王貴瑩，闞偉,2*，趙冰,2，丁爽，姜曉彤，杜佳慧，王麗艷,2

(1.齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué)黑龍江省表面活性劑與工業(yè)助劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

pH值在生物體內(nèi)扮演重要的角色，穩(wěn)態(tài)pH對(duì)于生命體維持正常的生命活動(dòng)具有重要意義。細(xì)胞功能障礙、惡性腫瘤、心肺疾病、阿爾茨海默病等多種惡性疾病與生命體pH值的變化具有密切的聯(lián)系[1-4]。監(jiān)測(cè)生命體的pH值變化對(duì)于人體生命健康以及醫(yī)學(xué)研究具有重要意義。傳統(tǒng)的pH檢測(cè)采用玻璃電極法[5]、弱酸弱堿分布法[6]、核磁共振法[7]和原子吸收法[8]等，這些方法大多存在靈敏度低、選擇性差、操作復(fù)雜和成本高等缺點(diǎn)。近年來，熒光光譜法因其高靈敏度和低成本等優(yōu)點(diǎn)，在pH值檢測(cè)過程中被人們廣泛關(guān)注[9-11]，同時(shí)設(shè)計(jì)合成了大量的具有不同結(jié)構(gòu)特征的pH熒光探針[12-15]，其中部分熒光探針在細(xì)胞凋亡監(jiān)控[16]、熒光-光聲成像[17]、生物成像[18]、廢水監(jiān)測(cè)等方面成功應(yīng)用。然而，目前文獻(xiàn)報(bào)道的pH熒光探針存在探針的水溶性差、pH值響應(yīng)的范圍窄和響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，在一定程度上限制了探針的廣泛應(yīng)用。因此，設(shè)計(jì)和開發(fā)水溶性好、寬分布響應(yīng)和響應(yīng)靈敏的pH探針對(duì)研究者們?nèi)匀皇且粋€(gè)挑戰(zhàn)。

圖1 探針PIF-1和PIF-2的合成

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

9,10-菲醌、對(duì)硝基苯甲醛、熒光素和雷尼鎳，AR，上海阿拉丁試劑有限公司；乙酸銨、苯胺、水合肼 (N2H4·H2O，純度50%)，AR，伊諾凱化學(xué)試劑公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸、冰乙酸、乙酸乙酯、石油醚、N,N-二甲基甲酰胺，AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；其他溶劑和無機(jī)鹽均為市售分析純?cè)噭?，使用前未處理?/p>

Spectrum GX型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)珀金埃爾默公司；UV-Vis TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器公司；AVANCE-600核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司；LS-55型熒光分光光度計(jì)，美國(guó)Perkin Elmer公司；M-60熔點(diǎn)儀，瑞士BUCHI公司；FlashSmart CHNS/O元素分析儀，德國(guó)ThermoFisher公司。

1.2 合成及表征

1.2.1 中間體的合成

4-[(1-苯基-1H-菲并[9,10-d]咪唑)-2-基]苯胺(1)、4-[(1H-菲并[9,10-d]咪唑)-2-基]苯胺(2)和熒光素單醛(3)按照文獻(xiàn)[19-20]方法合成。

