孫天奇 秦佟童 張 睿 陳菁青 唐玉玲 任延玲 邱業(yè)峰

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071)

臍疝(umbilical hernia，UH)指腹腔內(nèi)容物通過臍部薄弱區(qū)域突出體外，是常見的腹壁疝之一。臨床上UH的手術(shù)治療數(shù)量每年達(dá)10萬～17.5萬例[1-2]，是第二大常見的疝氣類型[3]，嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量。在養(yǎng)殖行業(yè)中，豬、牛等畜牧動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)和育種工作也受到UH的影響：以在全球肉類供應(yīng)中占有重要地位的豬為例，UH發(fā)病率為0.4%～1.2%[4]，其中規(guī)?；i場中發(fā)病率最高可達(dá)5%[5]，且具有明顯的遺傳特性。UH是大多數(shù)哺乳動(dòng)物共有的特征性結(jié)構(gòu)，所以在野生動(dòng)物[6]、寵物[7]及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[8]中也均有發(fā)生。UH是一種多基因隱性遺傳[9]的復(fù)雜性疾病，由于缺少穩(wěn)定自發(fā)UH的臨床樣本或動(dòng)物模型，目前其致病機(jī)制和易感基因尚處于探索階段。

UH大鼠是本單位于2009年開始培育的一種自發(fā)UH且性狀能夠穩(wěn)定遺傳的大鼠種群，該種群從F12代起UH發(fā)病率即可達(dá)到100%[10]。本研究在該基礎(chǔ)上繼續(xù)采用全同胞交配法對自發(fā)性UH大鼠模型進(jìn)行近交繁育至F32代，對F32代個(gè)體的表型特征、生長曲線、生化及血液指標(biāo)、主要臟器系數(shù)等生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級UH大鼠為本中心生產(chǎn)繁育，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(軍)2017-0014。SPF級SD大鼠購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0010。本實(shí)驗(yàn)已通過軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院福利倫理審查，審查編號：IACUC-DWZX-2020-060。

1.2 飼養(yǎng)及管理?xiàng)l件

大鼠飼養(yǎng)于本中心屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(軍)2017-0022。墊料為玉米芯，經(jīng)高壓滅菌處理，每周更換1次；飼料為本中心生產(chǎn)全價(jià)營養(yǎng)顆粒飼料，生產(chǎn)許可證號：SCXK(軍)2017-0015；飲水為微電解無菌水溫度：22～26 ℃，相對溫度40%～60%，明暗交替12 h/12 h。

1.3 表型特征觀察

分別取雌、雄性UH大鼠各12只，8～10周齡，觀察UH發(fā)病部位外觀特征。抓取大鼠呈直立狀，用游標(biāo)卡尺分別測量UH疝囊長軸、短軸長度，并進(jìn)行分析。

1.4 臍部及周圍組織病理切片制作和觀察

分別取成年UH大鼠及SD大鼠各6只，CO2法處死動(dòng)物，沿腹中線剪開腹部皮膚，暴露腹壁肌肉層，觀察臍孔及臍環(huán)形態(tài)特征。以臍部為中心，剪取3 cm×3 cm腹壁肌肉，4%多聚甲醛固定。制作病理切片并進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，鏡下觀察臍部病理變化，具體步驟包括如下兩步。

1.4.1切片制作:梯度乙醇脫水70%、80%、95%和100%各30 min，二甲苯兩瓶各20 min，石蠟浸蠟兩缸各12 min，石蠟包埋，切片厚度4 μm，烤片。

1.4.2HE染色:常歸染色，中性樹脂膠封固；光鏡觀察并顯微照相。

1.5 生長曲線測定

分別取UH大鼠和SD大鼠各20只，雌雄各半，仔鼠自出生起至第8周，每周測量3次體質(zhì)量，觀察其生長發(fā)育情況，繪制生長曲線。

1.6 血常規(guī)及血液生化指標(biāo)測定

分別取UH大鼠24只、SD大鼠18只，雌雄各半，8～10周齡。剪尾取血共1.5 mL，其中EDTA抗凝管盛裝0.5 mL，用于血常規(guī)指標(biāo)檢測；離心管盛裝1 mL，4 000 r/min離心5 min，取上層血清，用于測定血液生化指標(biāo)。

