張萌萌，高 敏，張相敏，王雪峰*，王曉鈞*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

馬傳染性貧血病毒（Equine infectious anemia virus，EIAV）是逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬的成員之一，主要感染馬屬動(dòng)物。EIAV 引起馬屬動(dòng)物出現(xiàn)反復(fù)發(fā)熱、消瘦、貧血和進(jìn)行性衰弱為特征的傳染性疾病稱為馬傳染性貧血病（Equine infectious anemia，EIA）。EIAV 是基因組結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的慢病毒，基因組全長(zhǎng)約8.2 kb，可以編碼3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（Gag、Pol和Env）和3 個(gè)附屬蛋白（tat、Rev 和S2）。病毒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子（Regulator of expression of viral proteins，Rev）是所有慢病毒屬成員均具有的附屬蛋白，其主要功能是介導(dǎo)未經(jīng)剪切的病毒基因組RNA 和不完全剪切的病毒mRNA 從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)和病毒粒子生成[1]。通常將Rev介導(dǎo)病毒mRNA 核質(zhì)運(yùn)輸?shù)纳飳W(xué)功能簡(jiǎn)稱為核輸出活性（Nuclear-export activity）。

EIAV Rev 蛋白包括3 個(gè)主要的功能域：分別為核輸出信號(hào)（Nuelear export signal，NES）、核定位信號(hào)（Nuelear loaclization signal，NLS）以及RNA 結(jié)合區(qū)域（RNA-binding domain，RBD）[2]。Rev 通過RBD 與病毒mRNA的特定序列（Rev responsive element，RRE）結(jié)合，將病毒Gag-Pol或Env的mRNA運(yùn)輸至胞漿，實(shí)現(xiàn)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)[3]。EIAV 的RRE 長(zhǎng)約555 nt，具有特定莖環(huán)結(jié)構(gòu)，位于env基因的N 端，與Rev 編碼基因的第一外顯子重疊[4]。研究表明，EIAVrev基因具有高變異性，而且rev的變異與疾病轉(zhuǎn)歸相關(guān)[5]。為建立EIAV Rev 的核輸出活性檢測(cè)方法，本研究利用Gag-Pol 的表達(dá)依賴于Rev 與RRE 結(jié)合促進(jìn)其mRNA 核輸出的原理，克隆了EIAV 的Gag-pol 編碼區(qū)序列以及RRE，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pGagpol-RRE。由于pGagpol-RRE 單獨(dú)轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞不表達(dá)，僅在Rev 的作用下才能在HEK293T 細(xì)胞中表達(dá)。所以，將pGagpol-RRE 與Rev 表達(dá)載體（pcDNARevFDDV-HA）共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，利用western blot 在細(xì)胞裂解液中可檢測(cè)到Gag 的表達(dá)，通過檢測(cè)Gag 的表達(dá)來評(píng)估Rev 的核輸出活性。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞pLGFD3-8、pcDNA-HA、pcDNA-RevFDDV-HA、pEGFP-N1 質(zhì)粒、HEK293T 細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；pcDNA-RevL36A-HA 是在pcDNARevFDDV-HA 的基礎(chǔ)上獲得的L36A 突變質(zhì)粒；pcDNARevUK-HA、pcDNA-RevNewmarket-HA、pcDNA-RevCornwall-HA、pcDNA-RevF2-HA、pcDNA-RevSA-HA、pcDNA-RevDEHA、pcDNA-RevMiyazaki-HA、pcDNA-RevDevon-HA、pcDNA-RevPA-HA 等不同Rev 表達(dá)質(zhì)粒均由蘇州金唯智生物科技有限公司按照GenBank 中各EIAV 病毒株的rev基因序列（不同Rev 基因的Genbank 登錄號(hào)分別是：UK，AF016316.1；Newmarket，MH580896.1；Cornwall，MH580898.1；F2，JX48063-1.1；SA，KM24 7555.2；DE，KM247554.1； Miyazaki，JX003263.1；Devon，MH580897.1；PA，GQ855756.1）合成后克隆于pcDNA-HA 載體。E. coilDH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2 主要試劑PolyJet DNA In Vitro Transfection Reagent購(gòu)自SignaGen Laboratories公司；KOD高保真DNA聚合酶購(gòu)自TOYOBO 公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；新生牛血清（FBS）購(gòu)自Wisent公司；EIAV p26單克隆抗體（MAb）由本實(shí)驗(yàn)室保存；鼠HA MAb 購(gòu)自Sigma 公司；DyLightTM800 標(biāo)記的IgG 羊抗鼠購(gòu)自KPL公司；蛋白Marker 購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)EIAV 驢胎皮膚細(xì)胞弱毒疫苗（EIAVFDDV）基因組序列（GU385361.1）設(shè)計(jì)特異性引物（Nhe-Gagpol-F：5'-CTAGCTAGCATTTG GTCGCTCAGATTCTGCGG-3'/xho-Gagpol-R：5'-GGCTC GAGCATACACCAAACCTTATAACAGA-3'；xho-RREF：5'-AAACTCGAGATGGGATTATTTGGTAAAGGGGT-3'/Not-RRE-R：5'-AAAGCGGCCGCGTTACATTTATAT TTTTGACAGT-3'），以EIAV 感染性克隆pLGFD3-8為模板[6]，利用PCR 方法分別擴(kuò)增基因組204 bp～5 295 bp（包含Gag-Pol 編碼區(qū)及其兩側(cè)序列）和5 296 bp～5 867 bp（包含RRE 及其兩側(cè)序列）的核苷酸序列，擴(kuò)增的Gag-Pol 編碼區(qū)及其兩側(cè)序列的片段預(yù)期為5 091 bp；擴(kuò)增RRE 及其兩側(cè)序列的片段預(yù)期為571 bp，Gag-Pol片段經(jīng)NheI和XhoI雙酶切后克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-N1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGagpol。將RRE 片段和pGagpol 分別經(jīng)XhoI 和NotI 雙酶切后連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGagpol-RRE。經(jīng)酶切鑒定，陽性克隆由擎科（中國(guó)哈爾濱）公司測(cè)序鑒定。

