李 磊 孟紅旭 陳 雨 付建華 袁清習(xí) 史 躍 馬彥雷 劉建勛

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)(2.中國科學(xué)院高能物理研究所，北京 100049)

冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙(coronary microvascular dysfunction，CMD)通常是指發(fā)生于直徑小于300 μm心臟血管的結(jié)構(gòu)和功能改變，是心臟X綜合征、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)后無復(fù)流等微循環(huán)病變的共同發(fā)病機(jī)制[1]。和心外膜冠脈狹窄一樣，CMD導(dǎo)致心肌耗氧的供需失衡，引起臨床癥狀并影響心血管疾病的診療和預(yù)后。隨著現(xiàn)代影像學(xué)的迅速發(fā)展，CMD的發(fā)生和防治得到越來越多的關(guān)注[2]。

X射線技術(shù)是廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種重要檢測分析手段，傳統(tǒng)X射線成像技術(shù)是基于不同材料或組織對X射線吸收不同而獲得成像的襯度，然而生物組織樣品產(chǎn)生的吸收襯度有限，直徑200 μm以下的微血管不能通過傳統(tǒng)的冠脈造影檢查評估[3]。傳統(tǒng)的血管可視化研究手段如組織病理學(xué)切片、血管熒光染色等，對微血管空間結(jié)構(gòu)的展示尚停留在二維平面層次，無法精確再現(xiàn)血管網(wǎng)絡(luò)的空間分布[4]。目前，在CMD的診斷和療效評價(jià)方面缺乏對微小動(dòng)脈的可視化技術(shù)，尤其缺乏適合小動(dòng)物冠脈微血管的可視化研究方法。

衍射增強(qiáng)成像(diffraction enhanced imaging，DEI)也稱為基于晶體的相位襯度成像，是利用硅晶體極高的角度選擇特性探測樣品引起的X 射線角度變化來獲得樣品襯度圖像[5]。近年來，X射線衍射增強(qiáng)成像方法逐漸應(yīng)用到生物醫(yī)藥領(lǐng)域[6-7]。與傳統(tǒng)的X射線吸收成像技術(shù)相比，由于軟組織對X射線的相位襯度比吸收襯度大100～1 000倍，因此DEI在生物軟組織方面具有顯著優(yōu)勢，為微血管的觀測和評估提供了有效手段。血管鑄型作為形態(tài)學(xué)研究的一項(xiàng)經(jīng)典技術(shù)，是管道鑄型的重要種類之一，可以通過重建血管樹分析和評價(jià)血管三維形態(tài)，為研究某器官或組織的血管分布做出了重要貢獻(xiàn)[8-9]。近年來，Chen等[10]將該技術(shù)應(yīng)用于心衰大鼠心臟微血管病變研究，然而在CMD方面該技術(shù)應(yīng)用鮮有報(bào)道。

雙參寧心膠囊是本院研發(fā)的治療氣虛血瘀證冠心病的組分中藥，由人參、丹參和延胡索三藥味有效部位按比例組成，具有益氣活血、化瘀止痛之功效，用于冠心病、CMD及心絞痛氣虛血瘀證。前期研究顯示，雙參寧心膠囊能明顯改善心肌缺血(再灌注)損傷，增加缺血心臟的冠脈血流量，改善冠脈微循環(huán)；對血清乳酸脫氫酶(LDH)的增高、肌酸激酶(CK)活性升高及血漿內(nèi)皮素(ET)的活性有明顯抑制作用；通過保存缺血心肌三磷酸腺苷(ATP)，對心肌細(xì)胞凋亡、自噬、線粒體自噬等均具有調(diào)控作用[11-13]。本研究主要采用血管鑄型及X射線衍射增強(qiáng)成像技術(shù)探索CMD時(shí)冠脈微血管三維變化及雙參寧心膠囊的作用，為下一步開展機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)健康雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量 300～320 g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作及飼養(yǎng)均在中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2015-0011。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)步驟符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。該研究經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動(dòng)管理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置均符合國家科委《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并遵循：“3R”原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道的關(guān)懷，審批號(hào)： 2020XLC007-2。

1.1.2藥物與試劑:雙參寧心膠囊(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥學(xué)室)，氫氧化鉀和戊巴比妥鈉(Sigma)；自凝牙托粉和自凝牙托粉水(安陽市鷹牌齒科有限公司)；鄰苯二甲酸二丁酯(無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司)；大紅色油畫顏料(廣州市美幫祈福文儀有限公司)；40～120 μm栓塞微球(Merit Medical)。