1.2.2 探針的PIF-1和PIF-2合成

將0.77 g(2.0 mmol)化合物1、0.72 g(2.0 mmol)熒光素單醛(3)和20 mL冰醋酸依次加入三口瓶中，室溫?cái)嚢?。反?yīng)過程中采用TLC(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=6∶4) 跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，6 h后反應(yīng)結(jié)束。將混合物倒入100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鈉水溶液中，充分?jǐn)嚢?，有暗黃色固體析出，抽濾，濾餅經(jīng)水洗后干燥。用乙酸乙酯重結(jié)晶得到黃色固體PIF-1，產(chǎn)率：95%, 熔點(diǎn)：184～188 ℃。IR(KBr),σ/ cm-1: 3 434, 3 062, 1 760,1 636, 1 605, 1 554, 13 59, 1 202;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6),δ:14.70(s, 1H), 10.20(s, 1H), 9.53(s, 1H), 8.93(d,J=7.50 Hz, 1H), 8.88(d,J=78.20 Hz, 1H), 8.72(d,J=77.50 Hz, 1H), 8.01(d,J=78.50 Hz, 1H), 7.81～7.67(m, 12H), 7.58～7.54(m, 3H), 7.34(t,J=77.80 Hz, 1H), 7.30(d,J=77.20 Hz, 1H), 7.08(d,J=77.20 Hz,1H), 6.98(s, 1H), 6.76(s, 1H), 6.69(s, 1H), 6.63～6.57(m, 2H);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6),δ:169.1, 164.1, 160.0, 158.6, 152.6, 151.7, 151.4, 150.3, 147.3, 138.7, 137.1, 136.3, 133.8, 131.0, 130.9, 130.7, 130.6, 130.2, 129.6, 129.6, 129.4, 129.1, 128.5, 128.2, 128.0, 127.1, 127.1, 126.5, 126.4, 126.3, 125.7, 125.2, 125.0, 124.5, 124.1, 122.9, 122.5, 122.4, 122.0, 120.7, 114.2, 113.7, 109.8, 109.0, 107.1, 103.4;元素分析(C48H29N3O5計(jì)算值),%: C 79.36(79.22), H 4.08(4.02), N 5.61(5.77)。

探針PIF-2采用化合物2和熒光素單醛(3)合成，方法與探針PIF-1的合成方法相似，得到深紅色固體為PIF-2。產(chǎn)率：90%；熔點(diǎn)：301～303 ℃；IR(KBr),σ/ cm-1: 3 426, 3 072, 1 740, 1 637, 1 599, 1 547, 1 314, 1 210;1H NMR(600 MHz DMSO-d6),δ：14.87(s, 1H), 13.55(s, 1H), 10.22(s, 1H), 9.67(s, 1H), 8.89(d,J=7.50 Hz, 1H), 8.86(d,J=8.00 Hz, 1H), 8.63(d,J=8.50 Hz, 1H), 8.58(d,J=7.50 Hz, 1H), 8.47(d,J=7.20 Hz, 2H), 8.03(d,J=7.50 Hz, 1H), 7.85～7.83(m, 2H), 7.82～7.73(m, 4H), 7.68～7.64(m, 2H), 7.33(d,J=8.50 Hz, 1H), 7.03(s, 1H), 6.81(d,J=7.00 Hz, 1H), 6.74(d,J=8.50 Hz, 1H), 6.65～6.61 (m, 2H)；13C NMR(150 MHz, DMSO-d6),δ：169.1, 164.5, 160.0, 158.2, 152.7, 151.7, 151.4, 148.9, 147.5, 137.6, 136.2, 133.8, 130.7, 129.8, 129.4, 128.3, 128.3, 128.1, 127.9, 126.5, 125.9, 124.2, 122.4, 114.3, 109.8, 107.3, 103.4, 82.9;元素分析(C42H25N3O5計(jì)算值)，%:C 77.35(77.41), H 3.91(3.96), N 6.53(6.45)。

1.3 光譜性能測(cè)試

1.3.1 儲(chǔ)備液的配制

分別將探針PIF-1和PIF-2采用DMF配置成濃度為1.0×10-4mol/L的儲(chǔ)備液備用。陽(yáng)離子金屬采用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)配置成濃度5.0×10-2mol/L的緩沖溶液備用。探針PIF-1和PIF-2的測(cè)試濃度為1.0×10-5mol/L，采用HEPES緩沖稀釋。不同pH值的探針溶液用10%的NaOH溶液和5%HCl溶液調(diào)節(jié)。

1.3.2 測(cè)試方法

室溫條件下測(cè)試紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，石英比色皿為1 cm×1 cm×4 cm，探針PIF-1和PIF-2的激發(fā)波長(zhǎng)均為325 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度都為10.0 nm。

1.3.3 核磁滴定

采用DMSO-d6將探針PIF-1和PIF-2配成濃度為1.0×10-3mol/L的測(cè)試液，用微量濃HCl和NaOH固體調(diào)節(jié)溶液的pH值，充分搖勻后測(cè)試核磁共振氫譜。