1.4 Rev 介導(dǎo)Gag-Pol 表達(dá)的檢測(cè)及其相關(guān)性分析37 ℃、 5%CO2條件下于細(xì)胞培養(yǎng)板中將HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%左右時(shí)，采用PolyJet DNAIn VitroTransfection Reagent 將pGagpol-RRE（1 μg）分別與pcDNA-HA（1 μg）或pcDNA-RevFDDV-HA（1 μg）共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h～8 h 后棄掉培養(yǎng)液更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至感染后36 h 時(shí)裂解細(xì)胞，分別采用抗EIAV p26 MAb（9H8）（1∶2 000）、鼠抗HA MAb（1∶2 000）或鼠抗β-actin MAb（1∶2 000）為一抗，DyLightTM800 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶10 000）為二抗，通過western blot 檢測(cè)Gag 的表達(dá)情況，分析其與Rev 的相關(guān)性。

按照上述轉(zhuǎn)染方法將1 μg pGagpol-RRE 質(zhì)粒分別與不同劑量（0.05 μg、0.1 μg、0.2 μg）的pcDNARevFDDV-HA 質(zhì)粒和不同劑量（0.15 μg、0.1 μg、0）的pcDNA-HA 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的總劑量為1.2 μg，轉(zhuǎn)染36 h后通過western blot檢測(cè)Gag表達(dá)量的變化，并利用Image J進(jìn)行灰度分析不同劑量的Rev對(duì)Gag-Pol表達(dá)的相關(guān)性。

此外，將pGagpol-RRE（1 μg）分別與pcDNA-HA（1 μg）、pcDNA-RevFDDV-HA（1 μg）和pcDNA-RevL36A-HA（1 μg）共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，通過western blot檢測(cè)Gag的表達(dá)情況，分析Rev介導(dǎo)Gag-Pol表達(dá)的特異性。

1.5 不同EIAV 毒株Rev 的序列特征及其核輸出活性的檢測(cè) 利用DNAStar 軟件中的MegAlign 工具和GeneDoc 軟件對(duì)不同毒株的EIAV Rev 序列間進(jìn)行比對(duì)，分析各毒株間Rev 基因同源性。參照1.4 中轉(zhuǎn)染方法將pGagpol-RRE（1 μg）分別與不同EIAV 毒株Rev表達(dá)載體（1 μg）（pcDNA-RevFDDV-HA、pcDNA-RevUKHA、pcDNA-RevNew-HA、pcDNA-RevCornwall-HA、pcDNA-RevF2-HA、pcDNA-RevSA-HA、pcDNA-RevDE-HA、pcDNA-RevMiyazaki-HA、pcDNA-RevDevon-HA、pcDNARevPA-HA）共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，通過western blot檢測(cè)Gag 的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)建立的檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)不同EIAV 毒株Rev 的核輸出活性的可行性。

2 結(jié)果與討論

2.1 EIAV Gag-Pol 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果構(gòu)建的pGagpol-RRE 真核表達(dá)載體經(jīng)XhoI 和NotI 雙酶切鑒定，結(jié)果顯示得到的片段約10 000 bp 和570 bp，與預(yù)期相符（圖1）；進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果顯示目的基因與pLGFD3-8 相應(yīng)基因序列完全一致，且讀碼框正確。表明重組質(zhì)粒pGagpol-RRE正確構(gòu)建。

圖1 重組質(zhì)粒pGagpol-RRE的酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Digestion analysis of of identification of recombinant plasmid pGagpol-RRE digestion

