惠燕，周晗璟，羅金，王雅琴，張怡，謝青貞*，漆倩榮*

(1.武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，武漢 430060；2.三峽大學第一臨床醫(yī)學院，宜昌市中心人民醫(yī)院，宜昌 443003)

體外受精(IVF)和卵胞漿內單精子注射(ICSI)是治療不孕不育的主要方法，IVF主要適用于輸卵管性不孕、排卵障礙等非男性因素的不孕患者，而ICSI適用于男性因素不育、前次IVF受精失敗、胚胎植入前遺傳學檢測的患者[1]。目前IVF方法主要分為常規(guī)IVF和短時IVF兩種。常規(guī)IVF是將卵母細胞和精子共培養(yǎng)過夜后(16～20 h)進行脫顆粒；而短時IVF是將精子與卵母細胞共培養(yǎng)4～6 h進行脫顆粒，若出現受精失敗或受精率不理想(2pb率<30%)，可及時進行早期補救性ICSI(rescue ICSI，R-ICSI)以提高受精率。在精子質量正常的情況下仍有一部分患者會出現完全受精失敗(TFF)或受精結果不理想。據報道，TFF的發(fā)生率為5%～20%，其可能的原因是精卵功能異常或精卵結合障礙，但很難在每個受精失敗周期中進行研究以明確原因[2]。盡管已經證實短時IVF結合早期R-ICSI可有效降低周期取消率，但臨床上IVF失敗的預測仍非常困難，同時R-ICSI是否對妊娠結局有不利影響也存在爭議[3]。本研究回顧性分析了我中心2016年1月至2019年12月進行的短時IVF周期，比較短時IVF組與早期R-ICSI組患者的臨床特點和妊娠結局，以確定短時IVF失敗的潛在影響因素以及R-ICSI對妊娠結局的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心2016年1月至2019年12月共8 107個短時IVF周期的臨床及胚胎實驗室資料。根據短時IVF周期是否進行了R-ICSI分為短時IVF組(n=7 214)和R-ICSI 組(n=893)。

納入標準：(1)在我中心行短時IVF助孕的患者；(2)短時IVF成功組(短時IVF組)：短時受精評估受精率>30%；(3)R-ICSI組：短時觀察受精率<30%并進行了R-ICSI。

二、診療回顧

1.控制性促排卵：本研究將不孕原因大致分為女方因素(包括輸卵管因素、排卵障礙、子宮內膜異位癥等可證實的女性不孕原因)、男方因素(精子數量或質量受損、無精子癥致供體精液、性功能障礙等)以及不明原因不孕。根據患者情況采用本中心標準黃體期長方案、卵泡期長方案、拮抗劑、以及高孕激素狀態(tài)下促排卵方案(PPOS)等方案進行促排卵。根據患者卵巢反應、激素水平及卵泡大小調整促性腺激素(Gn)劑量，當卵泡直徑和激素水平達到扳機標準時，給予劑量為5 000～10 000 U HCG進行扳機，36 h后進行超聲引導下取卵，具體方法參考本中心已發(fā)表文獻[4]。所有患者均簽署了IVF治療和隨訪的知情同意書。

2.精子準備、短時IVF和R-ICSI：取卵時采集精液標本，37℃下至少液化30 min。根據WHO第5版人類精液檢查與處理實驗手冊對精液標本的精子濃度、形態(tài)和前向運動進行評估，符合IVF指征的精液標本采用密度梯度離心+上游法處理，收集上游后的精子與卵丘-卵母細胞復合體在受精培養(yǎng)液(COOK，澳大利亞)中進行IVF。受精后4～6 h進行脫顆粒，在顯微鏡下觀察第二極體(2pb)排出情況。如果2pb比例低于30%則進行R-ICSI：將具有正常形態(tài)的活動精子在PVP液滴中制動后，顯微注射到未受精的MⅡ卵母細胞中。受精后的卵母細胞轉移至卵裂期培養(yǎng)基(COOK，澳大利亞)并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.受精評估與胚胎培養(yǎng)：在采卵后第1天(08：00 am～09：00 am)觀察原核，包括原核數目和原核評級。采卵后第3天對胚胎進行評級后，將胚胎轉移至囊胚培養(yǎng)液(COOK，澳大利亞)中繼續(xù)培養(yǎng)，第5天和第6天觀察囊胚形成情況并采用Gardner囊胚等級評分系統(tǒng)進行囊胚分期和評分。符合新鮮周期胚胎移植標準的患者于第3天或第5天移植1～2枚優(yōu)質胚胎，剩余胚胎采用玻璃化冷凍法進行冷凍。具體方法和流程參考本中心已發(fā)表文獻[4]。

4.妊娠結局評估：移植后給予黃體支持，移植后第10～14天測定血清β-HCG水平，若檢測呈陽性(β-HCG≥10 U/L)，則繼續(xù)給予黃體支持至妊娠第12周。胚胎移植后30～35 d進行超聲檢測確定是否宮內妊娠、孕囊數量以及胎心情況。電話隨訪妊娠結局，包括自然流產、異位妊娠、分娩情況和新生兒狀況。

