張睿，邸松蕊，余淑惠，劉金蓮，湯如瑩，葛東宇，董瑞娟，張建軍

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

諾麗(Noni)原產(chǎn)于波利尼西亞群島，為茜草科海濱木巴戟(MorindacitrifoliaL.)的果實(shí)，廣泛分布于太平洋南部諸島和中南半島地區(qū)，當(dāng)?shù)厝藨?yīng)用其強(qiáng)身健體治療各種疾病[1]，現(xiàn)代研究表明其具有強(qiáng)大的抗氧化能力[2]。目前諾麗已合法引入中國(guó)使用，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)已出現(xiàn)諾麗與人參配伍，諾麗與黃精配伍，諾麗與山茱萸、女貞子配伍等產(chǎn)品。在專利網(wǎng)站進(jìn)行檢索，截至2021年5月共有407條諾麗相關(guān)專利，其中不乏與中藥配伍之品。有學(xué)者對(duì)南美草藥阿薩伊等一系列外來(lái)藥物進(jìn)行了中藥藥性探討[3]，并明確了新外來(lái)中藥的概念[4]，提出了外來(lái)藥物“中藥化”的研究策略[5]。為使諾麗在我國(guó)更好地推廣應(yīng)用，也為使其與中藥合理配伍，依據(jù)新外來(lái)中藥現(xiàn)代研究范式[6]，劉金蓮等[7]對(duì)諾麗文獻(xiàn)進(jìn)行全面整理并首次進(jìn)行系統(tǒng)的中醫(yī)藥理論分析，提出了諾麗的藥性為酸、甘、平,歸肝、腎、脾經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋健骨、益氣養(yǎng)陰之效。有研究表明諾麗可改善記憶[8]，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在通過(guò)觀察諾麗對(duì)氫化可的松致腎陽(yáng)虛模型記憶損傷小鼠行為學(xué)、病理、神經(jīng)遞質(zhì)和cAMP/PKA通路蛋白的影響，揭示諾麗補(bǔ)腎改善記憶的作用機(jī)制，為諾麗歸腎經(jīng)及補(bǔ)腎功效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF雄性昆明小鼠60只，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，小鼠自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)符合相關(guān)倫理學(xué)要求。

1.2 藥物

諾麗干粉(美國(guó)大溪地諾麗公司，批號(hào)：US20180321)，人參配方顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：18006312)，氫化可的松注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1801181)。

1.3 試劑

環(huán)磷酸腺苷(cAMP)試劑盒、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、磷酸激酶A(PKA)ELISA試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所，批號(hào)：20190812，20190815，20190823)；乙酰膽堿(ACh)、5羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上素(NA)ELISA試劑盒(江蘇科特生物科技有限公司，批號(hào)：MB3256B，MB3179B，MB3092B，MB3269B)。

1.4 主要儀器

Epoch2C型酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek)，SleeMPS/P2型包埋機(jī)(德國(guó)SLEE)，RM2245型切片機(jī)(德國(guó)Leica)，全自動(dòng)切片掃描儀Axio Scan.Z1(德國(guó)ZEISS)。

1.5 方法

1.5.1 分組與給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為6組，每組10只，即對(duì)照組,模型組,人參組(1.00 g/kg，相當(dāng)于成人劑量6 g/d),諾麗高、中、低劑量組(1.33、0.67、0.33 g/kg，分別相當(dāng)于成人劑量8、4、2 g/d)。從實(shí)驗(yàn)開始第1天，每天除對(duì)照組、模型組灌胃雙蒸水外，其余各組每天下午灌胃相應(yīng)藥物，連續(xù)14 d，灌胃容量為0.01 mL/g。

1.5.2 造模

除對(duì)照組外，其余5組每天上午灌胃氫化可的松(25 mg/kg)造成記憶損害模型，對(duì)照組灌胃生理鹽水，連續(xù)14 d[9-10]。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