1.7 主要臟器系數(shù)測定

分別取UH大鼠和SD大鼠，各20只，雌雄各半，8～10周齡。稱體質(zhì)量后，CO2法處死動(dòng)物，按照腹腔至胸腔的順序先后剖取肝、脾、左腎、右腎、心、肺等臟器，除去附在器官周圍的脂肪組織，將表面血液吸盡，用電子天平稱質(zhì)量。最后計(jì)算各臟器質(zhì)量與體質(zhì)量的比值，即為臟器系數(shù)。

1.8 肝、脾病理切片制作及觀察

取UH大鼠6只，雌雄各半，分別剖取肝、脾組織，4%多聚甲醛固定后，制作病理切片并進(jìn)行HE染色，鏡下觀察肝和脾是否存在病理變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

生物學(xué)特性相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，使用Pearson相關(guān)分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析等方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 表型特征

UH大鼠在臍部形成明顯的疝囊結(jié)構(gòu)并突出于體外(圖1A～1B)，疝囊柔軟，呈橢圓形或圓形，雄性疝囊顯著大于雌性(P<0.01)，見表1。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，單一性別中疝囊大小與體質(zhì)量無顯著相關(guān)性(P>0.05)。解剖可見臍部形成疝環(huán)結(jié)構(gòu)，呈橢圓形或圓形，邊緣纖維化，中間腹壁肌肉缺失，直接暴露腹腔腸道(圖1C)。HE染色結(jié)果顯示，UH大鼠臍部形成清晰的疝環(huán)輪廓，邊緣結(jié)締組織增厚(圖2A)；SD大鼠腹中線兩側(cè)肌肉閉合緊密，結(jié)合處結(jié)締組織完整，無異常增生現(xiàn)象(圖2B)。

圖1 UH大鼠表型特征

表1 UH大鼠疝囊大小

圖2 臍部及周圍組織形態(tài)

2.2 生長曲線

UH大鼠和SD大鼠生長曲線見圖3。雄性UH大鼠第1～3周體質(zhì)量生長趨勢與雄性SD大鼠相同，第4周開始雄性UH大鼠體質(zhì)量顯著低于同齡SD大鼠(P<0.01)，而兩種大鼠雌性體質(zhì)量無顯著差異。

圖3 UH大鼠和SD大鼠生長曲線

2.3 血常規(guī)及血液生化指標(biāo)

血常規(guī)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)見表2和表3。血常規(guī)指標(biāo)方面，UH大鼠部分指標(biāo)在雌性和雄性中均與SD大鼠存在差異，如UH大鼠平均紅細(xì)胞體積(MCV)和平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(MCH)顯著低于SD大鼠(P<0.01)，紅細(xì)胞體積大小的變異系數(shù)(RDW-CV)和單核細(xì)胞數(shù)目(MONO)顯著高于SD大鼠(P<0.01)。此外，UH大鼠的一些血常規(guī)指標(biāo)在單性別中與SD大鼠存在差異，如紅細(xì)胞(RBC)、紅細(xì)胞大小形狀的一致程度(RDW-SD)、平均血小板體積(MPV)、降鈣素原(PCY)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目(EO)、中性粒細(xì)胞數(shù)目(NEUT)、嗜堿性粒細(xì)胞(BASO)、血紅蛋白(HGB)等。血液生化指標(biāo)方面， UH大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)等在雌雄個(gè)體中均明顯高于SD大鼠(P<0.01)。此外，部分生化指標(biāo)僅在單一性別中產(chǎn)生差異，如白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、尿素(UA)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、總蛋白(TP)、肌酐(Crea)等。

表2 UH大鼠與SD大鼠血液生理指標(biāo)的比較

表3 UH大鼠與SD大鼠血液生化指標(biāo)的比較

2.4 主要臟器系數(shù)

