郭邦成，李 娜，張燕飛，魏 瓊，劉 翔，郝 瓊

沙門菌是一種人獸共患病病原菌，亦為食源性疾病暴發(fā)的主要病原菌，目前已發(fā)現(xiàn)血清型別多達(dá)2 700多種[1]，由沙門菌感染引起的患病人數(shù)呈快速上升趨勢，WHO對沙門菌感染十分重視，早在2000年就成立世界范圍的全球沙門菌監(jiān)測系統(tǒng)[2]，寧夏疾病預(yù)防控制中心從2011年起加入食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測項(xiàng)目，全面監(jiān)測本地區(qū)食品及臨床沙門菌的分布與傳播，及對常用抗菌藥物的耐藥程度。本研究對2014-2020年分離自食品和病例中的188株沙門菌進(jìn)行血清型、耐藥性及PFGE分子分型，為深入了解寧夏地區(qū)不同來源沙門菌的耐藥性及分子分型特點(diǎn)，用于指導(dǎo)臨床合理用藥和腸道傳染病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集寧夏2014-2020年5個(gè)市級食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測點(diǎn)和15家食源性疾病哨點(diǎn)醫(yī)院188株沙門菌，生化鑒定、血清凝集復(fù)核后，進(jìn)行PFGE分子分型和藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與設(shè)備

1.2.1 試劑 選擇性平板(麥康凱、XLD)等購自環(huán)凱生物公司；科瑪嘉鑒定培養(yǎng)基購自法國 CHROMAgar 公司；藥敏平板購自上海星佰科技生物有限公司；沙門氏菌診斷血清購自丹麥SSI公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ購自NEB公司；Seakem Glod瓊脂糖購自美國LONZA公司；Tris-Hcl、SDS、EDTA等購自Souarbio Life scienses公司；

1.2.2 儀器 飛行質(zhì)譜儀購自Bruker公司。凝膠成像儀及脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。全自動藥敏判讀儀、加樣儀購自上海星佰科技生物有限公司。

1.3 菌株復(fù)核 將監(jiān)測點(diǎn)上送可疑沙門菌分離株劃線接種MAC、XLD及科瑪嘉顯色培養(yǎng)基36 ℃培養(yǎng)18 h，挑取可疑菌落經(jīng)飛行質(zhì)譜儀鑒定，沙門氏菌血清分型。

1.4 藥敏試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法測定抗生素的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，具體按照上海星佰科技生物有限公司提供的操作步驟進(jìn)行。

1.5 脈沖場凝膠電泳分型 按照國家致病菌識別網(wǎng)分型方案進(jìn)行[3-5]。沙門菌經(jīng)過包埋固定、裂解、洗滌后，采用XbaI酶切2.5 h，使用Chef Mapper脈沖場凝膠電泳分型，電泳時(shí)間為18 h，電泳溫度為14 ℃，脈沖時(shí)間為2.16～63.8 s。凝膠使用GelRed染色后成像。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 使用BioNumerics軟件處理PFGE成像譜圖，采用基于條帶比較的Dice系數(shù)衡量PFGE帶型之間的相似度，相似度為100%被視為同一PFGE型。

2 結(jié) 果

2.1 血清型分布 2014-2020年共分離沙門菌188株，其中病人來源154株，占所有分離株的81.91%，經(jīng)血清鑒定，共分屬19個(gè)血清型，以腸炎沙門菌為主，占分離菌株的49.35%，其次為鼠傷寒沙氏菌，占22.08%；食品來源34株，分屬7個(gè)血清型，腸炎沙門菌亦為主要型別，占52.94%，其次為沙門菌Ⅱ，占26.47%。無論是病例來源還是食品來源，血清型均表現(xiàn)為多樣性，優(yōu)勢型別明顯，具體結(jié)果見表1。

2.2 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 188株沙門菌采用肉湯稀釋法進(jìn)行14種抗生素的藥物敏感性試驗(yàn)，182株菌均出現(xiàn)不同程度的耐藥和多重耐藥。分離株對氨芐西林(AMP)、四環(huán)素(TET)、萘啶酸(NAL)、頭孢唑林(CFZ)均呈現(xiàn)較高的耐藥性。病例和食品來源菌株絕大多數(shù)出現(xiàn)2～12種抗生素耐藥現(xiàn)象。152株病例來源菌株發(fā)現(xiàn)17個(gè)耐藥譜，30株食品來源菌株發(fā)現(xiàn)6個(gè)耐藥譜。不同來源菌株的優(yōu)勢耐藥譜均為CHL-GEN-TET-CTX-AMP-CFZ-SXT(見表2、表3和表4)。

