周思藝, 夏 靜, 閆 琴, 蘆 韜, 陳利榮, 劉 威1,

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 合肥 230036; 2. 山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系, 山西汾陽 032200;3. 山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系, 山西汾陽 032200; 4. 中山大學(xué)腫瘤中心病理科, 廣州510000)

大蒜為百合科蔥屬植物的地下鱗莖，具有強烈辛辣的蒜臭味，含有豐富的蛋白質(zhì)、低聚糖和多糖類、礦物質(zhì)等，因此成為膳食中一種常用的調(diào)料。大蒜不僅可作調(diào)味料，還含有多種生物活性化合物，如有機硫化物、多糖等，可入藥，是著名的食藥兩用植物(Shangetal., 2019)。大蒜素(allicin)是從大蒜鱗莖中提取的一種有機硫化合物，主要成分為三硫代烯丙醚類，淡黃色粉末或油狀液體。大蒜素現(xiàn)已被證實為大蒜主要的活性成分，具有廣譜抗菌、降脂降血糖和增強機體抵抗疾病能力等作用(張庭廷等, 2007)。然而，大蒜素具有強烈的臭味，并且接觸后會引起辛辣的痛覺(Macphersonetal., 2005)。有研究表明，歐洲椋鳥Sturnusvulgaris對添加大蒜油的食物表現(xiàn)出明顯的厭惡行為(Hileetal., 2004)。因此我們推測，大蒜素可能會對昆蟲產(chǎn)生一定的驅(qū)避作用。

黑腹果蠅Drosophilamelanogaster是大家熟知模式生物之一。為了物種的繁衍延續(xù)和滿足后代良好的生存環(huán)境，雌果蠅要綜合溫度、濕度、營養(yǎng)條件、毒素、天敵等多種因素選擇合適的產(chǎn)卵地點，從而有效躲避有毒物質(zhì)的侵害，促進后代的生長發(fā)育、提高存活率，因此產(chǎn)卵決策是一個優(yōu)秀的行為模型(Yangetal., 2008; Aietal., 2010; 王璐璐等, 2017)。本研究旨在探究大蒜素對黑腹果蠅決策行為的影響，以尋找適宜的環(huán)境并躲避大蒜素的危害。

果蠅會通過不同類型的受體神經(jīng)元對外界刺激物做出強烈的反應(yīng)，故常被選作為研究對象(Liuetal., 2017; 高露等, 2019)。各種感覺由其對應(yīng)的感覺神經(jīng)元所控制，這些不同的神經(jīng)元接收到刺激后引起機體不適的感受，并最終作出相應(yīng)的反應(yīng)。Transient receptor potential ankyrin 1(TRPA1)是一種瞬時受體電位的非選擇性陽離子通道，是一種多模態(tài)損傷傳感器，可檢測多種損傷信號，包括寒冷、化學(xué)和機械刺激(Bautistaetal., 2013; Zygmunt and H?gest?tt, 2014)。TRPA1在檢測不同物種的有害化學(xué)物質(zhì)方面高度保守，它可以被許多有害的活性化學(xué)激動劑直接激活，如異硫氰酸烯丙基(AITC)、肉桂醛(Bandelletal., 2004; Jordtetal., 2004)和大蒜素(Bautistaetal., 2005; Macphersonetal., 2005)等。這些化學(xué)激動劑主要包括親電性和非親電性激動劑兩大類。親電性激動劑如大蒜素，通過對TRPA1上的半胱氨酸殘基共價修飾來開放TRPA1(Hinmanetal., 2006; Macphersonetal., 2007)；而非親電性激動劑如香芹酚，被認為是通過直接與通道結(jié)合來激活TRPA1(Xuetal., 2006; Zygmunt and H?gest?tt, 2014)。但是該受體是否介導(dǎo)對大蒜素產(chǎn)卵避性仍然未知。因此，本研究利用果蠅產(chǎn)卵決策模型，研究果蠅能否感受大蒜素而調(diào)整產(chǎn)卵行為，探究介導(dǎo)這一行為的感覺系統(tǒng)，并進一步探究大蒜素對果蠅后代的發(fā)育歷期和存活率以及對成蟲壽命和健康的影響。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系與培養(yǎng)

野生型黑腹果蠅品系Oregon R(OR)和Canton S(CS)來自本實驗室保種庫，突變體OdorantReceptorCo-Receptor2(Orco2)和TrpA1由Bloomington果蠅品系庫所提供。Orco2突變體對絕大多數(shù)氣味喪失感知(Larssonetal., 2004)，TrpA1突變體喪失對刺激性物質(zhì)的感知(Bautistaetal., 2013; Zygmunt and H?gest?tt, 2014)。