1.3.4 水樣分析

將過濾漂浮物和沉淀等雜質(zhì)的自來水、齊齊哈爾勞動(dòng)湖水和嫩江水 (齊齊哈爾段) 作為待測(cè)水樣，采用HEPES溶液(pH=7.4) 稀釋100倍后加入熒光探針PIF-1和PIF-2(1.0×10-5mol/L)，測(cè)定樣品水樣的pH值。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針隨pH值變化的比色特征

探針PIF-1和PIF-2水溶液隨pH值變化的裸眼顏色變化如圖2所示。從圖2看出，隨著環(huán)境pH值的增加，探針PIF-1和PIF-2溶液顏色由淺黃色逐漸變?yōu)榱咙S色。這表明，探針溶液隨著環(huán)境pH值變化表現(xiàn)出裸眼顏色變化。即，探針PIF-1和PIF-2可以通過裸眼顏色變化響應(yīng)pH，作為pH比色探針應(yīng)用于pH值檢測(cè)。

圖2 PIF-1和PIF-2探針在日光下隨pH值變化的顏色

2.2 探針隨pH值變化的紫外-可見吸收光譜特征

在V(DMF)∶V(HEPES)=1∶9體系中，調(diào)節(jié)探針PIF-1和PIF-2溶液的pH值，其紫外-可見吸收光譜的變化情況見圖3所示。

從圖3看出，強(qiáng)酸性條件下，探針PIF-1溶液在450 nm左右表現(xiàn)為弱吸收。隨著溶液pH值的升高，450 nm處的吸收峰逐漸紅移，并在478 nm處出現(xiàn)新的吸收峰。當(dāng)溶液環(huán)境達(dá)到中性狀態(tài)時(shí) (pH=6.6)，吸收峰紅移至488 nm，吸收波長(zhǎng)覆蓋整個(gè)吸收帶。當(dāng)溶液pH值達(dá)到12.0時(shí)，吸收強(qiáng)度達(dá)到最大。探針PIF-1溶液紫外-可見吸收光譜隨pH值變化的現(xiàn)象，與探針PIF-1溶液所呈現(xiàn)的裸眼顏色變化的結(jié)果一致。隨著溶液pH值的變化，探針PIF-1溶液表現(xiàn)為不同的存在形式。在酸性條件下，探針PIF-1保持分子狀態(tài)，表現(xiàn)單吸收峰；隨著環(huán)境堿性的增強(qiáng)，探針酚羥基逐漸變?yōu)楸椒迂?fù)離子，此時(shí)溶液中存在分子及苯酚負(fù)離子兩種形式，吸收波長(zhǎng)紅移較??；隨著溶液中OH-濃度的增加，探針上的酚羥基完全被中和，分子狀態(tài)全部轉(zhuǎn)化為苯酚負(fù)離子狀態(tài)，探針PIF-1的吸收峰完全紅移到488 nm。

圖3 PIF-1和PIF-2探針在DMF-HEPES體系中的紫外-可見吸收光譜

探針PIF-2的紫外-可見吸收光譜進(jìn)一步驗(yàn)證了探針溶液隨pH變化的3種狀態(tài)：酸性條件下，分子狀態(tài)的探針PIF-2在448 nm有一個(gè)吸收峰；隨著溶液堿性的增加，探針PIF-2逐漸出現(xiàn)長(zhǎng)波吸收(480 nm)；pH值繼續(xù)增加，探針PIF-2的吸收峰紅移至490 nm，此時(shí)探針分子、苯酚負(fù)離子和氮負(fù)離子3種狀態(tài)同時(shí)存在時(shí)，表現(xiàn)為3個(gè)吸收帶，波長(zhǎng)分別為448、480和490 nm。強(qiáng)堿環(huán)境下，探針在490 nm處表現(xiàn)為單吸收。

