張嘯龍，張杰平，王金玉，于嵐，馮科，曲曉偉，夏彥清，郭海彬，萬鋒，張翠蓮*

(1.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院，鄭州 450003；2.河南大學(xué)人民醫(yī)院，鄭州 450003；3河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450003)

青春期前男性腫瘤患者，因睪丸內(nèi)尚無成熟精子，性腺毒性治療可能會導(dǎo)致生育能力永久性喪失，睪丸組織或細(xì)胞低溫凍存是保存其生育力重要的手段[1]。然而，在全身性腫瘤患者中，睪丸組織冷凍及復(fù)蘇后自體移植意味著患者可能再次引入癌細(xì)胞的高風(fēng)險[2]?？紤]到睪丸細(xì)胞懸浮液可以進(jìn)行分選清除癌細(xì)胞，而精原干細(xì)胞(SSC)可以在體外培養(yǎng)用于精原干細(xì)胞移植[3-4]或誘導(dǎo)分化成圓形精子細(xì)胞，通過圓形精子細(xì)胞注射(ROSI)獲得子代。因此，對于青春期前男性腫瘤患者，睪丸生精細(xì)胞凍存是其保存生育力重要的途徑之一。非梗阻性無精子癥(NOA)是男性不育的一種重要類型[5]，特別是睪丸內(nèi)無精子給NOA治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，部分NOA患者睪丸存在SSC和圓形精子細(xì)胞，SSC可以通過體外誘導(dǎo)分化形成單倍體圓形精子細(xì)胞，而圓形精子細(xì)胞可以通過ROSI而獲得遺傳學(xué)的子代[6-7]，因此SSC和圓形精子細(xì)胞作為生命的種子對于NOA患者的治療具有重要的臨床價值和意義。NOA患者的睪丸生精細(xì)胞保存是其生育力保存的重要的途徑，并具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

目前，國內(nèi)外尚無完善的睪丸生精細(xì)胞的保存體系，對NOA和青春期前男性睪丸細(xì)胞凍存的研究報道更少。由于人類睪丸組織稀少且不易獲取，而小鼠作為研究哺乳動物胚胎發(fā)育以及人類遺傳疾病的典型模式動物，在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本文選擇兩周齡小鼠來模擬人在青春期前未性成熟的睪丸發(fā)育狀態(tài)，采用不同的凍存方案對小鼠睪丸生精細(xì)胞進(jìn)行低溫冷凍，并檢測凍存后生精細(xì)胞細(xì)胞活率、復(fù)蘇率、細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位水平的變化，探索睪丸生精細(xì)胞最佳凍存方案。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物：C57BL/6J雄性2周齡小鼠200只，購于河南省實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證[SCXK(豫) 2017-0001]。

2.主要試劑和儀器：Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma試劑公司，線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自上海碧云天生物技術(shù)公司；Ⅳ膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰酶、二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma試劑公司；蔗糖、D-海藻糖(細(xì)胞培養(yǎng)級)及DMEM/F12培養(yǎng)基購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。流式細(xì)胞儀(BD Canto plus，美國)、梯度降溫盒(Thermo Fisher，美國)。

二、實驗方法

1.實驗分組：根據(jù)凍存液組分不同分為5組。A組：DMEM/F12培養(yǎng)基中含10% DMSO、及10% FBS；B組：DMEM/F12培養(yǎng)基中含10% DMSO、10% FBS及0.1 mol/L蔗糖；C組：DMEM/F12培養(yǎng)基含10% DMSO、10% FBS及0.1 mol/L海藻糖；D組：DMEM/F12培養(yǎng)基中含15% DMSO、10% FBS及0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖；E組：DMEM/F12培養(yǎng)基中含10% DMSO、10% FBS及0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖。以新鮮睪丸組織解離后的睪丸生精細(xì)胞為對照組。