若無特別說明，所有果蠅均在溫度25℃、相對濕度60%的恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)光周期為12L∶12D (Liuetal., 2012)。通常情況下，果蠅用玉米粉-酵母培養(yǎng)基飼養(yǎng)，為避免酵母對果蠅產(chǎn)卵行為的影響，行為分析使用的培養(yǎng)基以水解酪蛋白代替酵母。

1.2 試劑與儀器

1.2.1試劑：大蒜素(源葉生物，98%)；蔗糖(光復(fù)，合格)；酪蛋白；瓊脂；玉米粉。

1.2.2儀器：25℃恒溫箱(恒豐, WS-01Y)；天平(Denver Instrument, XE-310)；顯微鏡(Olympus SZX7; Nikon SMZ745T)。

1.3 黑腹果蠅產(chǎn)卵行為檢測

實驗選用中空透明圓柱體為產(chǎn)卵雙選擇裝置，高度為80 mm，直徑為60 mm，底部放入果蠅產(chǎn)卵的培養(yǎng)皿(Josephetal., 2009)。涂有酵母膏的葡萄汁板(700 mL水，30 g瓊脂，300 mL葡萄汁，50 g蔗糖)育肥果蠅2～3 d，換為果蠅產(chǎn)卵所用培養(yǎng)基，產(chǎn)卵時間為12 h。含有0.01%, 0.015%和0.2%大蒜素的食物(實驗組)與玉米-酪蛋白食物(1 000 mL水，70 g玉米粉，50 g蔗糖，15 g酪蛋白，15 g瓊脂，對照組)各一半，拼接成果蠅產(chǎn)卵培養(yǎng)基，并將25頭雌果蠅和少許雄果蠅放于裝置中，觀察其產(chǎn)卵行為。實驗重復(fù)4次。產(chǎn)卵12 h后分別統(tǒng)計兩邊培養(yǎng)基上卵的數(shù)量，產(chǎn)卵指數(shù)(OI)=(實驗組卵數(shù)-對照組卵數(shù))/(實驗組卵數(shù)+對照組卵數(shù))。強迫產(chǎn)卵試驗則是果蠅經(jīng)育肥2～3 d，然后轉(zhuǎn)移到加有大蒜素的食物上產(chǎn)卵12 h，統(tǒng)計卵數(shù)，計算果蠅單雌產(chǎn)卵量：單雌產(chǎn)卵量=總產(chǎn)卵量/雌性頭數(shù)。

1.4 黑腹果蠅位置效應(yīng)檢測

將50頭黑腹果蠅雄成蟲、250頭雌成蟲放入高140 mm、直徑100 mm的產(chǎn)卵雙選擇裝置，待果蠅靜置適應(yīng)30 min后，每隔10 min分別計數(shù)兩側(cè)實驗和對照組(同1.3節(jié))培養(yǎng)基上的果蠅數(shù)量，連續(xù)記錄2 h。 實驗重復(fù)4次。 位置指數(shù)(position index, PI)=(實驗組果蠅數(shù)目-對照組果蠅數(shù)目)/(實驗組果蠅數(shù)目+對照組果蠅數(shù)目)(Josephetal., 2009)。

1.5 毛細管攝食法(capillary feeder, CAFE)檢測黑腹果蠅的攝食行為

將20～40頭黑腹果蠅成蟲置于玻璃瓶(高90 mm、直徑20 mm)中禁食16 h，玻璃瓶底部為ddH2O浸潤的濾紙以滿足飲水需求。然后將果蠅轉(zhuǎn)移到一個新的玻璃瓶中進行攝食試驗。毛細管插入塞子，內(nèi)加入等量兩種液體，一側(cè)為不同濃度的大蒜素溶液(實驗組)(同1.3節(jié))，一側(cè)為水(對照組)，插入毛細管的深度均為2 mm。允許果蠅在環(huán)境照明條件下進食30 min，毛細管彎液面下降長度作為食物消耗。實驗重復(fù)4次。攝食指數(shù)(feeding index, FI)=(含化學(xué)試劑的溶液消費量-僅含水的消費量)/總消費量(Jaetal., 2007)。

1.6 黑腹果蠅前足手術(shù)