測(cè)量實(shí)驗(yàn)第7天、第14天體質(zhì)量及大腦指數(shù)(Brain Index，BI=大腦質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%)；第10天和第14天行為學(xué)檢測(cè)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)的潛伏期，3 min的錯(cuò)誤次數(shù)，消退測(cè)驗(yàn)潛伏期，消退測(cè)驗(yàn)3 min的錯(cuò)誤次數(shù)；大腦尼氏染色(苯胺藍(lán)染液)，觀察椎體細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)尼氏體數(shù)量(運(yùn)用Image pro plus 5.1進(jìn)行形態(tài)計(jì)量)；ELISA檢測(cè)ACh、5-HT、DA、NA、cAMP、cGMP、PKA含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量、腦指數(shù)比較

實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠活動(dòng)正常，毛色正常，造模和用藥后，體質(zhì)量總體減輕，腦指數(shù)增加，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，氫化可的松、諾麗、人參均不會(huì)對(duì)體質(zhì)量和腦指數(shù)產(chǎn)生影響，結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量和腦指數(shù)的比較

2.2 小鼠記憶行為學(xué)比較

與對(duì)照組比較，模型組跳臺(tái)測(cè)驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)潛伏期顯著縮短(P<0.01)，測(cè)驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加(P<0.01)，說(shuō)明造模成功。與模型組相比，人參組和諾麗高、中劑量組的潛伏期和消退潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01，P<0.05)，錯(cuò)誤次數(shù)和消退錯(cuò)誤次數(shù)也明顯減少(P<0.01，P<0.05)。諾麗高劑量組的療效與人參組相近，結(jié)果見表2、表3。

表2 小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 小鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 小鼠大腦海馬尼氏體表達(dá)情況

對(duì)照組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)椎體細(xì)胞排列緊湊和整齊，尼氏體豐富，且未有明顯的尼氏體深染或固縮。與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬CA3區(qū)尼氏體數(shù)量顯著減少(P<0.01)，細(xì)胞排列疏松，且有明顯的椎體細(xì)胞深染或固縮。與模型組相比，各給藥組小鼠海馬CA3區(qū)尼氏體數(shù)量顯著增加(P<0.01)，細(xì)胞排列稍緊湊，且椎體細(xì)胞深染和固縮減輕。結(jié)果見圖1，表4。

圖1 各組小鼠大腦尼氏染色(×10,×100)

表4 100倍光鏡下各組小鼠大腦CA3區(qū)尼氏體數(shù)量

2.4 小鼠大腦中ACh、5-HT、DA、NA含量比較

與對(duì)照組相比，模型組4種神經(jīng)遞質(zhì)含量均明顯下降(P<0.01，P<0.05)，與模型組相比,人參組和諾麗高、中劑量組可明顯回升4種神經(jīng)遞質(zhì)含量(P<0.01，P<0.05)，結(jié)果見表5。

表5 各組小鼠大腦神經(jīng)遞質(zhì)含量

2.5 小鼠大腦中cAMP、cGMP、PKA含量比較

與對(duì)照組相比，模型組cAMP、cGMP、PKA含量、cAMP/cGMP明顯下降(P<0.01)，與模型組相比,人參組，諾麗高、中、低劑量組均可明顯回升cAMP、cGMP、PKA含量、提升cAMP/cGMP比值(P<0.01，P<0.05)，結(jié)果見表6。

表6 小鼠大腦中cAMP、cGMP、PKA含量、

3 討論

隨著社會(huì)老齡化的發(fā)展趨勢(shì)，記憶減退逐漸成為了嚴(yán)重的社會(huì)和醫(yī)學(xué)問(wèn)題，阿爾茲海默病的主要特征是記憶減退。據(jù)估計(jì),到2030年，全球?qū)⒂?.35億人患有阿爾茲海默病[11]。目前仍未發(fā)現(xiàn)有效的途徑能從根本上治療記憶減退。對(duì)現(xiàn)存改善記憶的中成藥和中藥類保健食品進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和特點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，改善記憶產(chǎn)品用藥多歸腎經(jīng)[12]。中醫(yī)理論認(rèn)為記憶減退與腎密切相關(guān)，腎藏精主骨生髓，腦為髓海，腦為元神之府，腎中精氣虧虛，記憶力下降；腎中精氣充足，腦髓得養(yǎng)，則記憶力增強(qiáng)。GEORGIEVA-KOTETAROVA等[13]在記憶行為學(xué)方面觀察到諾麗可改善由地西泮誘導(dǎo)的癡呆大鼠模型，能夠有效防治記憶減退。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究其歸腎經(jīng)補(bǔ)腎改善記憶的功效和作用機(jī)制。