三、分析指標

短時IVF組和R-ICSI組患者的一般資料(年齡、不孕年限、不孕原因、不孕類型、卵巢儲備功能)；促排卵及受精培養(yǎng)資料(促排卵方案，Gn用量和Gn使用天數，HCG日E2、P和LH水平，胚胎實驗室資料)；胚胎移植結局(臨床妊娠率、流產率、異位妊娠率和活產率等)。

四、統(tǒng)計分析

結 果

一、兩組患者的一般情況

本研究納入了我中心2016年1月至2019年12月共8 107個短時IVF周期的數據，其中有893周期因出現IVF失敗進行了R-ICSI，IVF失敗率為11.02%。

根據短時IVF周期是否進行了R-ICSI分為短時IVF組(n=7 214)和R-ICSI 組(n=893)。兩組患者間年齡、BMI、抗苗勒管激素(AMH)以及月經周期第2天E2、FSH和LH水平均無顯著性差異(P>0.05)；R-ICSI組不孕年限顯著長于短時IVF組(P<0.05)，原發(fā)不孕和不明原因性不孕比例均顯著高于短時IVF組(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般情況比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者促排卵資料比較

兩組患者間促排卵方案、Gn使用天數、Gn用量、HCG日E2水平、HCG日卵泡數(>14 mm)、獲卵數均無顯著性差異(P>0.05)；但R-ICSI組HCG日LH和孕酮(P)水平顯著高于短時IVF組(P<0.05)(表2)。

表2 患者促排卵資料比較[(-±s)，n(%)]

三、兩組患者胚胎實驗室資料比較

兩組患者采卵日精液分析結果、2PN受精率、1PN受精率和0PN卵裂率均無顯著差異(P>0.05)；R-ICSI組多PN(≥3PN)受精率顯著低于短時IVF組(P<0.05)；兩組患者間TFF率、2PN卵裂率、優(yōu)質胚胎率、囊胚形成率、冷凍胚胎數目均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者胚胎實驗室資料比較[(-±s)，%]

四、兩組患者胚胎移植結局比較

短時IVF組共3 824個周期進行了鮮胚移植，其中2 803周期為第3天(D3)卵裂期胚胎移植，1 021周期為D5囊胚移植；R-ICSI組共有488周期進行了鮮胚移植，其中369例為D3胚胎移植，119例為D5囊胚移植。

兩組患者間鮮胚移植率(53.01% vs. 54.64%)和周期取消率(1.70% vs. 2.35%)均無顯著性差異(P>0.05)。兩組患者間D3胚胎移植數目和D5囊胚移植數目均無顯著性差異(P>0.05)；兩組患者間D3胚胎和D5囊胚的臨床妊娠率、流產率、異位妊娠率、活產率、以及胎兒出生體重均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 兩組患者鮮胚移植周期妊娠結局比較[(-±s),%]

續(xù)表

討 論

受精是一個復雜的生理過程，需要精子與成熟卵母細胞之間進行精細的相互作用，包括精子獲能、頂體反應、精子穿透、第二極體排出完成減數分裂、父系和母系原核的形成等[5]。受精障礙的原因主要是少弱精子癥，這類患者可采用ICSI進行助孕[6]。然而有一部分患者，即使精子的各項指標正常，或有過自然妊娠史，或前次IVF受精正常，仍有可能出現IVF失敗。受精失敗是導致IVF周期取消的主要原因之一，給IVF患者造成了巨大的經濟損失和精神壓力，但其影響因素和發(fā)生機制仍不明確，臨床上也難以對有受精失敗風險人群進行預測。

在IVF過程中，根據精子和卵母細胞共培養(yǎng)的時間可分為常規(guī)IVF和短時IVF。關于常規(guī)IVF和短時IVF的選擇仍存在爭議：與精卵結合培養(yǎng)過夜的常規(guī)IVF相比，短時IVF可在受精當天根據第二極體排出的情況，判斷是否需要進行早期R-ICSI，在一定程度上降低了IVF失敗率和周期取消率；另一部分學者則認為短時IVF過早的脫顆粒不利于精卵結合，精卵培養(yǎng)時間過短以及R-ICSI是否會對胚胎發(fā)育造成不利影響仍不明確，而常規(guī)IVF更符合精卵結合的生理過程[7]；但常規(guī)IVF中若出現受精完全失敗或受精率不理想，再進行晚補救ICSI時會導致胚胎發(fā)育潛能降低[8-9]。有研究對IVF患者的姊妹卵母細胞分別進行了短時和常規(guī)IVF操作，結果顯示兩組卵母細胞受精率、異常受精率、胚胎質量、臨床妊娠率和著床率均無顯著差異[10]。無論是短時還是常規(guī)IVF，如何準確地根據IVF患者的臨床或實驗室特點對受精方式進行評估，是生殖醫(yī)師和胚胎學家關注的熱點問題之一。