用解剖鑷除去OR黑腹果蠅成蟲部分前足，使其部分味覺感受器喪失，待24 h后檢測其產(chǎn)卵決策行為。實驗重復(fù)4次。

1.7 Y迷宮實驗

將雌/雄黑腹果蠅成蟲各20頭置于小管中，饑餓處理16 h，在Y迷宮的兩頭放入含有大蒜素的玉米粉食物，在另一頭將果蠅放入Y迷宮中，處理6 h，果蠅轉(zhuǎn)移時在冰上將其麻醉，6 h后計數(shù)Y迷宮兩邊果蠅數(shù)目(Lietal., 2020)。實驗重復(fù)3次。

1.8 黑腹果蠅觸角手術(shù)

用解剖鑷除去OR黑腹果蠅成蟲觸角，使其部分嗅覺感受器喪失，待24 h后檢測其產(chǎn)卵決策行為。實驗重復(fù)4次。

1.9 黑腹果蠅的發(fā)育歷期及存活率統(tǒng)計

將適量黑腹果蠅成蟲放入收集器中，在葡萄汁板上涂抹酵母膏，收集8 h內(nèi)果蠅所產(chǎn)的卵，將其置于含有不同濃度(同1.3節(jié))大蒜素的小管食物中。每一小管食物上放置50枚卵。每天計數(shù)每組小管中成蛹和成蟲的數(shù)目(n=50)。實驗重復(fù)4次。T=(T1×N1+T2×N2+…+Tm×Nm)/(N1+N2+…+Nm)，其中T表示對應(yīng)階段發(fā)育歷期，Tm表示從產(chǎn)卵后到對應(yīng)階段需要的天數(shù)，Nm表示第Tm天形成對應(yīng)階段果蠅的數(shù)目。統(tǒng)計計算每組成蛹時間(卵產(chǎn)出至成蛹時間)和成蟲羽化時間(卵產(chǎn)出至成蟲羽化時間)。存活率=成蛹或羽化的數(shù)目/50×100%(高露等, 2019)。

1.10 黑腹果蠅死亡率統(tǒng)計

將20頭雌/雄黑腹果蠅成蟲置于含有不同濃度(同1.3節(jié))大蒜素的小管中，每天計數(shù)小管中果蠅數(shù)目(n=20)。實驗重復(fù)4次。死亡率=雌/雄果蠅數(shù)目/20×100%。

1.11 黑腹果蠅的奔跑攀爬能力檢測

將20頭黑腹果蠅成蟲置于含有5%蔗糖溶液和0.1%大蒜素溶液的小管中，處理48 h后，置于有刻度的玻璃量筒中，計算它們的攀爬和奔跑速度(Lietal., 2020)。實驗重復(fù)4次。

1.12 ROS染色實驗

挑取酵母玉米培養(yǎng)基中OR黑腹果蠅成蟲(羽化后4 d)各20頭，分別飼喂5%蔗糖溶液，0.02%大蒜素-5%蔗糖溶液，3 d后在磷酸鹽緩沖溶液中解剖腸道，用5 μmol/L濃度的細胞內(nèi)ROS敏感熒光染料二氫乙啶(dihydroethidium, DHE)室溫黑暗孵育30 min。然后用PBS洗滌腸道3次，以及用4%多聚甲醛固定組織30 min，再用PBS洗滌腸道3次。隨后將腸道轉(zhuǎn)移到玻片上，封片劑封片，在熒光顯微鏡采集圖像并用ImageJ軟件對熒光強度進行定量分析(Lietal., 2020)。實驗重復(fù)4次

1.13 數(shù)據(jù)分析

使用Excel軟件整合分析數(shù)據(jù)，每組數(shù)據(jù)得平均值(mean)和標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)，用SPSS軟件對各處理間的差異進行單樣本t檢驗分析(one-samplet-test)。使用Graphpad和Adobe Illustrator軟件制作相關(guān)圖。

2 結(jié)果

2.1 黑腹果蠅對大蒜素的產(chǎn)卵避性反應(yīng)