2.2 Rev 介導(dǎo)Gag-Pol 表達(dá)的檢測(cè)慢病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白Gag-pol 的表達(dá)依賴于Rev 的核輸出活性[7]。EIAV Gag 前體蛋白p55 在病毒pol基因編碼的蛋白酶作用下被切割成p15、p26、p11 和p9[8]。將重組質(zhì)粒pGagpol 和pGagpol-RRE 分別與Rev 表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-RevFDDV-HA 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞。36 h 后進(jìn)行western blot 檢測(cè)，結(jié)果顯示，pGagpol無論有無Rev均不表達(dá)，pGagpol-RRE 僅在Rev 存在的條件下表達(dá)（圖2A），而且隨著Rev 劑量的增加（0.05 μg、0.1 μg、0.2 μg），Gag55的表達(dá)量逐漸增加（圖2B），表明Rev通過RRE 介導(dǎo)Gag-Pol 的表達(dá)。有研究顯示，Rev L36A的突變會(huì)破壞其核輸出活性[9]。為了驗(yàn)證pGagpol-RRE的表達(dá)特異性地依賴于Rev的核輸出活性，在pcDNARevFDDV-HA 的基礎(chǔ)上，本研究團(tuán)隊(duì)前期通過PCR 方法將36 位的L 突變成A，構(gòu)建Rev 表達(dá)載體pcDNARevL36A-HA。將pGagpol-RRE 分別與pcDNA-RevFDDVHA或pcDNA-RevL36A-HA共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，western blot 檢測(cè)顯示，Rev L36A 不能介導(dǎo)Gag-Pol 的表達(dá)（圖2C），表明Rev介導(dǎo)pGagpol-RRE 的表達(dá)依賴于其核輸出活性，進(jìn)一步證明pGagpol-RRE 可用于評(píng)價(jià)Rev 核輸出活性的研究，為研究Rev 的生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。

圖2 Rev介導(dǎo)Gag-Pol表達(dá)的western blot鑒定結(jié)果Fig.2 Western blot analyisis for that the expression of Gag-Pol mediated by Rev

2.3 不同EIAV 病毒株Rev 核輸出活性的檢測(cè)結(jié)果對(duì)不同EIAV 病毒的Rev 氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，盡管各毒株之間氨基酸序列差異較大，但是對(duì)Rev核輸出活性有重要影響的關(guān)鍵位點(diǎn)高度保守（aa36、aa45、aa49、aa76、aa77、aa95、aa109）[10]（圖3A）。將不同病毒的Rev 表達(dá)質(zhì)粒與pGagpol-RRE 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，結(jié)果顯示：除對(duì)照組pGagpol-RRE與pcDNA-HA 共轉(zhuǎn)染檢測(cè)不到Gag55的表達(dá)，其余各病毒株的Rev 均能有效地介導(dǎo)Gag55的表達(dá)（圖3B）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示不同毒株Rev 氨基酸序列的保守區(qū)可能對(duì)其核輸出活性是至關(guān)重要的，同時(shí)也表明pGagpol-RRE 可用于評(píng)價(jià)EIAV 不同毒株的Rev 核輸出活性，為深入研究Rev 基因變異對(duì)其生物學(xué)功能的影響提供了重要的方法。

圖3 EIAV不同病毒株Rev的核輸出活性比較Fig.3 Comparison analysis of nuclear export activities of Rev from different EIAV strains

研究表明，EIAV Rev 是病毒復(fù)制必須的附屬蛋白，其不僅介導(dǎo)未完全剪切的病毒mRNA 的核輸出活性，還可以增強(qiáng)病毒mRNA 的穩(wěn)定性、促進(jìn)mRNA 的集聚、調(diào)節(jié)mRNA 的選擇性剪切[11]。最近的研究顯示，EIAV 的Rev 還可以拮抗宿主限制因子SAMHD1 促進(jìn)病毒復(fù)制[9]。在EIAV 和HIV-1 感染過程中，rev基因的變異與疾病發(fā)展密切相關(guān)[12-15]。其中一個(gè)重要的原因是Rev 的變異通過減弱其核輸出活性，減少Gag 的表達(dá)水平，即Rev 可以改變病毒的復(fù)制并影響感染者的疾病臨床轉(zhuǎn)歸。本研究利用Rev 與RRE 的結(jié)合介導(dǎo)Gag-Pol 表達(dá)的原理，構(gòu)建了pGagpol-RRE 真核表達(dá)載體，將其與Rev 表達(dá)載體共轉(zhuǎn)293T 細(xì)胞，通過western blot 比較Gag 表達(dá)量的變化可分析Rev 的核輸出活性。該系統(tǒng)可用來評(píng)價(jià)EIAV 同源和異源毒株Rev 的核輸出活性，為進(jìn)一步研究EIAV 致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。