UH大鼠和SD大鼠主要臟器質(zhì)量和臟器系數(shù)結(jié)果見表4和表5。UH大鼠雄性個(gè)體各主要臟器質(zhì)量均大于雌性個(gè)體。雄性UH大鼠的脾臟器系數(shù)顯著大于雄性SD大鼠(P<0.01)，左腎臟器系數(shù)顯著小于雄性SD大鼠(P<0.05)；雌性UH大鼠的肝、脾臟器系數(shù)顯著大于雌性SD大鼠(P<0.01)。UH大鼠肝和脾HE染色結(jié)果如圖4所示，肝臟細(xì)胞核圓形，肝細(xì)胞未見明顯變性壞死，肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉內(nèi)和匯管區(qū)內(nèi)偶見小灶性炎，為淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞灶性浸潤；脾臟白髓淋巴組織中央生發(fā)中心不明顯，由幼稚的成淋巴細(xì)胞構(gòu)成，外部邊緣區(qū)淋巴細(xì)胞中心可見中央小動(dòng)脈；紅髓髓索清楚，其間髓竇充滿紅細(xì)胞。脾臟飽滿，胞膜光滑。

表4 UH大鼠與SD大鼠主要臟器質(zhì)量

表5 UH大鼠與SD大鼠主要臟器系數(shù)

圖4 UH大鼠肝、脾病理結(jié)果

3 討論

遺傳性UH大鼠模型是在進(jìn)行SD大鼠生產(chǎn)繁育過程中，偶然發(fā)現(xiàn)UH自發(fā)的個(gè)體，通過選種進(jìn)行全同胞交配培育而成，目前已繁育至F32代。在長期的近交繁育后，UH大鼠該性狀能夠穩(wěn)定遺傳，且在體質(zhì)量、臟器系數(shù)、血液生理生化指標(biāo)等生物學(xué)特性均發(fā)生了不同程度的改變。成年UH大鼠的UH大小在不同性別之間差異顯著，雄性疝囊顯著大于雌性，而在相同性別的UH大鼠中，疝囊大小與體質(zhì)量無顯著相關(guān)性。UH大鼠與SD大鼠在1～8周齡間的體質(zhì)量變化趨勢相同，8周齡個(gè)體體質(zhì)量無顯著差異，而雄性UH大鼠在出生后第4周左右開始與SD大鼠產(chǎn)生差異，體質(zhì)量增長相對緩慢，至8周齡時(shí)UH大鼠體質(zhì)量顯著低于SD大鼠。臟器系數(shù)方面，UH大鼠脾臟較SD大鼠明顯增大，而肝臟增大僅出現(xiàn)于UH大鼠中的雌性個(gè)體。病理結(jié)果顯示，UH大鼠脾臟無病變，肝臟可見有淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞集聚的小灶性炎。肝臟小灶性炎是SD大鼠常見的伴隨性病變之一[11]，而UH大鼠由SD大鼠培育而來，因此該病變與臍疝相關(guān)的可能性較?。黄⒃龃笠喾遣±硇愿淖?。 此外，UH大鼠多項(xiàng)生理生化指標(biāo)較SD大鼠發(fā)生了顯著改變。以上結(jié)果說明UH大鼠已形成獨(dú)特的品系特征，所得到的各項(xiàng)生物學(xué)特性結(jié)果可為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。國內(nèi)外已報(bào)道的易感基因中，IL-16[12]、OSM、LIF[13]等均與免疫功能密切相關(guān)。UH大鼠模型中與免疫密切相關(guān)的脾臟較SD大鼠偏大，而血液生化結(jié)果顯示MONO相較于對照組顯著增高，以上結(jié)果表明UH大鼠該性狀的出現(xiàn)可能與免疫功能的變化有關(guān)，但該結(jié)論仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

UH是一種復(fù)雜性疾病，受環(huán)境因素和遺傳因素的共同影響[14]。目前對于其致病機(jī)制的研究受限于樣本數(shù)量較少、缺少合理可信的陰性對照組[15]等因素，而在易感基因研究方面，目前用于研究的動(dòng)物種類各異、種群背景信息不明或差異巨大，且UH具有多基因隱性遺傳及種族異質(zhì)性等特征，因此已發(fā)現(xiàn)的易感基因在其他研究中缺少重復(fù)性驗(yàn)證。另外這些基因的功能亦未能在同種群中進(jìn)行功能機(jī)制驗(yàn)證，以上原因?qū)е乱赘谢虻墓δ軝C(jī)制研究仍在推論階段。本研究所培育的遺傳性UH大鼠模型UH發(fā)病率保持100%，且出生后即自發(fā)UH，臨床表現(xiàn)和病理特征與人及其他哺乳動(dòng)物相似，是研究UH易感基因及功能機(jī)制的理想動(dòng)物模型。