本研究共納入了8 107個短時IVF周期，其中有893周期因出現受精失敗進行了R-ICSI，受精失敗率為11.02%，與文獻報道受精失敗率一致[11]。我們在本研究中根據短時IVF周期是否進行了R-ICSI分為短時IVF組(7 214周期)和R-ICSI 組(893周期)。結果顯示，兩組患者年齡、卵巢儲備功能、促排卵方案和促排藥物使用，以及男方精液常規(guī)分析結果均無顯著性差異(P>0.05)。盡管R-ICSI組原發(fā)不孕比例顯著高于短時IVF組，但R-ICSI組仍有43.45%患者為繼發(fā)不孕，提示繼發(fā)性不孕仍有可能發(fā)生IVF失??；R-ICSI組患者不孕年限和不明原因性不孕比例也顯著高于短時IVF組，因此長期原發(fā)性不明原因性不孕患者發(fā)生受精失敗的風險明顯增加。有研究者指出這類患者在無ICSI指征的情況下，可考慮行常規(guī)IVF+Half-ICSI以預防受精失敗的風險[12]，然而這種方式一方面會導致患者治療費用增加、胚胎實驗室人力和物力資源的浪費，另一方面也會人為導致ICSI應用比例嚴重升高[13]。本研究中，短時IVF組原發(fā)性不孕以及不明原因性不孕患者絕對數量遠多于R-ICSI組，因此原發(fā)性不孕或不明原因性不孕尚不能作為IVF+Half-ICSI或ICSI的指征。另外，本研究結果顯示R-ICSI組受精率與IVF組無顯著差異，表明短時IVF結合R-ICSI能夠有效避免IVF失敗，避免資源浪費，而不孕原因和不孕類型在短時受精評估有爭議時可提供一定參考價值。

研究證據表明，HCG日孕酮(P)值升高可導致子宮內膜容受性與胚胎發(fā)育不同步而對妊娠結局不利[14-15]，但P值對卵母細胞受精的影響仍不清楚。我們的結果顯示R-ICSI組患者HCG日LH和P水平均顯著高于短時IVF組。研究報道，LH和P水平增加可能會導致卵母細胞的卵丘和顆粒細胞過早黃素化，透明帶變硬，而卵丘細胞也通過自分泌和旁分泌機制影響精卵結合和雄原核的形成[16-17]。Huang等[18]的研究也發(fā)現HCG日P值與IVF周期的受精失敗發(fā)生率呈正相關，提示P值升高可能會導致卵母細胞的卵丘細胞或透明帶功能異常，導致受精失敗。有研究指出顆粒細胞分泌的E2隨著體外培養(yǎng)時間的延長而增加，導致胚胎透明帶硬化，影響囊胚的孵出，從而對胚胎發(fā)育產生不利影響，但E2水平是否會影響卵母細胞透明帶仍不明確[19-20]。我們的結果顯示兩組患者HCG日E2水平無顯著差異，提示血清E2對卵母細胞受精失敗的預測無明顯意義。

雙原核(2PN)的出現是卵母細胞正常受精的金標準，短時IVF中第二極體(2pb)的排出則是判斷是否受精的最早標準。然而，在胚胎實驗室實際工作中，部分患者可能表現為碎極體，或存在第2極體延遲排出的情況，導致受精評估存在偏倚，這種情況下實施R-ICSI有可能增加多精受精率[10，21]。我們的結果顯示，R-ICSI組中多PN率顯著低于短時IVF組，并未增加多精受精的風險，因此短時IVF后根據2pb對是否受精進行預測是安全有效的。R-ICSI組仍有1.57%患者出現了完全受精失敗，這一部分患者則可能是由于卵母細胞激活失敗或精卵功能異常導致[22-24]。

隨著人類輔助生殖技術的廣泛應用，其安全性問題也受到了越來越多生殖學者的關注。IVF過程中，精子濃度過高可能會導致多精受精而形成多倍體，降低了卵母細胞利用率。文獻報道IVF中多精受精率在5%～10%；ICSI通過單精子注射方式，大大降低了多精受精率，但ICSI是一種侵入性操作，可能會損傷卵母細胞骨架和紡錘體，增加了非整倍體率。短時IVF結合R-ICSI在精卵共培養(yǎng)的基礎上又增加了ICSI的侵入性操作，因此對胚胎發(fā)育以及妊娠結局的影響一直存在爭議[13]，尤其是歐美等國家并不采用R-ICSI技術，而是以ICSI為主導來降低受精失敗風險和增加卵母細胞利用率[13]。本研究中關于胚胎實驗室數據和妊娠結局的分析結果顯示，兩組患者的受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、囊胚形成率、可利用胚胎數、周期取消率、鮮胚移植妊娠率、流產率和活產率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，提示短時IVF結合R-ICSI并不會對胚胎發(fā)育和妊娠結局造成不利影響，也不會導致流產率增加。

綜上，本研究比較了短時IVF和因短時IVF失敗行早期R-ICSI患者的臨床及胚胎實驗室的周期特點，以及兩組患者鮮胚移植的妊娠結局。結果顯示，不孕年限長、原發(fā)不孕以及不明原因性不孕、HCG日LH和P值升高可導致IVF失敗的風險增加。短時IVF組和R-ICSI組的胚胎實驗室結局、臨床妊娠率、流產率、活產率和胎兒出生體重均無顯著差異，說明早期R-ICSI可有效改善短時IVF失敗患者的結局。