朱曉燕 劉 勤, 白惠玲 金 濤 張 書 張延英 康萬榮

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院/甘肅省人民醫(yī)院，蘭州 730000)(2. 甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心，蘭州 730000)(3.甘肅省人民醫(yī)院眼科，蘭州 730000)

2型糖尿病(rype 2 diabetes mellitus，T2DM)是臨床最常見的慢性病及基礎疾病之一。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，T2DM的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢[1]。糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是T2DM患者中較常見的一種微血管并發(fā)癥，亦是導致盲眼病的重要原因[2]。根據Olivares等[3]報道，國內對DR的研究多集中在1型DR模型上，理想的2型DR動物模型仍處發(fā)展階段，國外建立2型DR動物模型多采用基因敲除法。由于條件所限，國內用這種方法建立模型尚有困難，且因無法在活體上動態(tài)的監(jiān)測視網膜變化，國內以往對于DR大鼠視網膜的觀察多在離體眼球上進行，導致動物所需數量較多。因此，研究較為簡單的方法建立理想的2型DR模型并優(yōu)化觀察視網膜的方法具有一定的現實意義。本研究采用SD大鼠建立2型DR模型，并通過眼底熒光造影(fundus fluorescein angiography，FFA)和病理形態(tài)改變動態(tài)的觀察視網膜，以了解大鼠眼底血管形態(tài)及病變嚴重程度，以期為DR相關治療提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級SD大鼠80只，雄性，6周齡，體質量(150±20)g，購自甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號：SYXK(甘)2020-0009，所有大鼠屈光間質清晰，外眼及眼前節(jié)檢查均無異常表現，常規(guī)飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級實驗室。實驗動物處理遵守甘肅中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院實驗動物倫理原則，實驗動物倫理審查編號：2020-298。

1.1.2試劑與儀器：鏈脲佐菌素(strep-tozotocin，STZ)，購自北京索萊寶科技有限公司，批號616S0212；檸檬酸和檸檬酸鈉，購自天津市大茂化學試劑廠，批號20161101，20171010；復方托吡卡胺滴眼液購自沈陽興齊眼藥股份公司，批號200802；熒光素鈉注射液，購自Alcon Research LLC，批號314040F；血糖儀及試紙，購自拜耳(中國)有限公司，批號DP9LM3F02 A；大鼠胰島素ELISA試劑盒，購自江蘇菲亞生物科技有限公司；高脂高糖飼料，購自沈陽茂華生物科技有限公司，生產許可證號SCXK(遼)2017-0001，基礎飼料上加20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇及1%膽酸鈉；眼球固定液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；眼底血管熒光造影機(型號SpectralisHRA+Multicolor)購自德國海德堡公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠分組及造模：將所有大鼠按隨機數字表法分為空白對照組及T2DM組，n=40。造模方法根據王保偉等[4]研究，將所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，空白對照組給予普通飼料，T2DM組給予高脂高糖飼料，喂養(yǎng)4周，禁食不禁水16 h后，T2DM組按30 mg/kg腹腔注射STZ(STZ溶于0.1 mol/L的pH 4.5的檸檬酸鈉緩沖液中，配成1%溶液，現配現用，30 min內用完)以誘發(fā)T2DM；空白對照組僅注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。72 h后，在大鼠尾靜脈采血，用血糖儀檢測血糖濃度，凡空腹血糖濃度≥16.7 mmol/L、HOMA-IR增加伴尿量及飲水量均明顯增多的大鼠作為T2DM成模標準。模型成立后，將T2DM組40只大鼠隨機分為造模后3個月組、造模后4個月組、造模后5個月組及造模后6個月組，每組10只。

1.2.2模型的觀察指標:注射STZ后，每天觀察并記錄大鼠的一般狀況，主要包括精神狀態(tài)、毛發(fā)顏色、運動情況、攝食量、飲水量、墊料潮濕程度等，并及時更換尿濕的墊料；每周測量各組大鼠的體質量、隨機血糖、空腹血糖及空腹血清胰島素(FINS)指標，比較各組的體質量變化及血糖值變化并計算分析HOMA-IR(=空腹血糖×FINS/22.5)。

1.2.3FFA檢查:大鼠T2DM造模后3個月、4個月、5個月及6個月進行FFA檢查。所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg進行麻醉，雙眼滴復方托吡卡胺散瞳，將大鼠麻醉、散瞳后移至熒光造影機前，按0.5 mL/kg向腹腔注射10%熒光素鈉，注射后即開始攝影，主要以視盤為正中心拍攝中心圖。另外，根據實際情況可拍攝上、下、左、右的視網膜情況。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色:分別于T2DM造模后3個月、4個月、5個月及6個月FFA檢查完畢后頸椎脫臼處死大鼠，迅速摘除眼球，眼球固定液固定，石蠟包埋后切片，切片時定位到靠近視神經完整的視網膜進行縱切，使切片之間具可比性，HE染色，光學顯微鏡觀察并拍照。