為探究某些辛辣植物對黑腹果蠅產(chǎn)卵選擇行為的影響，首先選用大蒜作為刺激物。在食物中加入一定量大蒜汁，與對照組食物構(gòu)成雙向選擇器，使用果蠅產(chǎn)卵雙向選擇器進行定量研究(圖1: A)。其結(jié)果顯示，黑腹果蠅成蟲對大蒜汁有明顯的產(chǎn)卵避性，僅僅將7.92%的卵產(chǎn)在含有大蒜汁的一側(cè)，產(chǎn)卵指數(shù)(OI)為-0.84(圖1: B)，說明了大蒜汁中的某種物質(zhì)導(dǎo)致果蠅產(chǎn)卵避性。進一步尋找大蒜汁中引起此行為的特異化合物，采用0.01%, 0.015%和0.02%大蒜素進行實驗。其結(jié)果顯示，OR果蠅對3個不同濃度的大蒜素均有明顯產(chǎn)卵避性，且呈現(xiàn)一定的濃度梯度效應(yīng)，即隨著大蒜素濃度加大，果蠅產(chǎn)卵避性更加顯著，OI分別為-0.53，-0.77和-0.88，與對照組相比均差異極顯著(P<0.01)(圖1: C)。另一野生品系CS黑腹果蠅對大蒜素有同樣的避性反應(yīng)，OI分別為-0.41，-0.66和-0.67，與對照組相比均差異極顯著(P<0.01)(圖1: D)。上述結(jié)果說明，大蒜素可作為大蒜主要排斥果蠅的產(chǎn)卵刺激物。為了增加實驗的特異性，后續(xù)實驗均使用大蒜素作為刺激物。各濃度大蒜素處理組與對照組相比，黑腹果蠅成蟲單雌產(chǎn)卵量沒有顯著差異(P>0.05)(圖1: E)，說明大蒜素對果蠅產(chǎn)卵能力的影響可以忽略不計。

圖1 黑腹果蠅雌成蟲對大蒜素的產(chǎn)卵避性反應(yīng)Fig. 1 Oviposition avoidance response of female adults of Drosophila melanogaster to allicinA: 產(chǎn)卵選擇行為試驗裝置Oviposition selection behavior test device; B: 野生型黑腹果蠅OR在含大蒜的培養(yǎng)基上的產(chǎn)卵避性O(shè)viposition avoidance of the wild-type OR strain of D. melanogaster on a medium containing garlic; C: 野生型黑腹果蠅OR對大蒜素的產(chǎn)卵避性 Oviposition avoidance of the wild-type OR strain of D. melanogaster to allicin; D: 野生型黑腹果蠅CS對大蒜素的產(chǎn)卵避性 Oviposition avoidance of the wild-type CS strain of D. melanogaster to allicin; E: 大蒜素對黑腹果蠅產(chǎn)卵的影響 Effects of allicin on the oviposition of D. melanogaster. 產(chǎn)卵指數(shù)(OI)=(實驗組卵數(shù)-對照組卵數(shù))/(實驗組卵數(shù)+對照組卵數(shù)) Oviposition index (OI)=(number of eggs in the experimental group-number of eggs in the control group)/(number of eggs in the experimental group+number of eggs in the control group). 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。柱上符號表示與對照組(H2O)間的差異顯著性(nsP>0.05; *0.010.05; *0.01

圖2 大蒜素對黑腹果蠅成蟲攝食(A)和位置效應(yīng)(B)的影響Fig. 2 Effects of allicin on feeding (A) and location effect (B) of Drosophila melanogaster adults攝食指數(shù)(FI)=(含化學(xué)試劑的溶液消費量-僅含水的消費量)/總消費量Feeding index (FI)=(solution consumption containing chemical reagents-only water consumption)/total consumption; 位置指數(shù)(PI)=(實驗組果蠅數(shù)目-對照組果蠅數(shù)目)/(實驗組果蠅數(shù)目+對照組果蠅數(shù)目) Position index (PI)=(number of flies in the experimental group-number of flies in the control group)/(number of flies in the experimental group+number of flies in the control group). 使用不添加大蒜素的食物作對照 Foods without allicin were used as the control.

2.2 大蒜素對黑腹果蠅攝食和位置效應(yīng)的影響

為了研究黑腹果蠅對大蒜素的攝食偏好性，利用毛細管攝食法進行檢測(圖2: A)。結(jié)果顯示，黑腹果蠅對5%蔗糖有顯著的攝食偏好，攝食指數(shù)(FI)為0.91，與已有報道(Prasad and Hens, 2018)一致; 而黑腹果蠅對0.01%和0.015%大蒜素的攝食呈現(xiàn)明顯避性反應(yīng)，F(xiàn)I分別為-0.76和-0.77，這與果蠅對大蒜素的產(chǎn)卵避性趨勢一致。在一定時間內(nèi)，產(chǎn)卵選擇裝置也能檢測果蠅對大蒜素的位置偏嗜性(圖2: B)。其結(jié)果顯示，果蠅對0.01%和0.015%的大蒜素呈現(xiàn)極顯著的位置避性(P<0.001)，其位置指數(shù)(PI)分別為-0.09和-0.22，表明果蠅對大蒜素產(chǎn)生位置排斥反應(yīng)。上述結(jié)果提示，攝食和位置可能會影響果蠅產(chǎn)卵選擇性，但是產(chǎn)卵選擇性是果蠅天生行為，具有其獨立性，有別于攝食與位置行為。

