孫智娜，雷思，彭菲，何秀琴，卓瑪拉毛，吳尚潔*

(1.青海紅十字會(huì)醫(yī)院,青海 西寧 810000；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410011)

十味龍膽花始載于《醫(yī)方甘露精華》，由烈香杜鵑、龍膽花、甘草、矮紫堇、小檗皮、雞蛋參等10味純天然藥材組成的經(jīng)典藏藥，于1996年生產(chǎn)銷售后得以廣泛應(yīng)用[1]，大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究均表明十味龍膽花在抗炎、解熱、抗菌、止咳等方面有很好的效果[1-6],常用于痰熱壅肺所致的咳嗽、喘鳴、痰黃，已被證實(shí)在慢性阻塞性肺疾病、社區(qū)獲得性肺炎、支氣管哮喘等疾病中有確切的臨床療效[7]。其中，烈香杜鵑和龍膽花作為方劑的君藥，具有清熱燥濕的重要作用[8]。霧化治療在氣道疾病治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，目前應(yīng)用廣泛,但在十味龍膽花中的研究甚少。本研究將十味龍膽花的君藥龍膽花和烈香杜鵑兩味藥材進(jìn)行提取，將其提取液制作成霧化液，并探索小鼠霧化吸入該兩種藥材提取液的藥物濃度及急性毒理作用，為后續(xù)十味龍膽花的臨床霧化研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

自制14 cm×24 cm×45 cm透明塑料霧化室，超聲霧化器(江蘇康尚霧化器408D)；藥物：烈香杜鵑及龍膽花均由湖南中醫(yī)附一中藥研究所鑒定合格，去除不利于機(jī)體吸收的纖維素等，再對(duì)該藥材進(jìn)行水提取，最后濃縮成棕黃色果醬樣液體，具體濃度為：烈香杜鵑提取液原始濃度為2 g/mL；龍膽花提取液原始濃度為0.77 g/mL。血生化相關(guān)指標(biāo)測(cè)定儀器：TEK8530全自動(dòng)五分類血液分析儀(江西特康科技有限公司);博科BK-200全自動(dòng)生化分析儀(BIOBASE)。組織病理學(xué)檢查：取左肺，石蠟切片后，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，在BA210T顯微鏡(Motic)下觀察并記錄圖像。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)C57雄性小鼠50只，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(湘)2016-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(湘)2012-003。體質(zhì)量為18～22 g，飼養(yǎng)溫度為20～25 ℃，飼養(yǎng)濕度為40%～70%。

1.3 藥物提取液最大出霧濃度實(shí)驗(yàn)

兩種藥物提取液外觀均為棕黃色果醬樣，為探索霧化情況，均用生理鹽水進(jìn)行稀釋，并分別用2只C57小鼠進(jìn)行藥物提取液霧化，烈香杜鵑提取液原液和龍膽花原液稀釋至60%均可出霧，但后期霧化效果較差，可出現(xiàn)棕黃色果醬樣沉積并堵塞霧化管；烈香杜鵑稀釋至80%時(shí)出霧順暢，龍膽花原液稀釋至50%時(shí)出霧順暢。具體操作：A.2只C57雄性小鼠，4 mL烈香杜鵑原液，霧化40 min(期間加1 mL的生理鹽水稀釋加大霧化量)+5 min留滯(霧化停止，霧化箱不開(kāi)蓋)；逐步每天5%遞減烈香杜鵑提取液濃度，觀察出霧情況； B.2只C57雄性小鼠，4 mL龍膽花原液，霧化40 min(期間加1 mL的生理鹽水稀釋加大霧化量)+10 min留滯(霧化停止，霧化箱不開(kāi)蓋)；逐步每天5%遞減龍膽花提取液濃度，觀察出霧情況。

1.4 多次霧化吸入實(shí)驗(yàn)

10只C57小鼠，分為3組：對(duì)照組2只，烈香杜鵑組和龍膽花組分別4只，采取多次霧化吸入實(shí)驗(yàn)，具體設(shè)置為：霧化吸入80%的烈香杜鵑，霧化2 h，約20 g烈香杜鵑，連續(xù)5 d；霧化吸入50%的龍膽花，霧化2 h，約4.62 g龍膽花，連續(xù)5 d；對(duì)照組正常飼養(yǎng)，不做任何干預(yù)。霧化結(jié)束后飼養(yǎng)1周，觀察小鼠活動(dòng)、體質(zhì)量變化等一般情況，收集血清進(jìn)行血生化(HGB、RBC、WBC及細(xì)胞分類、ALT、TG、BUN、CR等)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，取材檢測(cè)肺組織形態(tài)(HE)，并稱量肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺臟各臟器重量。

