陳小均 賈玉森 張志杰 張延江 張偉濤

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

男性不育為男科臨床常見疾病，畸形精子癥為男性不育的常見類型。精子形態(tài)是影響受孕的重要參數(shù)，并對(duì)精子活力產(chǎn)生影響，與精子DNA的完整性有關(guān)，還可以影響到精卵結(jié)合[1-2]?；尉影Y的病因復(fù)雜，影響因素較多，發(fā)病機(jī)理不清[3]，亟待研究解釋其發(fā)病機(jī)制。在精子形態(tài)方面，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類差別較大。雷公藤(Tripterygiumwilfordii)多苷模型為男性不育癥常用模型[4]，大鼠為研究男性不育癥常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但針對(duì)大鼠的精子形態(tài)分析的報(bào)道較少。因此本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)中的雷公藤多苷模型大鼠精子形態(tài)變化進(jìn)行觀察，描述該模型大鼠精子異常形態(tài)，以期對(duì)畸形精子癥的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g(6周齡)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK(京)2016-0011。雷公藤多苷片，規(guī)格10 mg，購(gòu)自遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司。精子形態(tài)染色Diff-Quick試劑，購(gòu)自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。實(shí)驗(yàn)已通過北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院福利倫理委員會(huì)審查，編號(hào)：201813。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

SD大鼠適應(yīng)性飼喂1周后，隨機(jī)分為三組，4周組、8周組和對(duì)照組，每組10只。對(duì)照組正常飼喂， 予生理鹽水劑量為10 mL/kg灌胃，1次/d；4周組和8周組劑量為30 mg/kg，新鮮配制雷公藤多苷混懸液灌胃，1次/d，分別持續(xù)4周及8周。大鼠自由進(jìn)食、飲水，隔日更換籠中的木屑?jí)|料以保持清潔。環(huán)境溫度：20～25 ℃，相對(duì)濕度：40%～70%，晝夜光照：12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)自開始之日起，大鼠每周稱體質(zhì)量1 次，觀察記錄體形、毛色、步態(tài)、覓食、活動(dòng)情況、有無(wú)死亡及其可能的原因。在給藥4周及8周后，分別取4周組和8周組共10只大鼠進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.3 大鼠精子形態(tài)分析

大鼠末次給藥24 h后處死，迅速剪開腹腔，仔細(xì)完整地分離睪丸、附睪及輸精管，用眼科剪沿附睪縱軸剪一刀使其分為大致均勻的兩半，然后沿橫軸剪兩刀使附睪分為大致均勻的6段，將剪碎的附睪組織移入預(yù)置常溫孵育緩沖液1 mL 的試管中，然后用1 mL 孵育緩沖液沖洗培養(yǎng)皿，沖洗液移入裝附睪的試管中。分離輸精管，于輸精管與附睪尾結(jié)合部、輸精管與前列腺結(jié)合部剪切離斷輸精管。用胰島素注射針抽取孵育緩沖液1 mL，沿輸精管一側(cè)斷端將針頭插入輸精管管腔內(nèi)，輕推注射器，可見另一側(cè)斷端流出1～2 滴乳白或灰白色液體，內(nèi)含大量精子，將所得液體滴入裝附睪的試管中并置于37 ℃恒溫孵育箱中孵育30 min，進(jìn)行精子形態(tài)學(xué)分析。

根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行快速染色法(Diff-Quik)，檢測(cè)精子形態(tài)。步驟簡(jiǎn)述如下：在玻片上標(biāo)記樣本信息，取10 μL精液加在玻片邊緣，推片，空氣干燥；放入固定液中15 s，瀝干；染色(快速染色液1、10 s和快速染色液2、5 s)，流水沖洗10～15次，空氣干燥玻片；用10×100 亮視野油鏡檢查染色后的涂片，進(jìn)行精子形態(tài)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠正常精子形態(tài)

在光鏡下，大鼠的精子形態(tài)與人的精子不同，大鼠精子頭部彎曲、呈鐮刀型、表面光滑、頂體和頂體后區(qū)分界欠清晰、頭頸部連接于腹側(cè)、頸部細(xì)長(zhǎng)、中段粗細(xì)一致、主段較長(zhǎng)、逐漸變細(xì)及無(wú)成角彎折(圖1)。

圖1 大鼠正常形態(tài)精子(×100)

2.2 大鼠異常形態(tài)描述

無(wú)鉤、頭部折疊、小頭、無(wú)尾、頸部斷裂、無(wú)頭、尾部卷曲及斷尾，其中無(wú)頭及無(wú)尾畸形為常見類型(圖2)。

圖2 大鼠異常精子形態(tài)(×100)