2.3 嗅覺系統(tǒng)介導(dǎo)黑腹果蠅雌成蟲對大蒜素的產(chǎn)卵避性

目前大蒜素是通過何種感覺系統(tǒng)影響果蠅的產(chǎn)卵避性反應(yīng)尚未可知，我們嘗試從以下幾個方面進行探究。利用暗盒檢測視覺系統(tǒng)是否介導(dǎo)果蠅對大蒜素的產(chǎn)卵避性反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑暗條件下，果蠅對大蒜素仍具有明顯的產(chǎn)卵避性，0.01%, 0.015%和0.02%大蒜素處理組果蠅的產(chǎn)卵指數(shù)分別為-0.59，-0.64和-0.68，與對照組無顯著差異(P>0.05)(圖3: A)，說明視覺不介導(dǎo)果蠅對大蒜素的產(chǎn)卵避性反應(yīng)。

圖3 嗅覺系統(tǒng)介導(dǎo)黑腹果蠅雌成蟲對大蒜素產(chǎn)卵避性Fig. 3 The olfactory system mediates the oviposition avoidance of female adults of Drosophila melanogaster to allicinA: 黑暗條件不影響果蠅對大蒜素產(chǎn)卵避性Darkness has no effect on the oviposition avoidance in Drosophila to allicin; B: 摘除前足的果蠅對大蒜素的產(chǎn)卵避性仍存在The oviposition avoidance in Drosophila with the foreleg removed to allicin is still present; C: 果蠅對大蒜素有趨避性Drosophila is repellent to allicin; D: 摘除觸角的果蠅對大蒜素產(chǎn)卵避性反應(yīng)明顯減弱 The oviposition avoidance response of Drosophila with antennae removed to allicin is obviously weakened; E: 突變體Orco2果蠅不影響其對大蒜素產(chǎn)卵避性The mutant Orco2of Drosophila does not affect its oviposition avoidance to allicin； F: 突變體TrpA1果蠅對大蒜素產(chǎn)卵避性顯著減弱 The mutant TrpA1 of Drosophila has significantly impaired oviposition avoidance to allicin. 反應(yīng)指數(shù)= (實驗組果蠅數(shù)-對照組果蠅數(shù))/(實驗組果蠅數(shù)+對照組果蠅數(shù)) Response index= (number of flies in the experimental group-number of flies in the control group)/(number of flies in the experimental group + number of flies in the control group). 產(chǎn)卵指數(shù)(OI)=(實驗組卵數(shù)-對照組卵數(shù))/(實驗組卵數(shù)+對照組卵數(shù))Oviposition index (OI)=(number of eggs in the experimental group-number of eggs in the control group)/(number of eggs in the experimental group+number of eggs in the control group). 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。柱上符號表示兩組間的差異顯著性(nsP>0.05; *0.010.05; *0.01

果蠅的味覺主要存在于初級味覺結(jié)構(gòu)上：唇瓣、前足、翼緣和產(chǎn)卵器等(Lingetal., 2014)。為了檢測味覺系統(tǒng)是否在果蠅對大蒜素的產(chǎn)卵避性反應(yīng)中起決定性作用，通常經(jīng)外科手術(shù)切除初級味覺器官(第一對胸足跗節(jié))，使果蠅喪失部分味覺感知。其結(jié)果顯示，除了波動大的低濃度大蒜素組,味覺系統(tǒng)的部分喪失并沒有改變果蠅對大蒜素的產(chǎn)卵避性反應(yīng)(P>0.05)(圖3: B)，表明味覺系統(tǒng)并沒有在果蠅對大蒜素的產(chǎn)卵避性反應(yīng)中起決定性的作用。