1.5 不同濃度組霧化吸入實(shí)驗(yàn)

C57小鼠35只，隨機(jī)分為7組，每組5只，分別為對(duì)照組、烈香杜鵑低劑量組(40%)、中劑量組(60%)、高劑量組(80%)，龍膽花低劑量組(20%)、中劑量組(35%)、高劑量組(50%)。烈香杜鵑及龍膽花各組每次霧化均加入4 mL，一次霧化0.5 h，每日2次，持續(xù)給藥2周(14 d)；對(duì)照組正常飼養(yǎng)，不做任何干預(yù)。霧化結(jié)束后飼養(yǎng)1周，觀察小鼠活動(dòng)、體質(zhì)量變化等一般情況，收集血清進(jìn)行血生化(HGB、RBC、WBC及細(xì)胞分類、ALT、TG、BUN、CR等)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，取材檢測(cè)肺組織形態(tài)(HE)，并稱量肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺臟各臟器重量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多次霧化吸入實(shí)驗(yàn)

2.1.1 體質(zhì)量變化情況

烈香杜鵑組和龍膽花組小鼠體質(zhì)量均有所增長(zhǎng)，但與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 多次霧化吸入實(shí)驗(yàn)各組小鼠體質(zhì)量變化情況

2.1.2 血生化指標(biāo)情況

烈香杜鵑組和龍膽花組各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 多次霧化吸入實(shí)驗(yàn)各組小鼠血生化指標(biāo)情況

2.1.3 各臟器重量情況

烈香杜鵑組和龍膽花組各臟器重量與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 多次霧化吸入實(shí)驗(yàn)小鼠各臟器重量情況

2.1.4 肺組織HE染色結(jié)果

烈香杜鵑霧化組較對(duì)照組肺泡間隙變??；龍膽花霧化組較對(duì)照組肺泡出現(xiàn)大范圍斷裂，且局部充血，見(jiàn)圖1。

圖1 多次霧化吸入后各組肺組織HE染色(400×)

2.2 不同濃度組霧化吸入實(shí)驗(yàn)

2.2.1 體質(zhì)量變化情況

烈香杜鵑各劑量組和龍膽花各劑量組小鼠體質(zhì)量均有所增長(zhǎng)，但與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同濃度組霧化吸入實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量變化情況

2.2.2 血生化指標(biāo)情況

烈香杜鵑各劑量組和龍膽花各劑量組中的各項(xiàng)生化指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5。

表5 不同濃度組霧化吸入實(shí)驗(yàn)小鼠血生化指標(biāo)情況

2.2.3 各臟器重量情況

烈香杜鵑組和龍膽花組各臟器重量與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表6。

表6 不同濃度組霧化吸入實(shí)驗(yàn)小鼠各臟器重量情況

2.2.4 肺組織HE結(jié)果

對(duì)照組氣道上皮結(jié)構(gòu)完整，纖毛整齊，肺泡結(jié)構(gòu)正常，氣道及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少；烈香杜鵑與龍膽花各劑量組氣道結(jié)構(gòu)及肺泡結(jié)構(gòu)正常、纖毛整齊，與對(duì)照組相比，未見(jiàn)明顯病理?yè)p害，見(jiàn)圖2。

注：A.對(duì)照組；B.烈香杜鵑低劑量組；C.烈香杜鵑中劑量組；D.烈香杜鵑高劑量組；E.龍膽花低劑量組；F.龍膽花中劑量組；G.龍膽花高劑量組。 圖2 不同濃度霧化吸入各組肺組織HE染色(400×)

