楊慧，楊天潤，馬子雲(yún)

(河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

黃酮類化合物是由兩個苯環(huán)通過三個碳原子相互連接而成的一系列化合物的總稱，具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)。該類化合物廣泛存在于自然界，在植物中含量豐富，較易獲得。同時，黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性，如抗氧化和清除自由基、抗感染、抗腫瘤、改善微循環(huán)等作用，在諸多疾病的臨床治療中效果顯著[1]。黃酮類化合物是很多中草藥中的有效活性成分，由于中藥成分復(fù)雜，含量測定時易受干擾，因而建立科學(xué)有效的測定方法對于中藥藥品質(zhì)量控制和藥理作用研究至關(guān)重要。現(xiàn)就黃酮類化合物含量測定方法作一綜述，為進一步研究提供參考。

反轉(zhuǎn)式教學(xué)作為一種新型教學(xué)模式在教育學(xué)界產(chǎn)生了巨大的反響，它顛覆了傳統(tǒng)的教學(xué)流程，利用網(wǎng)絡(luò)信息平臺，構(gòu)建了協(xié)助化和個性化學(xué)習(xí)平臺，學(xué)生可以根據(jù)自我學(xué)習(xí)情況進行自主安排，強調(diào)以學(xué)生為主體、關(guān)注學(xué)生個性特點進而達到理想的學(xué)習(xí)效果。與傳統(tǒng)的教學(xué)模式相比，反轉(zhuǎn)式教學(xué)運用了網(wǎng)絡(luò)高科技手段，體現(xiàn)了時代特征和新課程教學(xué)特點，未來發(fā)展前景廣闊，應(yīng)用在醫(yī)學(xué)繼續(xù)教育教學(xué)中有著重要作用。

1 高效液相色譜法

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)是一種具有分析速度快、檢測靈敏度高、分離效率高、應(yīng)用范圍廣、操作方便、重現(xiàn)性高等諸多特點的成分含量測定方法，是目前控制中藥制劑有效成分的重要手段[2]。呂琳等[3]分離出桑寄生中的黃酮類化合物，應(yīng)用HPLC法分別測定其中槲皮素和槲皮苷含量。槲皮素測定條件：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-水-冰醋酸(45∶55∶1.5)為流動相，檢測波長為370 nm。槲皮苷測定條件：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水-磷酸(14∶86∶0.2)為流動相，檢測波長為256 nm。結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，兩種物質(zhì)濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系，且精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性等均符合標(biāo)準(zhǔn)。張云麗等[4]采用Fortis C18色譜柱(4.0 mm×150 mm，2.5μm)，流動相為甲醇∶乙腈∶0.2%磷酸水緩沖溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，柱溫為 28 ℃，檢測波長為225 nm，測定半枝蓮提取物中黃酮類成分野黃芩苷、木犀草素的含量。測定過程中采取梯度洗脫的方法，使兩種成分的色譜峰得到較好分離，并具有合適的保留時間，測定結(jié)果更準(zhǔn)確。張憲等[5]用該方法測定了不同產(chǎn)地桑葉中6種黃酮類成分的含量，并進行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率試驗。精密度試驗、穩(wěn)定性試驗檢測色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于1%，表明檢測儀器與操作符合精密度的要求。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地桑葉中6種黃酮類成分的含量差異較大，提示不同產(chǎn)地桑葉中黃酮的含量有差異，且HPLC測定桑葉中黃酮類成分的含量操作簡便、穩(wěn)定性及重復(fù)性較好。該結(jié)果為桑葉中黃酮類成分的后續(xù)研究提供了支持，也為比較不同產(chǎn)地中藥材有效成分含量差異和選擇藥用植物生長的適宜條件提供了思路。

小手術(shù)，微創(chuàng)。就兩個小洞。這會麻藥還沒過，等過了叫小涵電話你。你可千萬不要急著過來，晚上我陪著她，你放心。

此外，HPLC法在中藥復(fù)方制劑的有效成分分離測定中也得到了廣泛應(yīng)用。徐占方等[6]建立了同時測定雙黃消炎片中黃芩苷和黃芩素含量的反相高效液相色譜法；顧英琳等[7]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器建立了同時測定蒼耳子鼻炎膠囊中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素4個成分含量的方法；王曉月等[8]同時測定了黃芩射干湯中射干苷、野鳶尾苷、黃芩苷、漢黃芩苷、鳶尾黃素、黃芩素、次野鳶尾黃素、千層紙素A等8種有效成分含量；孔艷娥等[9]對胃病丸中8種有效成分——連翹酯苷A、橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、和厚樸酚、厚樸酚的含量進行了測定。