1.1.3主要儀器:DW-3000S型雙通道小動(dòng)物呼吸機(jī)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；α77 Ⅱ數(shù)碼單電相機(jī)(SONY)。4W1A成像實(shí)驗(yàn)站(北京同步輻射裝置)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與給藥:動(dòng)物適應(yīng)3 d后，隨機(jī)分為三組，每組6只。具體分組如下：①假手術(shù)組(Sham)：不注射栓塞微球，給予等體積生理鹽水；②模型組(Model)：注射栓塞微球，給予等體積生理鹽水；③雙參寧心膠囊組(SSNX)：給予雙參寧心膠囊，劑量為1 mL/100 g。各組動(dòng)物3只用于血管鑄型研究，另外3只用于X線衍射(X-ray diffraction,XRD)成像研究。雙參寧心膠囊組動(dòng)物，連續(xù)給予雙參寧心膠囊7 d，劑量為1 mL/100 g灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水，末次給藥后2 h進(jìn)行模型制備，造模后24 h處死取材。

1.2.2CMD模型建立:參考Sun等[14]造模方法，大鼠按體質(zhì)量給予戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，胸部常規(guī)備皮，取仰臥位固定于手術(shù)板上，把頭頸部拉直固定，行氣管插管術(shù)，將氣管插管與小動(dòng)物呼吸機(jī)連接。大鼠于左前外側(cè)沿胸骨左側(cè)緣縱向切開皮膚，鈍性分離肌層，開胸暴露第4肋中部并縱向剪斷，以垂直肋骨方向放置大鼠開胸器，剪開心包膜暴露心臟，分離主動(dòng)脈弓，并在其下穿一棉線，令大鼠穩(wěn)定10 min后，將棉線兩端提起并用血管夾夾閉主動(dòng)脈，迅速以注射器從心尖部直接向左心室注射0.2 mL栓塞微球(微球直徑42～120 μm，約含1 000個(gè)微球)，注射前回抽血以確保針尖在心腔中，夾閉20 s后，松開血管夾，待呼吸心跳穩(wěn)定后，徹底止血、逐層縫合肌肉和皮膚。拔除氣管插管，普通飼養(yǎng)。假手術(shù)組手術(shù)過程采用同樣的操作，區(qū)別僅在于大鼠注射的為 0.2 mL生理鹽水。

1.2.3動(dòng)物冠脈血管鑄型及圖像采集:根據(jù)李忠華等[15]方法及預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定血管鑄型劑配方如下：自凝牙托粉25 g、自凝牙托水25 mL、鄰苯二甲酸二丁酯12 mL及大紅油畫顏料2 mL。使用時(shí)先將自凝牙托水、鄰苯二酸二丁酯及油畫顏料混勻攪拌充分，注意用玻璃棒順時(shí)針攪拌使其充分混勻，攪拌過程中避免氣泡產(chǎn)生，最后加入自凝牙托水，再次攪拌均勻后立即用20 mL的塑料注射器灌注，不間斷、緩慢加壓注入，15 min內(nèi)鑄型劑有較好的流動(dòng)性。

大鼠麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈插管注入1%肝素生理鹽水處死動(dòng)物。剪開動(dòng)物下腔靜脈放血，直至從靜脈端流出清亮的液體為止，再灌入鑄型劑，直至鑄型劑從下腔靜脈流出表示灌注成功。結(jié)扎腹主動(dòng)脈和下腔靜脈，靜置標(biāo)本于室溫下4 h。待鑄型劑完全聚合后，取心臟放置于含有2%吐溫80的4 mol/L氫氧化鉀堿溶液中腐蝕組織，3 mL/g心肌組織。室溫消化24 h，其間適當(dāng)搖晃以便腐蝕掉的組織脫落，沖洗干凈后移入純水中保存。血管鑄型圖像采集使用索尼α77 Ⅱ數(shù)碼單電相機(jī)，配合索尼SAL 50 mm f/2.8 Macro 鏡頭拍攝。使用Image Pro Plus 6.0軟件完成定標(biāo)，并標(biāo)注相關(guān)血管直徑。拍照后將冠脈鑄型從純水中取出，修剪去除主動(dòng)脈弓處等多余部分，室內(nèi)放置待鑄型表面無水分后稱質(zhì)量[16]。