2.睪丸生精細(xì)胞懸液制備：采用兩步酶解法制備小鼠睪丸生精細(xì)胞懸液[8]，步驟簡述如下：將2周齡雄性C57BL/6J小鼠脫頸處死，取出雙側(cè)睪丸，清洗后剝除白膜，取20 mg睪丸組織，用眼科剪剪碎睪丸組織<1 mm，轉(zhuǎn)移至15 ml無菌離心管，410g室溫離心10 min，棄上清液，留取下層組織沉淀；添加酶Ⅰ4 ml，水浴鍋中37℃孵育15 min，孵育過程中持續(xù)振蕩酶解組織懸液；410g室溫離心30 s，棄上清液，留取下層組織沉淀；加酶Ⅱ4 ml，水浴鍋中37℃孵育15 min，孵育過程中持續(xù)振蕩酶解組織懸液；添加10% FBS 4 ml終止消化，410g室溫離心10 min，棄上清液，DMEM/F12培養(yǎng)基4 ml重懸，410g室溫離心10 min，0.45 μm細(xì)胞濾器過濾細(xì)胞懸液去除組織碎片；分裝于5個1.5 ml離心管中，410g室溫離心10 min，棄上清液。分別加入A、B、C、D、E組凍存保護(hù)劑1 ml，轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的5個1.8 ml凍存管(每管接收相當(dāng)于4 mg睪丸組織所制備的細(xì)胞)。

3.睪丸生精細(xì)胞懸液的的冷凍和復(fù)蘇：程序化冷凍：將上述各組凍存管置于梯度降溫盒中，按照說明書操作，-80℃冰箱中12 h，轉(zhuǎn)移至液氮中凍存。復(fù)蘇[9]：2個月后從液氮中取出，迅速置于37℃水浴鍋中2～3 min，待完全融化后，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，并添加 DMEM/F12培養(yǎng)基3 ml，室溫410g離心5 min，洗滌2次，棄上清液，無菌PBS 1 ml重懸，用于后續(xù)實驗。對照組的睪丸生精細(xì)胞懸液不作冷凍處理，直接進(jìn)行后續(xù)實驗。

4.細(xì)胞活率檢測：臺盼藍(lán)拒染法進(jìn)行細(xì)胞活率檢測，將細(xì)胞懸液與0.4%臺盼藍(lán)溶液以9：1混合混勻，室溫孵育5 min。染色后，立刻在倒置顯微鏡200倍下隨機(jī)取數(shù)個視野觀察細(xì)胞并計數(shù)，每個樣本統(tǒng)計細(xì)胞總數(shù)不少于1 000個?；罴?xì)胞形態(tài)圓而透亮，臺盼藍(lán)染料拒染；死細(xì)胞被臺盼藍(lán)染料成藍(lán)色?；罴?xì)胞率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

5.生精細(xì)胞凋亡檢測：采用Annexin V-FITC/PI試劑盒及流式細(xì)胞儀檢測睪丸生精細(xì)胞凋亡。步驟簡述如下：懸浮細(xì)胞1 000g離心5 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞(1～5×105)，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μl Anexin V-FITC混勻，加入10 μl碘化丙啶染色液(PI)輕輕混勻后室溫避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中。使用鋁箔進(jìn)行避光。孵育過程中重懸細(xì)胞2～3次。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，Anexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。并以新鮮消化的睪丸生精細(xì)胞作為對照組進(jìn)行對比分析。

6.線粒體膜電位檢測：采用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)及流式細(xì)胞儀檢測睪丸生精細(xì)胞線粒體膜電位。取1～6×105個細(xì)胞，重懸于0.5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入0.5 ml JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。在孵育期間，按照每1 ml JC-1染色緩沖液(5×)加入4 ml蒸餾水的比例，配制JC-1染色緩沖液(1×)，并放置于冰浴。37℃孵育結(jié)束后，600g4℃離心3～4 min，沉淀細(xì)胞，棄上清。用JC-1染色緩沖液1 ml洗滌2次，再用1 ml JC-1染色緩沖液重懸后，用流式細(xì)胞儀測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長488 nm(綠色)，發(fā)射波長 530 nm(紅色)，熒光強(qiáng)度的變化與對照組比較。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組生精細(xì)胞凍存前后細(xì)胞活率及復(fù)蘇率

與凍存前比較，5組(A～E)細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞活率均顯著下降(P<0.05)；5組間凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞活率及復(fù)蘇率比較中，A組細(xì)胞活率及復(fù)蘇率顯著低于其余4組，E組的細(xì)胞活率及復(fù)蘇率顯著高于其余4組(P<0.05)，B、C及D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 冷凍前后各組睪丸生精細(xì)胞細(xì)胞活率及復(fù)蘇率(-±s)