2 結果

2.1 一般情況觀察

空白對照組大鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)柔順光滑，活潑好動，每日攝食量和飲水量適中，墊料干燥；T2DM組大鼠STZ腹腔注射后第1周，大鼠表現出多食、多飲、多尿及體質量減輕的糖尿病癥狀，隨著病程延長，大鼠逐漸表現出精神萎靡，毛發(fā)雜亂枯黃、易脫毛，倦怠懶動，每日的飲食、飲水及尿量明顯增多，墊料潮濕并伴爛蘋果味。隨時間增加，上述癥狀愈加明顯，伴體型極度消瘦萎靡、皮包骨樣、弓背蜷縮且狀態(tài)不佳。

2.2 體質量及血糖變化

造模前，空白對照組與T2DM組大鼠體質量和血糖差異無顯著性(P>0.05)；造模后，空白對照組大鼠體質量穩(wěn)定增加，T2DM組大鼠體質量增加不明顯且隨著時間的延長伴有不同程度的減輕。T2DM造模后3個月、4個月、5個月及6個月時大鼠體質量明顯減輕，與空白對照組比較差異極顯著(P<0.01)；血糖顯著升高，與空白對照組比較差異極顯著(P<0.01)，見圖1和圖2所示。

圖1 不同病程各組大鼠體質量變化趨勢

圖2 不同病程各組大鼠血糖變化趨勢

2.3 HOMA-IR比較

造模前，空白對照組和T2DM組大鼠FINS和HOMA-IR差異無顯著性(P>0.05)；造模后，T2DM組FINS和HOMA-IR較空白對照組顯著升高，經統計學處理后差異極顯著(P<0.01)。造模后，FINS和HOMA-IR之所以升高，考慮原因是高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯合小劑量STZ注射只是部分破壞了大鼠胰島B細胞功能，說明此種造模方法已經成功復制出了大鼠胰島素抵抗模型，即T2DM模型(表1)。

表1 造模前后兩組大鼠FINS和HOMA-IR比較

2.4 FFA檢查情況

空白對照組大鼠眼底清晰且視網膜血管走行規(guī)則、粗細均勻一致并以視盤為中心呈放射狀分布；T2DM組：3個月大鼠眼底尚清晰、視網膜血管走行迂曲、可見微動脈瘤及少量點狀強熒光；4個月大鼠視網膜血管不規(guī)則擴張、并可見毛細血管叢及大面積強熒光滲漏；5個月大鼠眼底模糊、血管周圍可見熒光滲漏及片狀出血；6個月大鼠因晶體混濁眼底窺不清、隱見血管走行迂曲且血管周圍可見熒光滲漏及出血(圖3)。

圖3 不同病程各組大鼠FFA結果

2.5 HE染色

空白對照組大鼠視網膜各層結構完整且排列整齊、細胞形態(tài)正常、內界膜清晰可見，神經節(jié)細胞單層排列，內核層由3～5層細胞構成，外核層較厚，由8～10層細胞排列而成；T2DM組3個月大鼠，各層細胞排列紊亂，神經節(jié)細胞層可見擴張的血管(×200)，內外核層細胞數量減少，排列稀疏；T2DM組4個月大鼠，各層細胞排列紊亂且界限不清，神經節(jié)細胞層可見血管樣結構，視網膜神經節(jié)細胞層及內、外核層水腫；T2DM組5個月大鼠，神經節(jié)細胞水腫，可見突破內外叢狀層的血管樣結構，神經節(jié)細胞數量減少，內外核層界限不清、細胞稀疏、排列紊亂、出現空泡樣變和異常血管樣結構；T2DM組6個月大鼠，神經節(jié)細胞進一步減少，內外核層間界限消失，結構紊亂甚至中斷，細胞排列雜亂無章，神經節(jié)細胞層和內外核層空泡樣變性明顯，可見大量穿行于內外核層的迂曲血管，見圖4所示。

圖4 不同病程各組大鼠視網膜HE

3 討論

DR作為T2DM嚴重的微血管并發(fā)癥，可導致視力永久性喪失[5]，而該病的患病率也在逐年增加，據估計到2040年全球約有6.24億人患有糖尿病[6]，其中T2DM占糖尿病總數的90%～95%[7]。臨床研究表明，DR的發(fā)病與T2DM的病程和血糖水平直接相關[8]，因此建立理想的T2DM動物模型是研究DR的重要基礎。