大蒜素還引起強烈的嗅覺刺激(Borlinghausetal., 2014)。為了驗證此觀點，使用Y迷宮實驗檢測大蒜素是否能引起果蠅的嗅覺刺激。其結(jié)果顯示，果蠅對大蒜素具有明顯的位置避性，反應(yīng)指數(shù)為-0.67(圖3: C)。果蠅的嗅覺系統(tǒng)主要位于觸角，經(jīng)外科手術(shù)切除嗅覺器官，可致果蠅喪失嗅覺感知。其結(jié)果顯示，0.01%, 0.015%和0.02%大蒜素處理組果蠅的產(chǎn)卵指數(shù)分別為-0.01, -0.04和-0.11(圖3: D)，說明嗅覺系統(tǒng)的喪失導(dǎo)致了果蠅對大蒜素的產(chǎn)卵避性反應(yīng)顯著降低，由此可知，正是嗅覺系統(tǒng)介導(dǎo)了果蠅對大蒜素的產(chǎn)卵避性反應(yīng)。為了進一步驗證嗅覺系統(tǒng)介導(dǎo)的這種行為，使用嗅覺系統(tǒng)突變體Orco2進行實驗。然而結(jié)果卻出乎意料，突變體Orco2仍然對大蒜素具有顯著的產(chǎn)卵避性反應(yīng)(圖3: E)，且與野生型果蠅OR無顯著差異(P>0.05)?？赡茉蚴潜M管突變體Orco2對大多數(shù)氣味喪失感知的，但是仍然可以感受到大蒜素氣味。

2.4 TRPA1介導(dǎo)黑腹果蠅雌成蟲對大蒜素的產(chǎn)卵避性

TRPA1是一種瞬時受體電位的非選擇性陽離子通道受體，可作為環(huán)境和有害刺激的生物傳感器。TrpA1突變體果蠅可喪失對刺激性物質(zhì)的感知，因此選擇TrpA1突變體果蠅進行產(chǎn)卵雙選擇實驗。與OR果蠅的產(chǎn)卵選擇行為相反，TrpA1突變體果蠅對0.01%, 0.015%和0.02%大蒜素避性減弱，OI分別為-0.09, -0.06和0.13(圖3: F)。以上結(jié)果表明，大蒜素對機體具有刺激性和毒害性。

2.5 大蒜素降低后代適合度

為探究在大蒜素影響下果蠅后代的發(fā)育和生長狀況，將果蠅的卵轉(zhuǎn)移到含不同濃度大蒜素的食物中，記錄果蠅成蛹和成蟲羽化時間。數(shù)據(jù)顯示，隨著大蒜素濃度增大，成蛹和成蟲羽化時間逐漸延長，其中在0.02%濃度時，成蛹時間比對照組延長了1.85 d(圖4: A)，成蟲羽化時間比對照組延長了1.88 d(圖4: B)。其結(jié)果說明， 大蒜素會引起果蠅的發(fā)育生長遲緩。為進一步驗證大蒜素對果蠅發(fā)育的毒害作用，分別計算了蛹和成蟲的存活率。與發(fā)育歷期結(jié)果一致，蛹和成蟲的存活率也隨著大蒜素濃度升高而下降，其中在0.02%濃度時，蛹存活率下降了26.01%，成蟲存活率下降了31.28%，與對照組差異極顯著(P<0.001)(圖4: C, D)。這表明大蒜素會降低后代適合度，同時也解釋了親代避開大蒜素產(chǎn)卵行為的原因。

圖4 大蒜素條件下黑腹果蠅后代的發(fā)育歷期和存活率Fig. 4 Developmental duration and survival rate of offspring of Drosophila melanogaster exposed to allicinA, B: 大蒜素延緩果蠅的成蛹和羽化 Allicin retards the puparium formation and adult eclosion of Drosophila; C, D: 大蒜素降低后代的存活率 Allicin reduces the survival rate of offspring. 成蛹和成蟲羽化時間均自初產(chǎn)卵開始計時。Time to puparium formation and time to adult eclosion were calculated from the beginning of spawning.

2.6 大蒜素對親代黑腹果蠅壽命和健康的影響

為檢測大蒜素是否對成蟲有危害作用，我們檢測了在不同濃度大蒜素條件下雌雄黑腹果蠅成蟲的壽命。在此實驗中，將果蠅暴露于含有大蒜素溶液的小管中，每天記錄存活的果蠅數(shù)。其結(jié)果顯示，隨著大蒜素濃度增大，果蠅雌雄成蟲壽命均顯著地縮短(P<0.05)(圖5: A, B)。通過奔跑與攀爬檢測果蠅的運動能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組(暴露于5%蔗糖溶液)果蠅奔跑速度為1.36 cm/s，經(jīng)0.1%大蒜素處理的果蠅奔跑速度為1.01 cm/s(圖5: C)，稍低于對照組速度。同樣地，經(jīng)0.1%大蒜素處理的果蠅攀爬速度要顯著慢于對照組果蠅(P<0.01)(圖5: D)?？偟膩碚f，大蒜素能縮短親代黑腹果蠅雌雄成蟲壽命，并對其運動能力造成一定的損傷，可降低親代的適合度。