2.3 三組大鼠精子形態(tài)異常率比較

三組大鼠精子形態(tài)異常率比較結(jié)果，F(xiàn)=83.00，P=0.00<0.01，差異極顯著。進(jìn)一步多重比較發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠精子異常率很低，大多數(shù)精子形態(tài)均正常；雷公藤多苷灌胃4周后，大鼠精子畸形率升高，與空白組比較，P=0.00<0.01，差異極顯著；8周后畸形率進(jìn)一步升高，與空白組及4周組比較，P=0.00<0.001，差異極顯著。

表1 大鼠精子形態(tài)異常率比較

3 討論

在對(duì)不育癥實(shí)驗(yàn)研究的文獻(xiàn)中，少有對(duì)畸形精子的專門實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告[5]，多見于對(duì)少弱精、生精障礙[6]、男性不育的病因?qū)W[7]等的實(shí)驗(yàn)研究。其中最常用的模型是雷公藤多苷模型和奧硝唑模型。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，奧硝唑?qū)Ω讲G中精子的作用，主要是干擾精子成熟和運(yùn)動(dòng)所必需的糖酵解酶，使精子獲取能量過程受阻，從而降低精子的活率與活力[8-9]，而雷公藤多苷既作用于大鼠睪丸曲細(xì)精管中各級(jí)生精細(xì)胞, 又作用于附睪中的精子[10]，其作用于精子發(fā)生的整個(gè)過程,影響生精功能和精子發(fā)育形態(tài)，長(zhǎng)期給藥損傷可加重且長(zhǎng)時(shí)間無(wú)法恢復(fù)[11]。故而在對(duì)精子形態(tài)的實(shí)驗(yàn)研究中采用雷公藤多苷造模更為合適。

雷公藤多苷的生殖毒理研究表明，其生殖毒性呈時(shí)間和劑量依賴性，10～30 mg均可導(dǎo)致生殖細(xì)胞損傷，但低劑量需要的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。對(duì)精子形態(tài)的影響方面，文獻(xiàn)報(bào)道不一，25 mg和30 mg均有報(bào)道[5]。本研究采用30 mg的偏大劑量造模，觀察精子形態(tài)變化。在大鼠精子染色方面，文獻(xiàn)中有選擇HE染色法[12-13]、伊紅染色法[14-16]、伊紅/苯胺黑染色法[17-18]、瑞-吉氏染色法[19]等，其中使用最多的是伊紅染色及伊紅/苯胺黑染色。人精子形態(tài)染色常用的染色方法有改良巴氏染色法、瑞吉氏染色法、Shorr 染色法和Diff-Quik 染色法。石亮等[20]對(duì)上述4種染色法比較發(fā)現(xiàn)，上述4種染色方法檢測(cè)形態(tài)正常精子率、頭部畸形精子率和頂體完整精子率,差異均不顯著(P>0.05)。但根據(jù)盛慧強(qiáng)等[21]報(bào)道，Diff-Quik 染色法可將精子頂體區(qū)染為淡紫色、核區(qū)為紫藍(lán)色和中段及主段為淡紅色，為一種簡(jiǎn)單且快速的染色方法，與經(jīng)典的改良巴氏染色法在精子形態(tài)評(píng)估中無(wú)顯著差異。因此，本研究采用Diff-Quik 染色法對(duì)大鼠精子染色，并發(fā)現(xiàn)大鼠的精子形態(tài)與人的精子差別較大，總結(jié)如下：(1)大鼠精子形態(tài)正常率很高，異常率低，而人精子形態(tài)異常率高，正常率低；(2)大鼠精子頭部形狀不同于人精子的橢圓形，為彎曲狀、呈鐮刀型，表面光滑，頂體和頂體后區(qū)分界不是很清，大鼠精子頭部明顯小于人精子頭部；(3)在光鏡下，大鼠精子頸部為非對(duì)稱性插入于頭部，頭頸部連接于腹側(cè)，頸部細(xì)長(zhǎng)，中段粗細(xì)一致；(4)大鼠精子主段明顯比人精子長(zhǎng)，無(wú)成角彎折。上述大鼠精子形態(tài)描述和楊燕平等[22]在電鏡下觀察到的大鼠精子形態(tài)類似。研究發(fā)現(xiàn)Diff-Quik 染色大鼠精子，圖片背景相對(duì)干凈，大鼠精子密度較高，直接涂片染色，易出現(xiàn)精子重疊，影響觀察，建議稀釋后染色；大鼠精子頭頂體和頂體后區(qū)分界不清，可能為大鼠精子頭部較小有關(guān)；大鼠精子較長(zhǎng)，光鏡下閱片，每個(gè)視野中完整的精子數(shù)偏少，影響讀片速度；應(yīng)用此染色方法，染色后保存時(shí)間較短，需要盡快完成讀片，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，存在褪色，影響讀片。

