xì)胞數(shù)目立即降低，然后逐漸升高，分別于6和3 h時達(dá)到峰值后慢慢下降，24 h時均趨于平穩(wěn)回復(fù)正常(圖5: A, B)。造血調(diào)控因子基因BmBCFI,BmUsh和BmLz的表達(dá)量都是在血細(xì)胞數(shù)目高峰期(分別于6和3 h時)顯著上調(diào)(P<0.001)，尤其BmBCFI和BmUsh表達(dá)量上調(diào)4倍以上，其中BmUsh在5齡第1天幼蟲中表達(dá)上調(diào)近7倍 (圖6)。

圖5 大腸桿菌侵染家蠶品種大造5齡第1(A)和3天(B)幼蟲不同時間后血淋巴中血細(xì)胞數(shù)目Fig. 5 Number of hemocytes in the hemolymph of the day-1 (A) and day-3 (B) 5th instar larvae of Bombyx mori (Dazao)after Escherichia coli infection for different timeE. coli: 大腸桿菌Escherichia coli. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，圖中星號表示同一時間與對照組相比差異顯著(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; 獨(dú)立本樣t檢驗(yàn))。圖6和7同。Data in the figure are mean ± SD. The asterisk in the figure indicates significant difference from the control group at the same treatment time (*P<0.05;**P<0.01; ***P<0.001; Independent samples t-test). The same for Figs.6 and 7.

圖6 大腸桿菌侵染家蠶大造5齡第1(A-D)和3(E-H)天幼蟲不同時間后血淋巴中造血調(diào)控因子基因的相對表達(dá)量Fig.6 Relative expression levels of hematopoietic regulation factor genes in the hemolymph of the day-1 (A-D)and day-3 (E-H) 5th instar larvae of Bombyx mori (Dazao) after Escherichia coli infection for different time

2.4 大造造血調(diào)控基因的RNAi

注射dsRNA后24, 48和72 h 3個時間點(diǎn)，BmLz,BmUsh和BmBCF13個靶基因表達(dá)量都降低，且在48 h靶基因表達(dá)量下調(diào)最大(圖7: A-C)。

圖7 RNAi干擾BmBCFI (A), BmUsh (B)和BmLz (C)不同時間后家蠶品種大造5齡幼蟲血淋巴中靶基因的表達(dá)量Fig. 7 Expression levels of target genes in the hemolymph of the 5th instar larvae of Bombyx mori (Dazao) after RNAiof BmBCFI (A), BmUsh (B) and BmLz (C) for different time

RNAi后48 h的大造幼蟲且大腸桿菌侵染6 h后，各靶基因的表達(dá)量仍極顯著下調(diào)(P<0.001)(圖8: A, B, C)。 注射dsBmLz后，擬絳色細(xì)胞數(shù)目為10.1×104，漿細(xì)胞數(shù)目為147.9×104，血細(xì)胞總數(shù)為446.7×104；注射dsBmUsh后，擬絳色細(xì)胞數(shù)目為4.0×104，漿細(xì)胞數(shù)目為154.4×104，血細(xì)胞總數(shù)為473.4×104；注射dsBmBCFI后，擬絳色細(xì)胞數(shù)目為21.6×104，漿細(xì)胞數(shù)目為126.7×104，血細(xì)胞總數(shù)為430.9×104；注射dsEGFP的對照組擬絳色細(xì)胞數(shù)目為22.0×104，漿細(xì)胞數(shù)目為151.1×104，血細(xì)胞總數(shù)為460.9×104。相比對照組，降低BmLz和BmUsh表達(dá)，擬絳色細(xì)胞數(shù)目顯著減少，降低BmBCFI表達(dá)的漿細(xì)胞數(shù)目和血細(xì)胞總數(shù)都有顯著減少(圖8: D)。

BmBCFI或者BmUsh被RNAi干擾 48 h后大腸桿菌侵染6 h時，Imd通路的BmRelish與Toll通路的BmCactus的表達(dá)量都顯著下降(P<0.001)，Imd通路的BmPGRP-LE和Toll通路的BmSpzl的表達(dá)量與對照差異不顯著(P>0.05)(圖9: A, B)；BmLz被RNAi干擾 48 h后大腸桿菌侵染6 h時， 3個重要免疫基因BmRelish,BmCactus和BmSpzl表達(dá)量都沒有顯著變化(P>0.05)(圖9: C)。

圖8 RNAi干擾BmBCFI, BmUsh和BmLz后大腸桿菌刺激下家蠶品種大造5齡幼蟲血淋巴中靶基因的表達(dá)量和不同類型血細(xì)胞數(shù)目Fig. 8 Expression levels of target genes and number of different types of hemocytes in the hemolymph of the 5th instarlarvae of Bombyx mori (Dazao) after Escherichia coli infection following RNAi of BmBCFI, BmUsh and BmLzA: BmBCFI表達(dá)量Expression level of BmBCFI； B: BmUsh表達(dá)量Expression level of BmUsh; C: BmLz表達(dá)量Expression level of BmLz; D: 血細(xì)胞數(shù)目Number of hemocytes. RNAi干擾48 h大腸桿菌侵染6 h后檢測基因相對表達(dá)量和血細(xì)胞數(shù)目。The relative expression levels of genes and number of hemocytes were detected at 6 h after E. coli infection following RNAi for 48 h.