腎精虧耗產(chǎn)生的陰陽(yáng)氣血失調(diào)是衰老和記憶減退的重要原因，當(dāng)陰陽(yáng)平衡遭到破壞，人體機(jī)能穩(wěn)態(tài)就會(huì)發(fā)生破壞導(dǎo)致衰老和記憶減退。諾麗性平補(bǔ)腎，平補(bǔ)陰陽(yáng)，即在腎精虧虛陰陽(yáng)虛損的情況下，通過(guò)既補(bǔ)腎陰又補(bǔ)腎陽(yáng)調(diào)節(jié)機(jī)體平衡，達(dá)到延緩衰老，改善記憶的目的，符合平性藥“條件顯性，雙向適用”的作用特點(diǎn)[14]。氫化可的松致腎陽(yáng)虛模型是最早建立的中醫(yī)模型之一[15]，之后學(xué)者相繼用腺嘌呤法、頻繁交配法、甲狀腺切除法模擬腎陽(yáng)虛，為腎陽(yáng)虛模型的研究奠定了基礎(chǔ)。沈自尹[16]提出腎陽(yáng)虛與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)有關(guān)，腎陽(yáng)虛證在下丘腦-垂體-靶腺軸不同環(huán)節(jié)、不同程度的功能紊亂，在建立腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型方面取得了較大突破。氫化可的松為外源性糖皮質(zhì)激素，當(dāng)攝入大量外源性糖皮質(zhì)激素后垂體分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素受到抑制，導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)激素分泌減少，腎上腺萎縮，使模型動(dòng)物出現(xiàn)一系列“耗竭”現(xiàn)象，符合中醫(yī)腎陽(yáng)虛證的臨床表現(xiàn)。皋聰?shù)萚10]用氫化可的松建立腎陽(yáng)虛記憶障礙小鼠模型，研究補(bǔ)腎填精對(duì)記憶的改善作用。在補(bǔ)腎陽(yáng)本質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，腎陽(yáng)虛機(jī)體免疫功能總體水平低下，cAMP/cGMP比值下降是腎陽(yáng)虛發(fā)病的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，應(yīng)用藥物使cAMP/cGMP升高，可表示該藥物可補(bǔ)腎陽(yáng)[17]。依據(jù)同類比較原則，陽(yáng)性藥選擇性溫、大補(bǔ)元?dú)?、歸腎經(jīng)[18]、有明確改善記憶作用[19]的人參。人參性溫可溫補(bǔ)腎陽(yáng)，大補(bǔ)元?dú)?，元?dú)馐侨梭w各項(xiàng)生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，是腦部生理功能的根本；元?dú)獬渑妫瑒t腦清神明；元?dú)馓澨摚瑒t髓海失養(yǎng)，記憶減退。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒McAMP/cGMP降低，用藥后cAMP/cGMP升高，諾麗和人參均表現(xiàn)出補(bǔ)腎陽(yáng)的趨勢(shì)。

PACHAURI等[20]應(yīng)用東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶損傷模型，觀察到諾麗可增加避暗實(shí)驗(yàn)的潛伏時(shí)間，增加乙酰膽堿酯酶的活性、提升谷胱甘肽活性、清除丙二醛。本研究避暗實(shí)驗(yàn)及跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均說(shuō)明氫化可的松造模后，小鼠存在嚴(yán)重的認(rèn)知障礙。給予人參或諾麗后其記憶行為得到改善，說(shuō)明人參或諾麗可改善對(duì)小鼠的認(rèn)知能力。諾麗高劑量改善小鼠認(rèn)知障礙的效果最好，且效果與人參相當(dāng)。病理觀察小鼠大腦海馬CA3區(qū)椎體細(xì)胞和尼氏體數(shù)量。椎體細(xì)胞是參與信息傳遞局部微環(huán)路的中間神經(jīng)元，尼氏體為神經(jīng)元細(xì)胞器合成和更新提供結(jié)構(gòu)蛋白，常作為神經(jīng)元功能狀態(tài)的標(biāo)志[21]，尼氏體多而大表明神經(jīng)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的功能較強(qiáng)，突觸為接受信號(hào)和傳遞信號(hào)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的改變均會(huì)影響學(xué)習(xí)記憶[22]。因此抑制神經(jīng)元丟失和改善突觸的形態(tài)及其功能可能對(duì)海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶具有一定的意義。尼氏染色結(jié)果說(shuō)明模型組小鼠存有明顯的神經(jīng)元丟失和尼氏體損傷。給予人參或諾麗后，椎體細(xì)胞深染固縮減輕，表明人參和諾麗可以抑制小鼠神經(jīng)元丟失。

