張 旭，吳萍萍，王 琪，印海鋒，宋紹萱

（淮北師范大學 生命科學學院，安徽 淮北 235000）

0 引言

腺水螨屬Lebertia Neumank，1880隸屬于蜱螨亞綱Acari，真螨總目Acariformes，絨螨目Trombidiformes，前氣門亞目Prostigmata，大赤螨總股Anystides，寄殖螨股Parasitengonina，水螨亞股Hydrachnidiae，腺水螨總科Lebertioidea［1］.腺水螨屬種類分布廣泛，遍及各大地理區(qū)系的淡水水體中，是底棲節(jié)肢動物的重要組成部分.腺水螨的幼螨寄生于蚊、蠓等衛(wèi)生害蟲體表，影響寄主的生長發(fā)育甚至造成寄主死亡.因而腺水螨可以被用作害蟲的生物防治［2］.目前世界已記錄腺水螨種類300余種，但由于腺水螨屬種類體型微小（0.5～2 mm），形態(tài)構造復雜，傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定需要對螨體解剖，操作過程繁瑣，不僅耗時較長，且對鑒定者的專業(yè)水平要求較高.

DNA條形碼是Herbert在2003年提出的生物分子鑒定技術，該技術是利用生物體內線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ（Cytochrome c oxidase subunit I，COⅠ）基因序列的差異實現對物種的快速鑒定［3］.該技術對鑒定者的專業(yè)背景沒有特別的要求，鑒定過程簡單，省時.近年來DNA條形碼技術在動物物種鑒定方面得到廣泛發(fā)展，特別是體型較小，形態(tài)特征構造復雜，利用常規(guī)的形態(tài)學鑒定較為困難的無脊椎動物［4］.目前，國內外對于腺水螨屬的研究多集中在形態(tài)分類上，而關于腺水螨屬的分子鑒定技術還未曾有報道.本研究是以GenBank上獲取腺水螨屬的16個物種93條的COⅠ序列為研究材料，通過分子序列的分析，探究DNA條形碼技術在腺水螨屬鑒定中的可行性，為以后腺水螨屬的快速鑒定提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料來源

在GenBank數據庫中，以腺水螨屬和COⅠ基因為關鍵詞搜索，為提高數據的可信度，選擇已經有文獻支持并公開發(fā)表序列，剔除物種信息不明的種類（僅選擇包含詳細的種名和屬名的物種）.最終下載腺水螨屬16個物種93條序列（樣品信息詳見表1）［5-8］.

表1 樣品信息

1.2 序列分析

用MEGA 7.0軟件對93條COⅠ序列進行比對，將冗余序列刪除，計算堿基組成、變異位點、保守位點、簡約信息位點；運用DAMBE 6.4.67軟件對序列飽和度進行分析，橫坐標為TN93模型校正距離，縱坐標為堿基替代頻率，進行散點分析；基于K2P（Kimura-2-Parameter）模型計算種內、種間遺傳距離；以Sperchonopsis ecphyma（Genbank登錄號：MF124252）和Sperchon rostratus（Genbank登錄號：MF124257）為外群選擇鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Bootstrap值進行1 000次重復檢測驗證樹上各節(jié)點的支持率.運用ABGD軟件，在一定的遺傳距離范圍內對樣本進行劃分.將93條COⅠ序列提交至ABGD網站，種內差異先驗值P為0.001到0.1，最小相對gap寬度值X（minimum relative gap width）為0.6，steps值設為20.

2 結果與分析

2.1 堿基序列特征

使用MEGA 7.0軟件對93條COⅠ序列進行比對后，最終保留608 bp的同源序列，序列中沒有缺失或者插入的現象.T、C、A、G的平均含量分別為34.1%、18.9%、31.8%、15.2%，C+G的含量（34.1%）小于A+T的含量（65.9%），這與節(jié)肢動物序列特征相似，有明顯的堿基偏好性.特別是在第3位密碼子A+T含量高達85.2%，G含量的平均值僅有3.5%，C含量的平均值與A、T相比也較低，為11.3%.保守位點、變異位點和簡約信息位點的含量為387個、221個、212個，在608 bp位點中分別占63.65%、36.35%和34.87%，變異位點大多數在第3核酸位點.

表2 16種腺水螨93條COⅠ基因序列堿基序列特征 %

2.2 堿基替換分析

應用MEGA 7.0軟件進行堿基替換分析，在16種腺水螨的93條序列中，核苷酸替換多數為一致替換，為524個，轉換數（S）和顛換數（V）的比值為1.1，顛換數和轉換數的平均值分別為41和44.在第1、2、3位點的轉換數和顛換數的比值為3.9、10.5、0.8.轉換和顛換主要發(fā)生在第3位點，轉換數為31個，頻率總數為72.0%；顛換數為37個，頻率總數為92.5%.通過DAMBE 6.4.67軟件進行序列飽和度分析，飽和度分析散點圖（圖1）表明，遺傳距離與堿基替換頻率呈線性增加的關系，沒有出現飽和態(tài)趨勢，可以建立系統(tǒng)發(fā)育樹.