根據林春華等[9]，T2DM動物模型按造模方式主要分為三類：自發(fā)性T2DM動物模型、誘導性T2DM動物模型和轉基因T2DM動物模型，但是自發(fā)性和轉基因T2DM動物因價格昂貴、來源相對較少等缺點，限制其在科學研究方面的應用和普及，而實驗性T2DM動物模型則因為成本較低、操作簡便、重復性高等優(yōu)點，應用最為廣泛。建立T2DM動物模型常用的實驗方法包括手術誘導、飲食誘導、藥物誘導、聯合誘導等，其中因聯合誘導(高脂高糖飲食聯合小劑量STZ)的T2DM大鼠能較好的模擬T2DM的發(fā)病因素、病理過程和臨床特征，并且造模時間相對較短，成本相對較低，而成為該病的理想造模方法[10-11]。高脂高糖飲食可通過降低實驗動物的胰島素敏感性，使機體糖耐量降低從而誘發(fā)胰島素抵抗[12]。STZ是一種廣譜抗菌素，對動物胰島B細胞具有特異性的毒性作用，它會選擇性損傷胰島B細胞，導致胰島素分泌減少[13]，而胰島素抵抗和胰島功能受損是T2DM的典型病理生理特征和重要依據[14]。Gheibi等[15]以高脂喂養(yǎng)大鼠2周后，單次腹腔注射STZ 30 mg/kg 建立T2DM模型；Gomaa等[16]以高脂喂養(yǎng)大鼠4周后單次腹腔注射STZ 25 mg/kg建立T2DM模型。因此，結合上述文獻報道和預實驗結果，本研究改進實驗方法，采用高糖高脂飲食喂養(yǎng)4周聯合小劑量STZ 30 mg/kg腹腔注射建立T2DM大鼠模型，大鼠模型血糖維持較好，且在長達6個月的實驗周期內無一死亡。

雖然有大量的物種被用于制作DR模型，比如小鼠、大鼠、貓、狗、豬和非人靈長類動物，但大鼠模型仍是最常被研究的，因為它們體積適中、壽命短且繁殖速度快，可以進行最有效的研究[17]。目前，國內DR模型常用的大鼠品系是SD大鼠或者Wistar大鼠。章成昌等[18]選用Wistar大鼠，因為Wistar大鼠不僅有SD大鼠的優(yōu)良基因，且比SD大鼠更溫順，有利于實驗操作的進行和實驗數據的采集，但是農慧等[19]用相同劑量的STZ造模，發(fā)現Wistar大鼠的死亡率可以達到50%以上，可見SD大鼠的抵抗力強于Wistar大鼠。由于本實驗周期長，對大鼠的生存能力要求較高，故選用SD大鼠。

莊秋霞等[20]和姜曉丹等[21]研究表明，FFA是臨床上診斷DR時最常采用的一種方法，它可以通過動態(tài)反映視網膜毛細血管的實時循環(huán)情況從而實現DR的早期診斷和分期，即使是微小病變也能準確捕捉，而目前DR大鼠模型驗證方面恰恰缺乏這部分內容。以往國內針對DR大鼠視網膜的觀察主要在離體眼球上進行[22-24]，但這些方法較為局限，因為無法在活體上動態(tài)觀察眼底改變，它意味著必須先處死大鼠才能觀察到視網膜，因此大鼠使用量較大，不符合3R操作原則。鑒于此，本研究結合FFA和HE染色，在活體動態(tài)監(jiān)測T2DM大鼠視網膜出現病變的基礎上，再處死大鼠進行視網膜組織病理學改變的觀察，研究方法的改進在符合動物倫理學要求的原則下更加全面的模擬T2DM的DR大鼠模型。由于條件所限，本研究對大鼠行FFA檢查時，使用為人眼設計的海德堡血管造影機，但人眼球的參數與大鼠眼球參數存在明顯區(qū)別，這種差異導致需要耗費大量時間調整動物眼位才能獲得FFA圖像。若能改進技術，可以調整適應大鼠的眼球參數，便能更加簡便地獲得DR大鼠FFA圖片。同時在研究過程中，隨著T2DM大鼠病程的延長，尤其至6個月時，大鼠普遍發(fā)生白內障，嚴重的晶狀體混濁導致FFA不能評估視網膜血管的變化并無法獲得清晰的FFA圖片。如果研究初期，能同時結合光學相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)、FFA和HE技術，不僅能對補后期難以進行的FFA問題，還有助于活體上觀察T2DM大鼠視網膜厚度的動態(tài)變化，從而可以進一步與HE結果對比分析，這無疑對研究DR模型具有更重要的意義。

總之，本研究通過高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周聯合30 mg/kg STZ腹腔注射建立的T2DM大鼠模型，并應用FFA和病理學技術動態(tài)監(jiān)測到T2DM大鼠在病程3個月時觀察到視網膜血管發(fā)生的病變，同時也觀察到DR的病理形態(tài)學改變。隨著病程延長，病變也在逐漸加重。因此，該模型的成功建立以及病變的驗證方法可以被進一步用于研究T2DM的DR發(fā)病機制及對新型抗DR藥物的評估。