二、各組睪丸生精細(xì)胞凍存后細(xì)胞恢復(fù)情況

以每4 mg睪丸組織解離凍存后實際回收的活細(xì)胞數(shù)，對睪丸細(xì)胞凍存復(fù)蘇后進(jìn)行定量計算。統(tǒng)計結(jié)果顯示，E組睪丸生精細(xì)胞的恢復(fù)數(shù)量[(17.83±0.84)×104]最高，顯著高于其余4組(P<0.05)；A組的恢復(fù)數(shù)量[(10.82±0.43)×104]最低，顯著低于其余4組(P<0.05)；B、C、D組間沒有顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

與其余4組比較，*P<0.05、#P<0.05。

三、各組間睪丸生精細(xì)胞凋亡水平的比較

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。統(tǒng)計結(jié)果顯示，和對照組相比，凍存復(fù)蘇后5組細(xì)胞凋亡率均顯著增加[(57.08±2.40)% vs.(18.77±0.95)%、(47.42±1.74)% vs.(18.77±0.95)%、(54.06±2.13)% vs.(18.77±0.95)%、(45.19±2.29)% vs.(18.77±0.95)%、(29.62±1.95)% vs.(18.77±0.95)%](P<0.05)；5組凍存細(xì)胞間的細(xì)胞凋亡率比較，A組細(xì)胞凋亡顯著高于其余4組(P<0.05)，E組細(xì)胞凋亡率顯著低于其余4組(P<0.05)，而B、C、D組間的細(xì)胞凋亡率無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。

與其余各組比較，*P<0.05；與B、C、D、E組比較，#P<0.05；與A、B、C、D組比較，&P<0.05。

四、各組睪丸生精細(xì)胞線粒體膜電位的比較

膜電位下降程度用R1/R2表示，R1與R2的比值越高說明線粒體膜電位越高。統(tǒng)計結(jié)果顯示，和對照組相比，凍存復(fù)蘇后5組細(xì)胞線粒體膜電位均顯著下降[(1.13±0.12) vs.(4.73±0.25)、(1.62±0.18)vs.(4.73±0.25)、(1.53±0.14) vs.(4.73±0.25)、(1.27±0.15)vs.(4.73±0.25)、(3.58±0.23) vs.(4.73±0.25)](P<0.05)；5組凍存細(xì)胞間的線粒體膜電位下降程度比較，E組下降程度最低，顯著低于其余4組(P<0.05)，而A、B、C和D組間的下降程度無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

與其余各組比較，*P<0.05，#P<0.05。

討 論

無精子癥在男性不育人群中的發(fā)生率為10%～15%[10]，盡管近年來輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展，但是針對NOA特別是睪丸內(nèi)無精子患者來說，輔助生殖技術(shù)卻無計可施，然而幸運(yùn)的是部分NOA患者睪丸存在精原干細(xì)胞。此外，對于即將接受性腺毒性治療的青春期前男性腫瘤患者，雖然睪丸內(nèi)尚無成熟精子，但卻有精原干細(xì)胞。針對NOA睪丸內(nèi)無精子患者和青春期前男性腫瘤患者，睪丸組織或細(xì)胞低溫凍存是唯一一種保存其生育力的方法[1]。睪丸組織或細(xì)胞低溫凍存后復(fù)蘇，然后進(jìn)行睪丸組織或細(xì)胞移植是一種生育力保存和恢復(fù)的方案，已在多種物種進(jìn)行實驗[11-17]。例如，F(xiàn)ayomi 等[18]將低溫保存的青春期前恒河猴睪丸組織自體移植到其背部皮膚或陰囊內(nèi)成功產(chǎn)生功能性精子并能生育后代；在人類中，對非霍奇金淋巴瘤患者的睪丸細(xì)胞進(jìn)行低溫冷凍，待患者康復(fù)后將冷凍的睪丸細(xì)胞復(fù)蘇并移植到他們的睪丸中[19-20]。然而，目前尚無針對睪丸組織或細(xì)胞懸液冷凍保存的最佳方案[21]。此外，對于青春前期全身性腫瘤患者，其睪丸組織可能存在癌細(xì)胞污染，需將睪丸組織解離成細(xì)胞懸液后進(jìn)行分選，清除癌細(xì)胞后進(jìn)行睪丸生精細(xì)胞冷凍，最后復(fù)蘇后進(jìn)行移植。因此，對于NOA睪丸內(nèi)無精子患者和青春期前男性腫瘤患者，睪丸生精細(xì)胞凍存是其保存和恢復(fù)生育力重要的方法。