以上結(jié)果表明，探針PIF-1和PIF-2隨pH值變化具有明顯的紫外-可見吸收光譜響應(yīng)特征。

2.3 探針隨pH值變化的熒光光譜特征

圖4是探針PIF-1的熒光發(fā)射光譜(λex=325 nm)。

圖4 探針PIF-1和PIF-2隨pH值變化的熒光光譜

由圖4可見，酸性條件下(pH=3.10)，探針PIF-1在518 nm處發(fā)射低熒光，熒光強(qiáng)度隨pH值增加明顯增強(qiáng)，當(dāng)pH值達(dá)到4.80時(shí)熒光強(qiáng)度較pH值為3.10時(shí)增加了20倍。這可能逐漸生成的苯酚負(fù)離子加強(qiáng)了相鄰分子的相互作用，分子旋轉(zhuǎn)受限，熒光強(qiáng)度增加。pH在5.80～9.30范圍內(nèi)，隨著pH值增加，探針PIF-1的發(fā)射強(qiáng)度逐漸增加，且發(fā)射波長(zhǎng)逐漸紅移，pH值達(dá)到9.30左右時(shí)，發(fā)射波長(zhǎng)紅移至530 nm，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大與pH值3.10時(shí)相比增強(qiáng)80倍。

由圖4還可見，pH值較低時(shí)，探針PIF-2幾乎不發(fā)射熒光。隨著pH值的增加，探針PIF-2在516 nm處的熒光緩慢增強(qiáng)。pH值超過6.50時(shí)，發(fā)射波長(zhǎng)逐漸紅移至530 nm，且熒光強(qiáng)度隨pH值增加而增強(qiáng)，強(qiáng)度最大值為pH值2.0時(shí)的50。上述結(jié)果說明了探針PIF-1和PIF-2隨pH值變化的熒光響應(yīng)能力。

在pH=2.0和pH =9.5的條件下，分別向探針PIF-1和PIF-2溶液中加入常見的金屬離子，考察干擾離子存在下兩個(gè)探針對(duì)pH值響應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5所示。酸性條件及金屬離子存在下，兩個(gè)探針均處于低熒光強(qiáng)度狀態(tài)；而在堿性條件下，兩個(gè)探針的高熒光強(qiáng)度并未受到其他金屬離子的影響。說明常見的金屬離子對(duì)兩個(gè)探針響應(yīng)pH值沒有干擾，同時(shí)表明兩個(gè)探針具有在復(fù)雜環(huán)境中監(jiān)測(cè)pH值的能力。

圖5 干擾離子存在下探針PIF-1和PIF-2的熒光強(qiáng)度

探針PIF-1和PIF-2最大熒光強(qiáng)度與pH值的擬合曲線如圖6所示。pH值在6.50～8.00范圍內(nèi)，探針PIF-1最大熒光強(qiáng)度(Imax)隨pH值變化滿足良好的線性關(guān)系，符合線性方程Y=133.032 6X-654.914 9，偏差R2為0.985 0。在pH值為5.40～7.30范圍內(nèi)，探針PIF-2的最大熒光(Imax)與pH值符合線性關(guān)系，線性方程為Y=345.525 6X-1 720.747 1，偏差R2為0.987 2。基于上述線性關(guān)系，根據(jù)公示pKa=pH±lg[(I-Imin)/(Imax-I)]計(jì)算得到探針PIF-1和PIF-2的pKa分別為7.00和6.30。上述結(jié)果說明，探針PIF-1和PIF-2可以對(duì)環(huán)境水樣中的pH值進(jìn)行定量檢測(cè)。

圖6 探針PIF-1和PIF-2最大熒光強(qiáng)度與pH值的擬合曲線

圖7是探針PIF-1和PIF-2在特定pH值條件下的熒光穩(wěn)定性。如圖7所示：探針PIF-1無論在中性還是堿性條件下均能在1 min之內(nèi)達(dá)到相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，并在測(cè)試時(shí)間內(nèi)(60 min)保持穩(wěn)定。中性和弱堿性條件下，探針PIF-2在20 min時(shí)才能達(dá)到穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度，在測(cè)試時(shí)間內(nèi)(60 min)保持穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度，響應(yīng)速度明顯低于探針PIF-1。這可能是由于探針PIF-2結(jié)構(gòu)中咪唑環(huán)氮原子上氫質(zhì)子的酸性較弱，對(duì)堿性條件響應(yīng)較慢，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度變化較慢。上述結(jié)果說明，探針PIF-1能夠快速響應(yīng)pH值，且探針PIF-1和PIF-2在各自的pH值響應(yīng)范圍內(nèi)具有良好的熒光穩(wěn)定性。