圖9 RNAi干擾家蠶品種大造5齡幼蟲BmBCFI (A), BmUsh (B)和BmLz (C)后大腸桿菌侵染后血淋巴中免疫相關(guān)基因的表達(dá)量Fig. 9 Relative expression levels of immune-related genes in the hemolymph of the 5th instar larvae of Bombyx mori (Dazao)after Escherichia coli infection following RNAi of BmBCFI (A), BmUsh (B) and BmLz (C)RNAi干擾48 h大腸桿菌侵染6 h后檢測基因相對表達(dá)量。The relative expression levels of genes were detected at 6 h after E. coli infection following RNAi for 48 h.

2.5 血細(xì)胞數(shù)目與家蠶幼蟲生存力的關(guān)系

2.5.1多個實(shí)用蠶品種血細(xì)胞數(shù)目：結(jié)果顯示，品種限2的血細(xì)胞數(shù)目最高，品種9919的最低，品種間差異極大，達(dá)2.5倍以上，與前面調(diào)查結(jié)果相似。依據(jù)血細(xì)胞數(shù)目從高到低對調(diào)查的12個實(shí)用蠶品種排序，結(jié)果排在前面的主要是日系品種，如圖10(A)，日系蠶品種限2、白玉B和782的血細(xì)胞數(shù)目均比所有同時觀察的中系蠶品種(夏芳、限1、601、781A、秋豐和9919)高，而且，比較參與調(diào)查的3對成對蠶品種(秋豐-白玉B、限1-限2、781A-782)，發(fā)現(xiàn)都是日系蠶品種的血細(xì)胞數(shù)目高于對交中系蠶品種的血細(xì)胞數(shù)目，如白玉B比秋豐高、限2比限1高、782比781A高，與前面調(diào)查的成對夏秋用蠶品種的日系品種湘輝和7532的血細(xì)胞數(shù)目比對交中系品種芙蓉和932的血細(xì)胞數(shù)目高，成對春用蠶品種的日系品種皓月的血細(xì)胞數(shù)目比對交中系品種菁松的血細(xì)胞數(shù)目高(圖3)的結(jié)果一致。此外，中系品種中春用品種9919的細(xì)胞數(shù)目是最低的，春秋兼用品種781A的細(xì)胞數(shù)目與其他多數(shù)中系品種的接近；日本系統(tǒng)品種中春用品種782的血細(xì)胞數(shù)目位于中間。這些與前面調(diào)查顯示夏秋用蠶品種的血細(xì)胞數(shù)目高于春用蠶品種血細(xì)胞數(shù)目的結(jié)果(圖3)相似。日系品種限2和中系品種限1雄個體的血細(xì)胞數(shù)目都略高于雌個體的。

圖10 12個實(shí)用家蠶品種5齡幼蟲的血淋巴中血細(xì)胞數(shù)目 (A)以及35℃下生存曲線(B)和死亡指數(shù)值(C)Fig. 10 Hemocyte numbers in the hemolymph (A) of the 5th instar larvae of 12 practical varieties of Bombyx mori,and their survival curve (B) and death index (C) at 35℃12個實(shí)用蠶品種包括日系春用品種782，日系夏秋用品種限2、白玉B、瀟、碚和854B，中系春秋兼用品種781A和春用品種9919，中系夏秋用品種夏芳、限1、601和秋豐。B圖中采用Kaplan-Meier法分析生存曲線。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。The twelve silkworm varieties include Japanese spring variety 782, Japanese summer-autumn varieties Xian 2, BaiyuB, Xiao, Bei and 854B, Chinese spring-autumn variety 781A and spring variety 9919, and Chinese summer-autumn varieties Xiafang, Xian 1, 601 and Qiufeng. The survival curves in Fig.B are analyzed by Kaplan-Meier method. Data in the figure are mean±SD.