圖5 大蒜素對黑腹果蠅成蟲壽命和健康的影響Fig. 5 Effects of allicin on longevity and health of Drosophila melanogaster adultsA, B: 大蒜素縮短雌雄果蠅成蟲壽命Allicin shortens the life span of female and male adults of Drosophila; C, D: 大蒜素損害果蠅健康A(chǔ)llicin damages Drosophila health. 存活率=當(dāng)天存活果蠅數(shù)目/當(dāng)天果蠅總數(shù)Survival rate= number of flies alive that day/total number of flies that day; 奔跑、攀爬速度=路程/時間Running and climbing speed=distance/time. 以置于5%蔗糖溶液中的果蠅為對照。不同濃度(0.02%, 0.05%和0.1%)大蒜素處理后48 h測定奔跑速度和攀爬速度。Flies exposed to 5% sucrose solution were used as the control. The running speed and climbing speed were tested at 48 h after treatment with allicin of different concentrations (0.02%, 0.05% and 0.1%).

2.7 大蒜素激活黑腹果蠅氧化應(yīng)激反應(yīng)

機體在遭受有害刺激時，會產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，從而引起應(yīng)激應(yīng)答(原慧萍和楊澤, 2015)。果蠅在攝取刺激性大蒜素后，可能激活一系列的應(yīng)激反應(yīng)。為驗證此推論，使用ROS熒光探針二氫乙啶(DHE)檢測黑腹果蠅成蟲腸道ROS含量，以評定對果蠅腸道的應(yīng)激水平。結(jié)果顯示，具有代表性的ROS熒光強度在0.02%大蒜素處理組比對照組(5%蔗糖溶液)更亮(圖6: A, B)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，0.02%大蒜素處理組的ROS熒光強度為162，明顯高于未處理果蠅的熒光強度93(圖6: C)，ROS水平增加。上述結(jié)果表明，大蒜素刺激黑腹果蠅腸道上皮細胞，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖6 大蒜素調(diào)節(jié)黑腹果蠅成蟲腸道內(nèi)ROS水平Fig. 6 Allicin regulates ROS level in the intestine of Drosophila melanogaster adultsA: 對照組，5%蔗糖溶液喂養(yǎng)3 d的果蠅成蟲腸道Control group, intestine of Drosophila adults fed with 5% sucrose solution for 3 d; B: 含0.02%大蒜素的5%蔗糖溶液喂養(yǎng)3 d的果蠅成蟲腸道Intestine of Drosophila adults fed with 5% sucrose solution containing 0.02% allicin for 3 d; C: 果蠅腸道細胞ROS熒光強度定量分析Quantitative analysis of ROS fluorescence intensity in Drosophila intestinal cells. 對不同溶液飼養(yǎng)3 d的果蠅成蟲進行解剖，對腸道進行染色，用二氫乙啶測定活性氧水平。Drosophila adults fed with different solutions for 3 d were dissected, the intestine was stained, and the ROS level was measured with dihydroethidium.

3 討論

對于植食性昆蟲來說，果蠅以腐爛水果為食，會與寄主植物進行長久的斗爭(Richmondetal., 1979)。因此，許多植物利用化學(xué)防御系統(tǒng)產(chǎn)生許多次級代謝產(chǎn)物。有研究結(jié)果表明，果蠅對多種有害物質(zhì)均產(chǎn)生強烈排斥反應(yīng)(Ebenetal., 2020)。眾所周知，大蒜素現(xiàn)已被證實為大蒜主要的活性成分(張庭廷等, 2007)。大蒜素具有強烈的臭味，并且接觸后會引起辛辣的痛覺(Macphersonetal., 2005)。果蠅產(chǎn)卵選擇行為可以用來檢測幼蟲和成蟲對刺激物的厭惡(Aietal., 2010; 王璐璐等, 2017)。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)果蠅在添加大蒜汁的食物和正常的食物之間進行選擇時，果蠅對大蒜汁有明顯的產(chǎn)卵避性(圖1: B)，并且大蒜素濃度越高，其產(chǎn)卵避性越明顯，且呈現(xiàn)一定的濃度梯度效應(yīng)(圖1: C， D)。以上結(jié)果說明果蠅對大蒜素的產(chǎn)卵避性不是由遺傳因素差異引起的。值得注意的是，大蒜素還可以引起攝食和位置回避，且攝食和位置回避行為與果蠅的產(chǎn)卵避性反應(yīng)存在一定的一致性，果蠅通過回避有濃度的大蒜素食物來降低對自身的危害性(圖2)。但事實上，產(chǎn)卵偏好并不總是與位置偏好相對應(yīng)，因為果蠅會對環(huán)境進行平衡預(yù)估，以確保其后代的生存。此外，在有或沒有大蒜素的情況下，雌性的產(chǎn)卵量相當(dāng)(圖1: E)。這表明大蒜素對成年雌果蠅的產(chǎn)卵能力影響可以忽略。