低溫凍存保護(hù)劑在睪丸生精細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過程中起著重要的作用。冷凍保護(hù)劑可分為滲透性保護(hù)劑和非滲透性保護(hù)劑，其中常用的滲透性保護(hù)劑是DMSO，因其分子量小，細(xì)胞膜穿透性強(qiáng)，在細(xì)胞凍存和復(fù)溫過程中能降低細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而對睪丸組織及細(xì)胞懸液能起到較好的保護(hù)作用，是目前睪丸組織冷凍最常用的冷凍保護(hù)劑。非滲透性保護(hù)劑中最常用的是蔗糖、海藻糖，可在脫水和復(fù)水化過程中，通過形成粘性外殼穩(wěn)定細(xì)胞膜來保護(hù)細(xì)胞。Jahnukainen等[22]用10%蔗糖、5%和10%的DMSO冷凍保護(hù)劑冷凍保存恒河猴睪丸組織，復(fù)蘇后將睪丸組織移植到裸鼠背部皮下，結(jié)果能夠啟動精子發(fā)生過程。Lee等[23]用添加胎牛血清的DMSO和海藻糖的冷凍保護(hù)劑冷凍保存小鼠睪丸細(xì)胞懸液，復(fù)蘇后和無海藻糖的冷凍保護(hù)劑組相比，小鼠SSCs的細(xì)胞活力顯著提高，并保持了SSCs的細(xì)胞功能。雖然國內(nèi)外研究者嘗試用的多種冷凍保護(hù)劑保存睪丸生精細(xì)胞，但其冷凍復(fù)蘇效果尚不十分理想，且冷凍復(fù)蘇效果檢測指標(biāo)單一(細(xì)胞活率)。本研究采用含有不同成分(DMSO、FBS、蔗糖、海藻糖)和濃度的冷凍保護(hù)劑對未性成熟小鼠睪丸生精細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，然后檢測冷凍復(fù)蘇后細(xì)胞活率、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞線粒體膜電位，力求尋找更佳的冷凍方案。

本研究結(jié)果顯示，與新鮮對照組比較，凍存復(fù)蘇后各組細(xì)胞活率均顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著升高且細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低；其中添加0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖的凍存組的細(xì)胞活率和復(fù)蘇率均最高、細(xì)胞凋亡率最低、細(xì)胞線粒體膜電位程度最低；未添加0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖的組別的細(xì)胞活率和復(fù)蘇率均是最低，其細(xì)胞凋亡率最高。提示在細(xì)胞冷凍處理中，冷凍保護(hù)劑中添加0.1 mol/L蔗糖或0.1 mol/L海藻糖對細(xì)胞低溫冷凍均具有一定的保護(hù)作用，而同時添加0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖可顯著提高睪丸生精細(xì)胞冷凍復(fù)蘇后細(xì)胞活率和復(fù)蘇率，降低細(xì)胞凋亡率，并降低低溫凍存對細(xì)胞線粒體膜電位損傷的影響，但15%DMSO對細(xì)胞的毒性卻抵消0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖的部分冷凍保護(hù)作用。結(jié)果表明，10%DMSO、10%FBS、0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖組合冷凍劑對細(xì)胞膜及線粒體膜具有膜穩(wěn)定的保護(hù)作用，是凍存未性成熟小鼠睪丸生精細(xì)胞較適宜的冷凍保護(hù)劑方案。

本研究尚存在一些不足，首先，濃度分組數(shù)量有限，而且限定了冷凍保護(hù)載體(凍存管)和冷凍方法(程序性降溫)進(jìn)行比較不同的冷凍保護(hù)劑對睪丸生精細(xì)胞冷凍保護(hù)效果；此外，冷凍保護(hù)劑對睪丸生精細(xì)胞冷凍保護(hù)效果的檢測指標(biāo)仍不全面，未對睪丸生精細(xì)胞功能進(jìn)行檢測。因此，在未來研究中，需要增加濃度分組數(shù)量，增加睪丸生精細(xì)胞檢測指標(biāo)，如細(xì)胞甲基化、細(xì)胞膜及細(xì)胞器形態(tài)的變化，并同時比較不同的冷凍載體和降溫程序，并對冷凍復(fù)蘇后細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)以明確冷凍保護(hù)劑對睪丸生精細(xì)胞功能的影響，以探索更適合未性成熟睪丸組織生精細(xì)胞的冷凍保護(hù)劑，為臨床應(yīng)用提供實驗證據(jù)和理論支持。