1.2.4X射線衍射增強(qiáng)用樣本制備:動(dòng)物麻醉后分離下腔靜脈，并插入留置針。頸總動(dòng)脈插管，連接三通，50 mL生理鹽水從下腔靜脈緩慢注入，同時(shí)放開頸總動(dòng)脈插管放血，待頸總動(dòng)脈血流顏色變?yōu)橥该鲿r(shí)，更換為4%多聚甲醛從下腔靜脈插管處緩慢注入，直至大鼠四肢僵硬時(shí)停止灌注。假手術(shù)組和模型組各取1只動(dòng)物，在橫切面乳頭肌水平取3～4 mm心臟切片，其他動(dòng)物切除左右心房后，保留完整心室組織固定。將心臟組織放入4%多聚甲醛固定液中保存[17]。

1.2.5XRD增強(qiáng)圖像采集與分析:衍射成像研究在北京同步輻射裝置(Beijing synchrotron radiation facility， BSRF)4W1A成像實(shí)驗(yàn)站開展。EDI方法的光路示意見圖1A，單色器(晶體)主要作用是從白光X射線中通過調(diào)整入射角度獲得特定波長的單色X射線，單色X射線通過樣品內(nèi)部密度不同或結(jié)構(gòu)不同區(qū)域時(shí)會(huì)發(fā)生不同大小的折射角折射，放置在樣品之后的分析晶體通過調(diào)節(jié)接受角度，選擇某一折射角度出射的X射線，放大這種密度不同或結(jié)構(gòu)不同造成的光強(qiáng)度變化，最終在檢測器上得到襯度增強(qiáng)圖像。高靈敏度衍射成像系統(tǒng)主要包括同步輻射光源、單色器、旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)、分析晶體和探測器組成，見圖1B。4W1A 成像實(shí)驗(yàn)站建在Wiggler白光束線上，光束線出口距發(fā)光點(diǎn)43 m，光源尺寸水平方向?yàn)?.2 mm，垂直方向?yàn)?.8 mm，X射線能量范圍為3～22 KeV，物像距為0.3 m。為獲得更好的成像效果，于拍攝前1 h將心臟樣品從多聚甲醛中去除，用濾紙拭去表面并置于空氣中風(fēng)干。

圖1 XRD光束線及實(shí)驗(yàn)裝置(北京同步輻射)

實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置: 選擇Si(400)晶體進(jìn)行分析。單色光能量為20 keV，電子束流強(qiáng)度Ie為60～100 mA，曝光時(shí)間在峰位為70 ms左右，半高位均為280 ms，探測器使用X射線CCD成像系統(tǒng)探測器：Hamamatsu C12849-101U；探測器像素尺寸：6.5×6.5 μm。放置樣品后獲取搖擺曲線，然后分別在搖擺曲線的峰位和反射率為50%左右的半高寬位進(jìn)行成像。CT 掃描參數(shù)設(shè)置: 光子能量15 keV，曝光時(shí)間12 ms，轉(zhuǎn)臺(tái)轉(zhuǎn)速0.32°/s，CT數(shù)據(jù)采集的投影范圍為180°，角度間隔0.5°。圖像采集及三維重建結(jié)束后，利用濾波反投影算法進(jìn)行二維斷層重建，并將二維切片圖像利用Avizo9.0軟件進(jìn)行三維可視化處理。采用Zanatta等[18]“無血管評分法”對冠脈微血管病變程度進(jìn)行半定量評分，具體評分如下：0分，未見明顯微血管異常；1分，冠脈微血管異?；驕p少率≤33%；2分，冠脈微血管異常或減少率33%～66%；冠脈微血管異?；驕p少率>66%。

2 結(jié)果

2.1 大鼠冠脈血管鑄型結(jié)果

本研究所使用的鑄型劑可以在室溫下2 d內(nèi)方便快捷的制作出大鼠冠脈血管主干和微血管標(biāo)本。鑄型標(biāo)本冠脈血管管道較完整、飽滿，血管樹的空間分布清晰。該鑄型劑配方可以一次性灌注完成，顯示血管最小直徑可達(dá)40 μm(見圖2)，更小的血管在該鑄型條件下顯示比較困難，更細(xì)的血管在心肌消化時(shí)多數(shù)隨心肌脫落。