圖1 基于CO I基因序列堿基替換飽和度

2.3 遺傳距離分析

在MEGA 7.0軟件中，基于K2P（Kimura-2-Parameter）模型計算16種腺水螨的種內、種間遺傳距離，結果顯示（見表3），種內遺傳距離變動范圍0～0.07，其中種內遺傳距離大于2%的有2種，分別為L.porosa0.07和L.schechteli0.023，其余種內遺傳距離均小于2%.種間遺傳距離變動范圍為0.025～0.218.除L.porosa和L.schechteli外，其余物種的種間平均遺傳距離為0.147，種內平均遺傳距離為0.003，種間平均遺傳距離是種內平均遺傳距離的49倍.

表3 基于COⅠ基因序列16種腺水螨的種內和種間的遺傳距離

2.4 ABGD的評估結果

93條序列ABGD的評估結果顯示，ABGD法可以明顯出現條形碼間隙（圖2a）.物種劃分結果見圖2b，包括初始劃分和遞歸劃分，初始劃分較為穩(wěn)定，遺傳距離在0.001～0.100之間，被劃分為13個物種，少于形態(tài)學分類結果，而遞歸劃分結果顯示，遺傳距離在0.001、0.001 274、0.001 624時支持27個物種；在0.002 069、0.002 637時，支持24個物種；在0.003 360、0.004 281、0.005 456時，支持23個物種；在0.006 952時，支持22個物種；在0.008 859時，支持21個物種；在0.011 288時，支持20個物種；在0.014 384、0.018 330、0.023 357時，支持19個物種；在0.029 764、0.037 927時，支持16個物種；在0.048 329、0.061 585時，支持15個物種；在0.078 476、0.100 000時，支持13個物種.P值在0.014 384、0.018 330、0.023 357時，和鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹所評估的物種數量相同.

圖2 基于ABGD腺水螨屬部分物種分析結果

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

在MEGA 7.0軟件中以Sperchonopsis ecphyma和Sperchon rostratus作為外群［9］，以NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示（見圖3），除L.porosa聚集為3支外，其余不同的物種均能聚為單系，例如L.schechteli的12條序列、L.maculosa的7條序列、L.salebrosa的4條序列、L.reticulata的3條序列等均以100%的高支持率聚集為一支.

ABGD所劃分的物種與NJ所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹稍有區(qū)別（圖3）.ABGD除將L.porosa劃分為3個組外，還將L.schechteli劃分為2個組，其余劃分與形態(tài)結果一致.

圖3 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹和ABGD劃分結果

3 討論

水螨亞股Hydrachnidiae是蜱螨亞綱中一類體型微小，形態(tài)構造復雜的類群.近年來，隨著分類人員隊伍的萎縮，水螨的形態(tài)鑒定面臨著更大的困難.DNA條形碼技術的出現，為解決這一困難提供可能.目前，水螨類群中的Brachypodopsis、Krendowskia、Koenikea、Hygrobates、Sperchon等已經開始使用DNA條形碼進行輔助鑒定，并取得較好的效果［10-13］.然而，腺水螨屬的DNA條形碼研究未曾開展.本研究利用Genbank中下載的腺水螨93條COI基因序列進行DNA條形碼的分析，探討其在腺水螨類群中適用性.

Hebert對DNA條形碼研究后曾提出，動物種內遺傳差異2%的閾值和種間差異為種內差異10×的標準［3，14］.本研究的16種腺水螨中，L.porosa和L.schechteli的種內遺傳距離大于2%，其余物種的種內遺傳距離均小于2%，僅L.porosa和L.schechteli不符合Hebert提出2%的閾值.除L.porosa和L.schechteli外，種間平均遺傳距離是種內平均遺傳距離的49倍，符合10×的標準.

為繼續(xù)驗證COI基因是否可以應用于腺水螨屬的DNA條形碼序列，本研究應用ABGD軟件進行物種劃分并構建系統(tǒng)發(fā)育樹.ABGD對物種的劃分結果顯示，可以形成明顯的條形碼間隙，并將L.porosa劃分為3個組，L.schechteli劃分為2個組.系統(tǒng)發(fā)育樹的結果顯示，除L.porosa分為3個分支外，其余的物種均能以100%的高支持率聚為單獨的一支.系統(tǒng)發(fā)育樹的劃分結果和ABGD對物種的劃分結果基本相同.

由遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育樹和ABGD的分析結果來看，本研究所使用的16種腺水螨，除L.porosa和L.schechteli，其余腺水螨均能夠使用COI基因片段作為DNA條形碼進行區(qū)分.Pe?i?等［10-11］通過分子序列的研究已經證實，在Hygrobates和Brachypodopsis等水螨物種中可能存在隱存種，本研究中的L.porosa和L.schechteli遺傳距離大于2%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中分為不同的分支，ABGD劃分為不同的物種，這些均顯示L.porosa和L.schechteli中可能存在隱存種.如果要進一步確定隱存種，還需要更多的形態(tài)研究和分子數據分析.

DNA條形碼技術發(fā)展至今已經成為形態(tài)學鑒定的有效補充，本研究的結果也證明DNA條形碼可以用于腺水螨屬的物種鑒定.但本研究所涉及的物種數有限，是否能夠適用于所有的腺水螨，還需要后續(xù)深入的研究.同時，也要注意在進行DNA條形碼分析時不能完全脫離形態(tài)分類研究，兩者相輔相成，才能促進分類學的發(fā)展［15］.