3 討論

烈香杜鵑屬杜鵑花科、杜鵑花屬植物，其根莖部、葉、花均具有藥理活性作用。此外，烈香杜鵑具有獨(dú)特的香味,與含有大量的揮發(fā)油有關(guān)，其組成成分包括芐基丙酮(34.41%)、橙花叔醇(10.19%)、1,4-桉樹(shù)腦(8.41%)、β-石竹烯(5.63%)、γ-欖香烯(5.10%)、桉油烯醇(3.06%)等[9]。研究表明，橙花叔醇具有抗炎、抗氧化、抗微生物、抗癌的效果，可通AMPK/Nrf-2/HO-1信號(hào)通路抑制脂多糖導(dǎo)致的急性肺損傷，也可在環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的肝臟炎癥、凋亡、纖維化中起保護(hù)作用[10-11]。β-石竹烯可以抗炎、抑制Toll樣受體激活、激活Erk1/2和PI3K/Akt、阻斷STAT3信號(hào)級(jí)聯(lián)、增強(qiáng)AMPK磷酸化、抗凋亡等[12]。除揮發(fā)油外，黃酮類化合物是烈香杜鵑的另一主要活性成分，主要包括槲皮素、5-羥基- 6,7-二甲氧基黃酮、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、烈香杜鵑素Ⅰ、烈香杜鵑素Ⅱ，其中槲皮素是一種常見(jiàn)類黃酮物質(zhì)，具有廣泛的生物活性如抗炎、抗氧化、抗纖維化等[13-14]。

龍膽花為龍膽科龍膽屬多種植物的花，主要分布于西藏、甘肅、青海等地。據(jù)《晶珠本草》記載，龍膽花對(duì)氣管炎、咳嗽等疾病有治療之效[15]。藏藥“龍膽花”所含化學(xué)成分主要有裂環(huán)烯醚萜和環(huán)烯醚萜類、黃酮類、酮類、三萜類和甾體類。研究表明，環(huán)烯醚萜類龍膽苦苷具有抗炎、抗氧化、抗菌等藥理作用[8]。XIE等[16]報(bào)道龍膽苦苷可顯著抑制炎癥因子的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。

霧化吸入是將藥物放入霧化裝置內(nèi)，將藥物轉(zhuǎn)變?yōu)闅馊苣z狀態(tài)后傳遞至呼吸道和肺的給藥方式。同口服、靜脈和肌肉注射相比，有減少用藥不適感及藥品用量、起效快、局部用藥濃度高、全身不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[17-18]，在呼吸系統(tǒng)疾病的治療中起著舉足輕重的作用。藏藥?kù)F化將藏醫(yī)和現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合，已被證實(shí)確切有效且方便，目前已逐漸應(yīng)用于臨床[1]。本研究首次結(jié)合龍膽花、烈香杜鵑與霧化吸入，通過(guò)烈香杜鵑和龍膽花提取液探討烈香杜鵑和龍膽花可霧化濃度及在小鼠中的急性毒理學(xué)作用。

初步探索烈香杜鵑和龍膽花的可出霧濃度，發(fā)現(xiàn)烈香杜鵑原液和60%的龍膽花均可用于霧化吸入，但霧化后期效果欠佳，棕黃色果醬樣液體可沉積并堵塞霧化管。將濃度分別調(diào)整為80%的烈香杜鵑和50%的龍膽花后，霧化順暢。在烈香杜鵑和龍膽花的急性毒性研究實(shí)驗(yàn)中，小鼠均正常生長(zhǎng)，未見(jiàn)異常表現(xiàn)。體質(zhì)量增幅，血常規(guī)和生化指標(biāo)，各器官體質(zhì)量與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)，顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果未見(jiàn)有意義的病理學(xué)變化。為進(jìn)一步探討不同濃度對(duì)小鼠的影響，分別予以40%、60%、80%的烈香杜鵑，20%、35%、50%的龍膽花提取液霧化，發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量的烈香杜鵑和龍膽花組小鼠均正常生長(zhǎng)，體質(zhì)量增幅未有明顯改變。血生化指標(biāo)、各器官體質(zhì)量與對(duì)照組相比，差異均無(wú)顯著性(P>0.05)，顯微鏡下形態(tài)學(xué)結(jié)果亦未見(jiàn)明顯病理學(xué)變化。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，烈香杜鵑和龍膽花提取液的最大可霧化濃度為80%和50%；烈香杜鵑和龍膽花提取液霧化安全，無(wú)明顯的急性毒副作用。

綜上，烈香杜鵑和龍膽花提取液的最大可霧化濃度分別為80%、50%,根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部《食品安全毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法規(guī)范》中標(biāo)準(zhǔn)，在此試驗(yàn)條件下霧化吸入烈香杜鵑及龍膽花提取液對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體無(wú)明顯不良影響，本研究為十味龍膽花臨床霧化的實(shí)施提供了理論依據(jù)。