圖2 大鼠冠脈血管鑄型

2.2 CMD大鼠血管鑄型改變及雙參寧心膠囊干預(yù)作用

經(jīng)心室內(nèi)注射栓塞微球建立的CMD大鼠冠脈鑄型標(biāo)本可見冠脈血管稀疏，微血管密度明顯較假手術(shù)動(dòng)物減少，冠脈血管鑄型質(zhì)量較假手術(shù)組明顯降低(P<0.01)。雙參寧心膠囊預(yù)防后給藥7 d可以明顯改善冠脈血管分布異常，增加微血管密度(見圖3)。

圖3 各組動(dòng)物冠脈血管鑄型比較

2.3 高精度衍射成像圖采集結(jié)果

XRD成像中，為獲得樣品的吸收、折射、散射等信息，需要樣品在搖擺曲線不同位置獲得不同襯度的圖像，在搖擺曲線峰值位置時(shí)采集的圖像成為DEI峰位圖。所有樣本均獲得良好的衍射增強(qiáng)圖像峰位圖，圖像襯度較好，立體感較強(qiáng)，呈浮雕樣。圖像的空間分辨率及襯度分辨率明顯要高于常規(guī)X線檢測。心臟橫向切片后，采集的DEI峰位投影圖中觀察不到明顯的血管結(jié)構(gòu)(見圖4)。心室縱向放置采集的圖像可以觀察到類似血管走形的投影，然而各組間未觀察到明顯差異(見圖5)。上述結(jié)果提示直接獲得的DEI峰位圖不能直接用于觀察冠脈微血管分布情況。

圖4 大鼠心室橫切面DEI峰位投影

圖5 大鼠心室縱向DEI峰位投影

2.4 CT圖像及血管三維重建

利用Avizo 9.0軟件，對DEI圖進(jìn)行三維重建，選取適當(dāng)灰度值，可以觀察到冠脈微血管走形及空間形態(tài)結(jié)構(gòu)。心室橫切面取材直接CT三維重建，顯示冠脈微血管直徑最小15～25 μm，但只能觀察到心室壁內(nèi)部一部分血管走形，對深部穿支血管的形態(tài)空間分布顯示模糊，同時(shí)受到心肌腱索圖像干擾較多(見圖6)。由于受到圖像干擾，該觀察條件下，假手術(shù)組和模型組大鼠冠脈微血管并未見明顯差異。

圖6 大鼠心室DEI成像CT三維重建

整個(gè)心室通過旋轉(zhuǎn)CT掃描拍攝得到361張DEI峰位圖，經(jīng)過濾波反投影法轉(zhuǎn)換可以得到約1 000幀橫斷面圖(見圖7A)。對整個(gè)心室所有斷層進(jìn)行重建，圖像干擾增多，很難發(fā)現(xiàn)有意義的血管改變(見圖7B)。經(jīng)過反復(fù)對比，發(fā)現(xiàn)心臟冠脈回旋支分布節(jié)段，200層(第800～1 000層)斷層片重建獲得的圖像比較有利于觀察冠脈微血管(見圖7C)。通過選擇適當(dāng)?shù)幕叶龋梢詫⒐诿}微血管較好顯示，血管走形遵循從大到小的一般規(guī)律，分布情況與解剖學(xué)冠脈血管走形分布大體一致，可以見到最小直徑為10 μm的冠脈微血管(接近毛細(xì)血管直徑)。相同觀察條件對CMD大鼠冠脈微血管進(jìn)行觀察，假手術(shù)組動(dòng)物冠脈微血管分布主干粗大且分支完整清晰明顯(見圖7D)，而冠脈微栓塞動(dòng)物的冠脈微血管主干變細(xì)，分支數(shù)明顯減少，冠脈微血管評分降低(P<0.01)(見圖7E)。給予劑量為雙參寧心膠囊90 mg/kg干預(yù)的大鼠冠脈微血管較模型組動(dòng)物明顯血管密度增加，增加冠脈微血管評分(P<0.05)，見圖7F及表1。