在大鼠精子異常形態(tài)類型方面，郭健敏等[11]研究雷公藤多苷對(duì)雄性SD大鼠生殖系統(tǒng)損傷，發(fā)現(xiàn)精子畸形主要有斷頭、圓頭、折疊和頭部不定型；柳建明等[23]用奧硝唑灌胃大鼠造模弱精子癥大鼠，發(fā)現(xiàn)精子表現(xiàn)為無(wú)鉤、胖頭、斷頭、雙尾、尾部折疊及斷尾等畸形；熊芬等[24]報(bào)道奧硝唑高劑量組還可見大片頭部缺失或頂體不完整的精子；孫華明等[25]觀察低功率微波對(duì)大鼠精子的影響，發(fā)現(xiàn)大鼠精子表現(xiàn)為不定形、胖頭、香蕉頭、無(wú)勾、雙頭(多頭)、雙尾(多尾)和尾折疊的形態(tài)異常；Khalil等[26]證明，暴露于“四溴二苯醚”的大鼠可出現(xiàn)無(wú)尾、無(wú)頭、尾部彎曲、短尾、主段變細(xì)、細(xì)胞質(zhì)殘留等異常形態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)的雷公藤多苷造模大鼠精子形態(tài)異常類型和上述文獻(xiàn)報(bào)道類似，與人的精子異常類型相似，但未觀察到雙頭、雙尾、細(xì)胞質(zhì)殘留等異常類型，而這些文獻(xiàn)中對(duì)大鼠精子形態(tài)異常類型多為文字描述，罕見有詳細(xì)圖示。

大鼠精子異常率方面，吳國(guó)琳等[27]用雷公藤多苷劑量為25 mg/kg灌胃，30 d后比較大鼠精子形態(tài)異常率結(jié)果如下：正常組(6.73±2.28)%，模型組(25.63±7.35)%。張才田等[28]用雷公藤多苷劑量為16 mg/kg灌胃，發(fā)現(xiàn)2周后精子畸形率上升(1.2±1) vs (11±1)，P<0.05；4周和6周后畸形率升高更顯著，P<0.001，證實(shí)雷公藤多苷對(duì)大鼠精子具有抑制作用。本研究采用30 mg/kg雷公藤多苷灌胃，4周后精子形態(tài)異常率明顯升高，8周后可見到更為明顯的異常率，和徐穎等[29]報(bào)道的雷公藤多苷的生殖毒性表現(xiàn)為時(shí)間依賴性一致。

綜上，畸形精子癥為不育癥的常見類型，但目前無(wú)畸形精子癥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型報(bào)道，并且罕有描述大鼠精子異常形態(tài)類型的圖片，不利于畸形精子癥的研究。本研究采用雷公藤多苷30 mg/kg灌胃大鼠，研究其對(duì)大鼠精子形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)其可使大鼠精子出現(xiàn)頭部、中段及主段的各種畸形，這和人的精子異常類型相似，且精子畸形率較空白組明顯增加。雖采用奧硝唑灌胃造模大鼠后，發(fā)現(xiàn)亦能造成大鼠精子畸形率增高[23]，但采用奧硝唑灌胃后，精子畸形率無(wú)明顯變化[30]，而雷公藤多苷和奧硝唑誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)物模型的病理機(jī)制存在著顯著差異[31]。在大鼠精子形態(tài)染色方面，研究發(fā)現(xiàn)Diff-Quik 染色法對(duì)大鼠精子染色效果良好，可以作為一種實(shí)用的大鼠精子染色方法。大鼠精子和人精子差別較大，本研究對(duì)大鼠精子的異常類型進(jìn)行了描述及圖片展示，對(duì)大鼠精子和人精子的區(qū)別進(jìn)行了詳細(xì)描述，為相關(guān)研究提供參照及依據(jù)。因此，雷公藤多苷灌胃大鼠，可成功建立畸形精子癥大鼠模型，且精子畸形類型和人的精子畸形類似。本研究所建立的大鼠模型較為穩(wěn)定，并且可選擇時(shí)間及劑量更為靈活，可以作為畸形精子癥動(dòng)物模型。

僅采用雷公藤多苷單一劑量，并且只在光學(xué)顯微鏡下觀察，未進(jìn)行多劑量研究及電鏡下大鼠精子形態(tài)分析，存在不足。在接下來的研究中，將進(jìn)行雷公藤多苷多劑量研究，找到最適的雷公藤多苷畸形精子癥大鼠模型的劑量及成模時(shí)間，以便于相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。