比色法在紫外-可見分光光度法的基礎(chǔ)上，在待測物質(zhì)溶液中加入顯色劑，將其最大吸收波長控制在可見光區(qū)域，利用分光光度計測定物質(zhì)含量。王嘉琛等[16]以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色體系,測定中藥墓頭回中總黃酮的含量，并以吸光度為指標(biāo)，對影響墓頭回中總黃酮測定的反應(yīng)溫度、顯色時間、顯色劑用量進行考察，通過正交實驗，確定了最佳顯色方式。刁海鵬等[17]在NaNO2-AlCl3-NaOH顯色條件下測定了蒲公英花中總黃酮的含量。龔受基等[18]也使用該顯色方法測定了大田基黃中總黃酮含量，并對其提取物在抗乙肝病毒中的作用進行研究。龍躍等[19]對AlCl3比色法的顯色條件進行了優(yōu)化實驗，確定了AlCl3比色法測定中草藥中總黃酮含量的最優(yōu)條件，在pH為5.2的NaAc-HAc緩沖溶液條件下，加入AlCl3，對雀兒舌頭中總黃酮含量進行了測定，溶液體系在室溫下穩(wěn)定性良好，60 min內(nèi)吸光度幾無變化。熱毛先等[20]對比研究了紫外直接測定法、AlCl3顯色法、NaNO2顯色法和HCl-Mg顯色法在甘青青蘭總黃酮測定時的應(yīng)用，確定HCl-Mg顯色法測定更準(zhǔn)確，對黃酮類化合物具有很強的專屬性，優(yōu)于其他方法。

2 分光光度法

當(dāng)黃酮分子中具有3-羥基(5-羥基)時，可與 Al3+、鈹?shù)入x子形成一種穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物，即為熒光光度測定黃酮類化合物的基礎(chǔ)[21]。吳水華[22]選用槲皮素作為對照品，采用熒光法對福建野生金線蓮中的總黃酮含量進行測定，測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏。黃肖楨等[23]用此法測定銀杏葉提取物中總黃酮含量，實驗結(jié)果表明，所采用的方法操作簡便，檢測高效快速，結(jié)果準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好，適合用于銀杏葉提取物中總黃酮含量的測定。李祥昀等[24]改進測定過程中的熒光條件，建立了一種簡便、快捷定量檢測黃芩中黃芩苷的新方法。該方法依據(jù)黃芩苷的抗氧化性和4，4’-二疊氮二苯乙烯-2，2’-二磺酸二鈉四水合物(DES)還原產(chǎn)物的熒光特性，利用黃芩苷可將DES中的疊氮基團還原為氨基這一反應(yīng)，通過檢測 DES 還原產(chǎn)物的熒光信號強度，確定黃芩提取液中黃芩苷的含量。這種黃芩苷測定方法，具有良好的抗干擾性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

近年來，隨著儀器制造水平的提升，各類輔助分析技術(shù)的豐富，近紅外光譜技術(shù)得到了快速發(fā)展，并廣泛應(yīng)用于科研及生產(chǎn)過程，應(yīng)用范圍涉及農(nóng)業(yè)、化工、食品、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域[25]。Shi等[26]利用近紅外光譜法快速、無損地測定銀杏葉中總黃酮含量，并以總黃酮含量為指標(biāo)，對不同顏色銀杏葉進行了質(zhì)量評價。阿依古麗·塔什波拉提等[27]應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)開展羅布麻葉中總黃酮無損快速檢測方法研究，采用近紅外光譜分析技術(shù)獲取羅布麻葉的光譜信息，建立羅布麻葉中總黃酮含量的近紅外定量分析校正模型，可在 30 s內(nèi)對未知羅布麻葉中總黃酮含量進行無損檢測。近紅外光譜法的應(yīng)用優(yōu)勢主要在于對中藥樣品的無損檢測，樣品可不經(jīng)提取分離，只需簡單粉碎便可進行測定，避免了測定過程中有效成分結(jié)構(gòu)的破壞，也減少了提取時化學(xué)試劑的使用和藥品的浪費。同時，近紅外光譜技術(shù)與化學(xué)計量學(xué)方法相結(jié)合，可建立起定量分析模型，實現(xiàn)快速準(zhǔn)確測定。

2.1 紫外-可見分光光度法

韓秋偉[11]和鄖海麗等[12]分別利用紫外-可見分光光度法測定了雙黃連顆粒和小兒清熱寧顆粒中黃芩苷的含量，并與HPLC法相比較，測得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。任強等[13]用紫外-可見分光光度法測定了不同產(chǎn)地半枝蓮中總黃酮的含量，通過回收率實驗，證明該方法準(zhǔn)確度較高。然而，紫外-可見分光光度法吸收光譜特征性不強、分離度較差，且中草藥成分復(fù)雜，各物質(zhì)結(jié)構(gòu)上存在相似性，某一種物質(zhì)含量的測定結(jié)果往往會受到其他成分的干擾，因而該方法在實際使用中得到了一定改進。彭易蘭等[14]采用紫外-可見分光光度法測定黃芩黃酮總苷元提取物中總黃酮，用HPLC法測定其中黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A的含量。蔡朝紅等[15]以黃芩苷為標(biāo)樣，采用紫外雙波長分光光度法，分別以289 nm 和 353 nm作為測定波長和參比波長，測定了黃連解毒湯中黃芩苷含量。在該實驗中，樣品可不經(jīng)分離稀釋后直接測定，操作簡便，避免了各組分之間的相互影響。