2.5.2多個實(shí)用蠶品種35℃高溫飼養(yǎng)時的死亡率：所有蠶品種的對照全程沒有死亡幼蟲。35℃高溫飼養(yǎng)16 h沒有死蠶，24 h時限1(雌和雄)、夏芳、9919、854B和秋豐等5個品種有死亡幼蟲， 48 h時瀟、782和781A有死亡幼蟲， 72 h時僅601才出現(xiàn)死亡幼蟲。值得注意的是，有的品種一旦出現(xiàn)死亡，死亡個體大量涌現(xiàn)，進(jìn)程相對較快，如秋豐和碚；有的品種出現(xiàn)死亡后，后續(xù)死亡個體增加緩慢，死亡進(jìn)程相對較慢，如瀟和白玉B。為了更加客觀地評價蠶品種的高溫抗性，本研究把高溫飼養(yǎng)死亡率用權(quán)重系數(shù)轉(zhuǎn)化成死亡指數(shù)。601、白玉B、781A和瀟等的死亡指數(shù)值不到5%，存活率高，抗性好；碚和限2(雄)的死亡指數(shù)值在7%～10%之間，死亡不多，抗性次之；9919、限1(雄)和限2(雌)的死亡指數(shù)值在17%～19%內(nèi)，有較多幼蟲死亡，抗性較差；854B、夏芳、782和限1(雌)的死亡指數(shù)值在23%～28%范圍，發(fā)生死亡幼蟲多，抗性差；秋豐死亡指數(shù)值很高，達(dá)93.8%，抗性極差(圖10: C)。

高溫飼養(yǎng)條件下12個實(shí)用蠶品種的生存曲線如圖10(B)，與用死亡指數(shù)值分析相似。依據(jù)抗性從高到低對試驗(yàn)蠶品種排序，死亡指數(shù)值小于10%排在前面的日系品種較多，6個品種中有白玉B、瀟、碚和限2 (雄) 4個日系品種，又日系品種中夏秋用品種排在靠前，春用品種782排在最后，這些與前面血細(xì)胞數(shù)目排序有點(diǎn)相似。限2和限1雄個體的死亡指數(shù)值比雌個體的死亡指數(shù)值低，抗性比雌個體好，推測血細(xì)胞數(shù)目與高溫生存有正相關(guān)關(guān)系。但是，中系品種中春秋兼用品種781A的死亡指數(shù)值較低，存活率較高，排序靠前；春用品種9919的死亡指數(shù)值比夏芳、限1(雌和雄)和秋豐等夏秋用蠶品種的都低，即存活率比這些夏秋用蠶品種都高，與血細(xì)胞數(shù)目排序結(jié)果不同。對12個實(shí)用蠶品種14組血細(xì)胞數(shù)目與死亡指數(shù)值數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，獲得相關(guān)系數(shù)為-0.1893，即血細(xì)胞數(shù)目確實(shí)與死亡指數(shù)值呈負(fù)相關(guān)，與存活率呈正相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

血細(xì)胞數(shù)目(密度)變化趨勢是幼蟲生長發(fā)育的重要生理特征之一，但很少被關(guān)注。本研究從4齡第1天到上簇期，每隔24 h觀察大造體內(nèi)的血細(xì)胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞數(shù)目隨幼蟲生長增加，5齡第1天達(dá)到一個頂峰，然后逐漸下降至5齡第6天，短暫平穩(wěn)后，在上蔟期又出現(xiàn)小幅上升(圖2: A)，這與先前報道家蠶4齡期幼蟲的血細(xì)胞數(shù)目隨生長增加的結(jié)果(Kiuchietal., 2008)相似。

造血器官的造血作用是家蠶循環(huán)血細(xì)胞的主要來源之一(Nakaharaetal., 2003, 2010)。嵌于翅原基內(nèi)的造血器官，僅在5齡前中期增大，后期就隨生長逐漸縮小直到消失(圖2: B)，這與血細(xì)胞數(shù)目變化趨勢不一致，推測造血器官體積大小與血細(xì)胞數(shù)目變化相關(guān)性不大。

調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在兩廣二號和皓月蠶品種中，5齡第1天幼蟲血細(xì)胞數(shù)目在品種間度差異極大(圖3)；動物體內(nèi)GATA蛋白、FOG蛋白和RUNX蛋白具有造血調(diào)控作用(Morriseyetal., 1997; Lowry and Atchley, 2000; Takaradaetal., 2013; Schmitetal., 2015)。已有研究顯示，家蠶的造血調(diào)控因子包括BmBCFI(編碼GATA家族蛋白)、BmGATA(GATA6-like，編碼GATA家族蛋白)、BmUsh(編碼FOG家族蛋白)和BmLz(編碼Runx家族蛋白)。造血調(diào)控因子BmBCFI,BmUsh和BmLz的表達(dá)量在血細(xì)胞數(shù)目高的品種中比在血細(xì)胞數(shù)目低的品種高(圖4)，暗示血細(xì)胞數(shù)目與這些造血調(diào)控因子表達(dá)量有關(guān)；大腸桿菌侵染后血細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最低點(diǎn)、最高點(diǎn)以及恢復(fù)正常趨于穩(wěn)定時造血調(diào)控因子基因的表達(dá)，5齡第1和3天幼蟲的BmBCFI,BmUsh或BmLz的表達(dá)量都在血細(xì)胞數(shù)目達(dá)到高峰時都被顯著上調(diào)(圖5和6)。因此，造血調(diào)控因子基因表達(dá)量確實(shí)與血細(xì)胞數(shù)目有關(guān)。