ACh屬于中樞膽堿能系統(tǒng)，在記憶調(diào)節(jié)中起著重要作用[23]。5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)的遞質(zhì)[24]。DA參與學(xué)習(xí)、記憶和注意力等各種認(rèn)知過(guò)程[25]。NA對(duì)記憶的準(zhǔn)確性和泛化產(chǎn)生相反的影響，通過(guò)對(duì)記憶的時(shí)間依賴性重組的系統(tǒng)鞏固過(guò)程產(chǎn)生不同的影響。NA增強(qiáng)基底外側(cè)杏仁核-海馬連通性來(lái)提高記憶準(zhǔn)確性，從而產(chǎn)生持久的海馬依賴性情節(jié)性記憶[26]。造模后，4種神經(jīng)遞質(zhì)均明顯減少，而應(yīng)用人參或諾麗后，神經(jīng)遞質(zhì)含量均得到恢復(fù)。說(shuō)明諾麗可以調(diào)控記憶損傷情況下的腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)。

cAMP作為細(xì)胞內(nèi)傳遞信息的第二信使，主要由腺苷酸環(huán)化酶催化三磷酸腺苷而來(lái)，容易被細(xì)胞內(nèi)磷酸二酯酶水解。因此，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的水平，是由磷酸二酯酶和腺苷酸環(huán)化酶二者功能狀態(tài)決定的。cAMP的升高可增強(qiáng)突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，其作用可能是直接的，也可能是通過(guò)激活PKA來(lái)實(shí)現(xiàn)。研究表明，cAMP/PKA信號(hào)通路在蛋白合成依賴性時(shí)相中起重要作用，可以經(jīng)由磷酸化轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)元件啟動(dòng)通路下游基因的轉(zhuǎn)錄，還能夠磷酸化通道結(jié)構(gòu)亞基而改變其功效，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平和鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。cAMP/PKA信號(hào)通路從多個(gè)方面改善神經(jīng)元內(nèi)在生長(zhǎng)狀態(tài)影響軸突生長(zhǎng)，促進(jìn)軸突的再生[27]。PKA磷酸化代謝過(guò)程中的一些靶蛋白中的絲氨酸或者蘇氨酸殘基，將其激活或活化[28-29]。這些被磷酸化的蛋白是關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)酶、功能重要的蛋白質(zhì)或者轉(zhuǎn)錄因子，因此可以介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的代謝、基因轉(zhuǎn)錄等細(xì)胞的效應(yīng)。通過(guò)對(duì)底物蛋白的磷酸化而參與其下游受體的基因表達(dá)、突觸功能等的調(diào)控、神經(jīng)活性物質(zhì)的釋放與合成。神經(jīng)元和突觸為海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶的生物學(xué)基礎(chǔ)[30]，其下游釋放的神經(jīng)活性物質(zhì)包括Ach、5-HT、DA、NA等。諾麗可以提升cAMP、PKA含量進(jìn)而促使腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)釋放。

綜上所述，腎生髓通腦，諾麗補(bǔ)腎可改善氫化可的松致腎陽(yáng)虛的記憶損傷，其機(jī)制可通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)cAMP/PKA通路蛋白，影響下游神經(jīng)遞質(zhì)含量，促進(jìn)神經(jīng)元蛋白合成而實(shí)現(xiàn)。本研究為探討諾麗中藥藥性、指導(dǎo)臨床配伍應(yīng)用及闡明改善記憶機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。諾麗的中藥藥性仍有待在實(shí)踐中不斷驗(yàn)證與完善。