2.2 比色法

HPLC法廣泛應(yīng)用于中草藥中有效成分的含量測定，尤其是在多組分同時測定中起到了重要作用。在上述研究中，各成分均得到了良好的分離效果，測定結(jié)果準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、操作簡便。

對照組采用常規(guī)西醫(yī)治療方法,實驗組則采用中西醫(yī)結(jié)合方法。對兩組患者的治療效果進行比較。實驗組的治療總有效率為97.62%,而對照組的總有效率為76.75%。實驗組的治療效果顯著于對照組。并且,兩組患者在接受治療后,實驗組的抗卵巢抗體、抗精子抗體和抗子宮內(nèi)膜抗體的轉(zhuǎn)陰率均高于對照組,其中,兩組數(shù)據(jù)均P<0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明:中西醫(yī)結(jié)合方法在治療免疫性不孕不育中的臨床應(yīng)用效果顯著。

2.3 熒光分光光度法

分光光度法是利用物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，以朗伯-比爾定律為理論基礎(chǔ)，建立起來的對物質(zhì)進行定性和定量分析的儀器分析方法。作為一種目前應(yīng)用較多的食品藥品分析方法，其靈敏度高、準(zhǔn)確度較高、操作簡便?，F(xiàn)有的研究成果中，分光光度法可應(yīng)用于食品中營養(yǎng)物質(zhì)、重金屬含量、農(nóng)藥殘留情況以及食品添加劑的測定。同時，該方法在藥品有效成分的定性與定量分析中也占據(jù)重要地位[10]。

2.4 近紅外光譜法

11月26日下午至27日，浙江省自然資源廳執(zhí)法監(jiān)察局在杭州組織召開了2018年全省國土資源執(zhí)法案卷質(zhì)量評查工作會議。會議匯報交流了案卷質(zhì)量評查工作開展情況和2018年工作思路，對全省各地上報的2018年度參評案卷質(zhì)量集中評查。浙江省自然資源廳相關(guān)處室負(fù)責(zé)人，各設(shè)區(qū)市和有關(guān)縣（市、區(qū)）執(zhí)法監(jiān)察系統(tǒng)負(fù)責(zé)人參加了會議。

3 多方法聯(lián)合測定

由于單一檢測方法具有一定局限性，加之各技術(shù)在中藥成分分離測定中的應(yīng)用日益廣泛，一些聯(lián)合測定方法逐漸被應(yīng)用于中藥黃酮類化合物的測定。如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)集液相色譜高分離能力和質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)解析能力于一體，具有高靈敏度、高分辨率、快速、穩(wěn)定等特點，是黃酮類等復(fù)雜化合物同時定性定量分析的重要技術(shù)手段[28]。Li等[29]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法建立了同時測定竹葉中10種主要功能性黃酮類化合物的分析方法，校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999 5～0.999 7，檢測線為45 ng/mL。段云[30]利用超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定了黃芩提取物中黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、野黃芩苷等4種黃酮類成分的含量，檢出限為0.3～1.5 μg/kg，靈敏度較高。Hadi等[31]將薄層色譜和紫外-可見分光光度法聯(lián)合，對黃秋葵果實中黃酮化合物進行定性分析和含量測定，這種方法相較于單一的紫外-可見分光光度法更準(zhǔn)確。此外，高效液相色譜-二極管陣列檢測-蒸發(fā)光散射檢測法、超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)法、紅外光譜三級鑒別法聯(lián)合高效液相色譜-質(zhì)譜法[32-34]在中藥黃酮類化合物的分析與測定中均有應(yīng)用。

作為中國寶貴的藥用資源，中草藥的研究和應(yīng)用在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中均占據(jù)重要地位。中藥有效成分的提取、分離、鑒定及藥理作用是近年來國內(nèi)研究的熱點，但由于中藥成分復(fù)雜，有效成分及作用機制難以解析，因此對中草藥有效成分進行分離分析，明確所含成分及含量對藥品質(zhì)量控制及作用機理研究具有重要意義。在有效成分的含量測定方面，諸多方法各具優(yōu)勢，如紫外分光光度法操作簡便、經(jīng)濟實用，適用于植物中總黃酮含量的粗略測定；HPLC可將各成分進行分離測定，目前應(yīng)用較多。同時，隨著原有技術(shù)的不斷改進和化學(xué)計量學(xué)方法的結(jié)合，逐步建立起更多的測定方法，測定精度增高、測定時間縮短、操作程序簡化、資源節(jié)約、污染減少是測定方法發(fā)展的必然趨勢，未來必將有更多優(yōu)良方案供研究者選擇，以滿足不同的測定需求。