表2 不同來源沙門菌對14種抗生素耐藥情況

表3 病例來源沙門菌耐藥譜分布情況(n=30)

表4 食品來源沙門菌耐藥譜分布情況(n=152)

2.3 脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型結(jié)果 188株不同來源分離株采用XbaI酶切后，共分為93個(gè)不同的PFGE帶型，相似度為42.1%～97.1%，優(yōu)勢帶型為NXSM0065型為15株，占7.99%；其次為NXSM0074和NXSM0069型各13株，分別占6.91%(見圖1)。

圖1 188株沙門菌PFGE聚類分析圖譜

3 討 論

近年來沙門菌在寧夏地區(qū)流行呈現(xiàn)以散發(fā)為主，部分地區(qū)時(shí)有小范圍暴發(fā)。本研究對2014-2020年分離的188株沙門菌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多年來寧夏地區(qū)沙門菌流行特征未發(fā)生明顯變化，分離株共分為19個(gè)血清型，病例和食品來源菌株血清型均表現(xiàn)為多樣性，優(yōu)勢血清型明顯，以腸炎沙門菌為主，其次為鼠傷寒沙門菌和沙門菌Ⅱ。與林茂銳等研究廣東省以鼠傷寒沙門菌為主，其次為腸炎沙門菌不一致[1]。

抗生素濫用是造成病原菌耐藥問題日益突出的主要原因[6-8]。從本研究結(jié)果來看，寧夏地區(qū)沙門菌耐藥性十分嚴(yán)重，188株分離株僅有6株為敏感菌株，多數(shù)來源于食品，其余菌株均出現(xiàn)不同程度的耐藥性。尤其對氨芐西林(AMP)、四環(huán)素(TET)、萘啶酸(NAL)、頭孢唑林(CFZ)均呈現(xiàn)較高的耐藥性。其多重耐藥情況也非常嚴(yán)重，152株病例來源菌株發(fā)現(xiàn)17個(gè)耐藥譜，耐2～4種抗生素77株(50.66%)， 耐5～8種抗生素50株(32.89%)，耐9～12種抗生素21株(13.82%)。30株食品來源菌株發(fā)現(xiàn)6個(gè)耐藥譜，耐2～4種抗生素24株(80.00%)， 耐5～8種抗生素2株(6.67%)，耐9～12種抗生素2株(6.67%)。不同來源菌株的優(yōu)勢耐藥譜均為CHL-GEN-TET-CTX-AMP-CFZ-SXT。從耐藥譜來看，寧夏地區(qū)沙門菌對臨床上應(yīng)用逐步減少的氨芐西林(AMP)、四環(huán)素(TET)、萘啶酸(NAL)仍然呈現(xiàn)高耐藥性，間接表明在動物養(yǎng)殖方面存在該類抗生素的濫用現(xiàn)象。同時(shí)頭孢唑林(CFZ)、頭孢噻肟(CTX)等臨床一線抗生素亦呈現(xiàn)高耐藥現(xiàn)象，從臨床和公共衛(wèi)生角度值得我們高度關(guān)注。

PFGE是近年來快速發(fā)展的傳染性病原菌分子分型技術(shù)。依托這種技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)化實(shí)驗(yàn)室實(shí)時(shí)監(jiān)測、交換和比對數(shù)據(jù)，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)、識別聚集性病例，為食源性傳染病早期預(yù)測預(yù)警，暴發(fā)疫情與突發(fā)公共衛(wèi)生事件的調(diào)查與現(xiàn)場處置提供了強(qiáng)有力的武器[9-10]。本研究利用該技術(shù)分析了寧夏沙門菌PFGE利指紋圖譜”特征與優(yōu)勢帶型，積累了分子流行病學(xué)基線數(shù)據(jù)；從分型結(jié)果來看，寧夏地區(qū)沙門菌無論病例來源還是食品來源，相同血清型菌株同源性較高，優(yōu)勢型別較為明顯。耐藥性和PFGE帶型上沒有體現(xiàn)出明顯的關(guān)聯(lián)性，同一耐藥譜菌株P(guān)FGE型別呈現(xiàn)多樣性，與林茂銳等對廣東省沙門菌耐藥性和分子分型研究結(jié)果相一致[1]。

利益沖突：無

引用本文格式：郭邦成，李 娜，張燕飛，等. 2014-2020年寧夏沙門菌分子分型與耐藥性研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(2)：145-149. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.021