動物具有趨利避害的本能，其中嗅覺發(fā)揮著重要的作用，可介導(dǎo)動物趨避行為(Macphersonetal., 2005)。果蠅的觸角有嗅覺感受器(Heimbecketal., 1999)。經(jīng)外科手術(shù)切除嗅覺器官，可致果蠅喪失嗅覺感知。本研究結(jié)果表明，嗅覺系統(tǒng)的喪失導(dǎo)致了黑腹果蠅對大蒜素的產(chǎn)卵避性反應(yīng)明顯減弱，由此可知，果蠅對大蒜素的產(chǎn)卵避性反應(yīng)是由嗅覺系統(tǒng)介導(dǎo)的(圖3: C)。TRPA1是一種瞬時受體電位的非選擇性陽離子通道受體，可作為環(huán)境和有害刺激的生物傳感器，因此選擇TrpA1突變體果蠅進行產(chǎn)卵雙選擇實驗。研究表明，其產(chǎn)卵行為與OR果蠅選擇行為不同，并未出現(xiàn)明顯的產(chǎn)卵偏嗜性 (圖3: F)。TRPA1離子通道參與痛覺，同時也會被刺激性氣味物質(zhì)所激發(fā)(Latorreetal., 2007; Lietal., 2020)。研究表明人類TRPA1并不局限于對疼痛的感知，而是延伸到對氣味的感知，TRPA1在小鼠嗅覺上皮和嗅球中的表達已被證實(Schützetal., 2014)。由此推測，TRPA1作為一種有害刺激的生物傳感器，也可能會通過影響嗅覺進而影響果蠅的生物學(xué)行為。另外，避蚊胺(N,N-二乙基間甲酰胺)是世界上使用最廣泛的外用驅(qū)蚊劑，避蚊胺抑制食物氣味對果蠅的行為吸引，而這種抑制需要高度保守的嗅覺共受體OR83b(Ditzenetal., 2008)。由此可見，嗅覺系統(tǒng)在果蠅的趨避行為上起重要作用。

有研究表明大蒜精油對根蛆的存活率和繁殖率有很大的影響，特別是在其幼蟲期(Zhuetal., 2017)。據(jù)果蠅生態(tài)行為和資源需求可知，幼蟲移動能力有限，極易受到刺激物的攻擊，為了增加幼蟲的生存率，雌性成蟲必須選擇合適的產(chǎn)卵地點。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素會降低黑腹果蠅后代適合度，即大蒜素引起了果蠅后代發(fā)育與生長的遲緩，進一步驗證了大蒜素對果蠅生長發(fā)育的毒性(圖5: A, B)。這重要地解釋了親代避開大蒜素產(chǎn)卵行為 (圖1: C) 的原因。果蠅攝取的大蒜素通過消化系統(tǒng)與腸道上皮細胞發(fā)生相應(yīng)的反應(yīng)，對消化系統(tǒng)造成一定程度的損害，導(dǎo)致腸道屏障功能的紊亂(圖6)。腸道功能屏障是一個很好的預(yù)測指標(biāo)，動物們?yōu)榱诉m應(yīng)環(huán)境，它們通常會調(diào)節(jié)其先天免疫來達到腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)(Biteauetal., 2008)。本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素會影響中腸產(chǎn)生和清除ROS(圖6)，這可能對果蠅的健康及壽命造成不良后果。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)大蒜素會引起果蠅顯著的產(chǎn)卵避性反應(yīng)并降低其后代的存活率。大蒜素可作為一種綠色驅(qū)避劑，達到生物防治和環(huán)境保護的目的。然而，大蒜素是否對其他昆蟲同樣也具有毒害作用仍未可知，有待進一步研究。在機制上，大蒜素是否影響果蠅腸道菌群平衡而影響后代的生長發(fā)育，或許能夠進一步揭示果蠅分子病理學(xué)與生態(tài)行為之間的關(guān)系。