BmLz或者BmUsh被RNAi后，大腸桿菌侵染幼蟲，體內(nèi)擬絳色細(xì)胞數(shù)目顯著減少(圖8: D)，與先前認(rèn)為BmLz和BmUsh參與擬絳色細(xì)胞形成的觀點(diǎn)(Drevetetal., 1995; Xuetal., 2015)一致。降低BmBCFI表達(dá)后，漿細(xì)胞數(shù)目發(fā)生了減少，暗示了BmBCFI在漿細(xì)胞形成中的作用，該觀點(diǎn)尚未見報道。因?yàn)闈{細(xì)胞是主要的血細(xì)胞，而且在免疫中大量形成(Taniaietal., 1997; Nakaharaetal., 2010)。因此，降低BmBCFI基因表達(dá)引起的血細(xì)胞總數(shù)減少，很可能是因?yàn)闈{細(xì)胞數(shù)目發(fā)生減少引起的。

此外，下調(diào)BmBCFI或者BmUsh的表達(dá)，BmRelish和BmCactus的表達(dá)量都顯著下降(圖9)，因?yàn)镽elish與Cactus都能夠活化NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核(Hoffmann, 2003)，因此BmBCFI與BmUsh可能與NF-κB信號通路的激活、啟動抗菌肽等免疫因子形成有關(guān)。

觀察生產(chǎn)上廣泛使用的典型時節(jié)性蠶品種(馮家新和葉夏裕, 2019)，發(fā)現(xiàn)生存力高、適合高溫多濕季節(jié)飼養(yǎng)的夏秋用蠶品種兩廣二號親本(湘輝、芙蓉、7532和932)的血細(xì)胞密度，是生存力較弱、適合氣候條件和營養(yǎng)條件都較好的季節(jié)飼養(yǎng)的春用蠶品種親本菁松或皓月血細(xì)胞密度的2倍，而且雜交種的血細(xì)胞密度比其任何一個純種親本的都高(圖3)，似乎血細(xì)胞密度與幼蟲生存力成正相關(guān)關(guān)系。為了驗(yàn)證這個推測，調(diào)查了12個實(shí)用蠶品種純種的血細(xì)胞數(shù)目和高溫飼養(yǎng)的死亡情況，發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞數(shù)目與死亡指數(shù)值呈負(fù)相關(guān)，即血細(xì)胞數(shù)目與高溫飼養(yǎng)存活率確實(shí)呈正相關(guān)。實(shí)際上35℃高溫對于大多數(shù)家蠶品種來說是不會致死的，本研究出現(xiàn)的死亡應(yīng)該是長時間35℃高溫促使家蠶幼蟲體質(zhì)虛弱、暴發(fā)蠶病的結(jié)果。這個與Li等(2019)報道5齡幼蟲比4齡幼蟲有更高的細(xì)胞數(shù)目和更強(qiáng)免疫力(吳姍和凌爾軍, 2009)相似。但相關(guān)系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)參數(shù)P<0.25，推測家蠶生存力還受其他因素影響，如性別。調(diào)查數(shù)據(jù)中，限2和限1雄的細(xì)胞數(shù)目分別比雌的高出8%和3%，但限2和限1雄的死亡指數(shù)值分別只有雌的52%和63%，細(xì)胞密度差異遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于存活率差異。

高溫飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有些夏秋用蠶品種的生存力比春用蠶品種的生存力低(圖10)。如中系品種限1、夏芳和秋豐的存活率比781A和9919的低。這可能是(1)不同時期選育的蠶品種水平不一樣；(2)選育品種目標(biāo)針對推廣使用的地域不同；(3)春秋兼用種季節(jié)性不強(qiáng)，差異不明顯，如781A與782對交為春用，與7532對交就是夏秋用；(4)生產(chǎn)上應(yīng)用的是雜交種，生存力評價也是針對雜交種。

綜上，造血調(diào)控因子基因BmLz,BmUsh和BmBCFI的表達(dá)量影響血細(xì)胞密度，其中BmLz和BmUsh影響擬絳色細(xì)胞形成，BmBCFI影響漿細(xì)胞形成；BmBCFI和BmUsh可能與NF-κB信號通路激活有關(guān)；家蠶幼蟲血細(xì)胞密度與高溫飼養(yǎng)生存力呈正相關(guān)。這些結(jié)果為昆蟲免疫研究提供了新的線索，為下一步家蠶血細(xì)胞相關(guān)的免疫調(diào)控和抗性育種提供了參考。