表1 大鼠冠脈微血管鑄型質(zhì)量及XRD成像血管評分

圖7 冠脈微血管三維重建

3 討論

傳統(tǒng)的X線冠脈造影技術(shù)不能評價(jià)冠脈微血管，病理組織學(xué)切片技術(shù)雖然可以觀察到微血管的改變但不能反映血管樹的三維立體分布。冠脈微血管鑄型技術(shù)具有構(gòu)建性強(qiáng)、美觀且色澤鮮艷，能真實(shí)的反映出標(biāo)本的血管網(wǎng)形態(tài)、分布及側(cè)支的吻合情況。自2012年，使用自凝牙托材料進(jìn)行心血管鑄型研究已經(jīng)廣泛應(yīng)用在解剖教學(xué)和大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，其制作的標(biāo)本具有支撐力強(qiáng)、收縮率小、柔韌性好、鑄型飽滿、價(jià)格低廉、化學(xué)性能和物理機(jī)械性能都比較穩(wěn)定的特點(diǎn)[17]。本研究結(jié)果顯示，使用自凝牙托材料可以快捷的制作大鼠冠脈血管鑄型標(biāo)本，鑄型標(biāo)本可以反映出CMD大鼠血管異常，雙參寧心膠囊可以明顯改善CMD大鼠血管鑄型所示的冠脈微血管密度降低。

隨著DEI技術(shù)的逐步完善，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)等領(lǐng)域表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。XRD成像的中搖擺曲線指出射光強(qiáng)隨分析晶體角度搖擺而變化的曲線，分析晶體具有極高的角度選擇性，只有那些嚴(yán)格滿足布拉格衍射條件的部分X射線才能通過分析晶體到達(dá)探測器進(jìn)行成像。將分析晶體調(diào)節(jié)到搖擺曲線不同位置，通過轉(zhuǎn)換樣品和成像裝置之間不同方位，可以獲得衍射增強(qiáng)影像[18]。本研究使用北京同步輻射裝置開展大鼠冠脈微循環(huán)血管三維重建探索。由于心臟相對較厚，前期研究報(bào)道在該裝置上觀察小鼠活體成像十分模糊，較肝臟和腎臟影像清晰度差，除了顯示心臟大血管結(jié)構(gòu)外，其余結(jié)構(gòu)顯示欠佳[19]。因此本研究采用大鼠離體心臟固定后采集圖像進(jìn)行分析重建。高分辨率和高質(zhì)量的原始圖像是進(jìn)行精確血管三維重建的重要基礎(chǔ)，樣品的處理需經(jīng)過嚴(yán)格統(tǒng)一的灌注、固定、脫水等操作。本研究分別采用橫斷切片和整個(gè)心臟兩種方式進(jìn)行了圖像采集的探索，結(jié)果顯示心臟橫切片雖然可以得到橫切面的高清晰和高分辨率DEI峰位投影圖，同時(shí)經(jīng)過CT重建后可以觀察到部分冠脈微血管，然而在空間分辨程度上不夠清晰。對心臟整體進(jìn)行DEI峰位投影圖采集可以獲得立體、浮雕感的圖像，可以直接觀察到細(xì)微冠脈微血管走形，但并不能區(qū)分出假手術(shù)大鼠與模型大鼠的區(qū)別。若將所有獲得的近1 000幀圖像進(jìn)行CT重建，得到的圖像由于偽影和圖像重疊不能清楚觀察到冠脈微血管。因此，本研究通過減少重建的幀數(shù)，并調(diào)整灰度值，在冠脈乳頭肌水平選擇200幀進(jìn)行重建，可以獲得冠脈回旋支較為清晰的影像，而且冠脈微球栓塞導(dǎo)致的CMD大鼠冠脈微血管分布出現(xiàn)異常，冠脈主干變細(xì)，同時(shí)冠脈微血管明顯減少，給予雙參寧心膠囊預(yù)防性給藥7 d后，冠脈微循環(huán)明顯改善，冠脈分支較模型組明顯增多。

綜上所述，血管鑄型和XRD增強(qiáng)成像均能在一定程度上構(gòu)建出血管網(wǎng)的三維可視化模型。XRD增強(qiáng)成像技術(shù)在顯示冠脈微血管細(xì)節(jié)方面具有極大優(yōu)勢，最細(xì)可以顯示到直徑為10 μm級(jí)別血管。血管鑄型和XRD增強(qiáng)成像均在一定程度上反映大鼠CMD時(shí)冠脈微血管空間分布改變，雙參寧心膠囊干預(yù)對動(dòng)物模型的冠脈微血管亦可以見到明顯改善。XRD增強(qiáng)成像方法的樣本制作簡便，獲得圖像可后期轉(zhuǎn)化分析，對CMD的實(shí)驗(yàn)研究具有一定參考價(jià)值。