圖7 探針PIF-1和PIF-2在特定pH值條件下的熒光強(qiáng)度

2.4 響應(yīng)機(jī)理

采用核磁滴定驗(yàn)證了探針對(duì)pH值的響應(yīng)機(jī)制。以DMSO-d6為溶劑，分別采用濃HCl溶液和微量固體NaOH調(diào)節(jié)中性條件下探針PIF-1和PIF-2溶液pH值，觀察其核磁氫譜的變化，結(jié)果如圖8所示。

圖8 探針PIF-1和PIF-2的1H NMR譜

中性條件下，探針PIF-1在低場(chǎng)出現(xiàn)3個(gè)單峰，化學(xué)位移分別為14.70(H1)、10.20(H2)和9.53(H3)，分別歸屬為兩個(gè)羥基的氫質(zhì)子(H1和H2)和亞胺鍵(H—C—N)上的氫質(zhì)子(H3)。兩個(gè)羥基氫質(zhì)子的化學(xué)位移相差較大，可能是由于H1與亞胺氮原子形成分子內(nèi)氫鍵的緣故。酸性條件下，3個(gè)單峰的化學(xué)位移幾乎沒有發(fā)生任何變化。而弱堿性條件下，H1和H2的質(zhì)子峰完全消失。類似地，中性條件下，探針PIF-2在低場(chǎng)表現(xiàn)出4個(gè)單峰，化學(xué)位移值分別歸屬為14.87(H1)、13.55(H2)、10.22(H3) 和9.67(H4)，H1歸屬為咪唑環(huán)氮原子上的H質(zhì)子，H2和H3分別歸屬為兩個(gè)羥基的氫質(zhì)子，H4歸屬為亞胺鍵(H—C—N)上的氫質(zhì)子。同樣，酸性條件下的質(zhì)子峰的化學(xué)位移幾乎沒有變化。而在弱堿性條件下，咪唑氫和羥基氫完全消失。上述結(jié)果說明，弱堿性條件下探針PIF-1和PIF-2上咪唑和羥基的活潑氫被氫氧根中和，相應(yīng)的質(zhì)子峰消失。

在此基礎(chǔ)上，結(jié)合探針PIF-1和PIF-2隨pH變化的光譜特征，建立了探針隨pH值變化熒光響應(yīng)機(jī)制(圖9)。酸性條件下，熒光素上的羥基和亞胺氮原子形成分子內(nèi)氫鍵，激發(fā)態(tài)下表現(xiàn)為烯醇式和酮式之間的激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)特征，熒光光譜表現(xiàn)為雙發(fā)射，強(qiáng)度表現(xiàn)為低熒光；隨著堿性的增加，羥基氫質(zhì)子逐漸被中和，形成苯酚負(fù)離子，苯酚負(fù)離子的存在使探針的紫外吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移，裸眼顏色發(fā)生變化；羥基氫質(zhì)子和氮?dú)滟|(zhì)子完全被中和后，探針變成雙苯酚負(fù)離子和氮負(fù)離子狀態(tài)，紫外吸收波長(zhǎng)徹底紅移至長(zhǎng)波長(zhǎng)。在此過程中，ESIPT作用逐漸被破壞，熒光雙發(fā)射逐漸向單發(fā)射過渡，并伴隨熒光強(qiáng)度的逐漸增加。此外，苯酚負(fù)離子和氮負(fù)離子形成后，促進(jìn)了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)，對(duì)探針的熒光增強(qiáng)起到了一定的輔助作用。

圖9 探針PIF的響應(yīng)機(jī)制

3 結(jié) 論

基于ESIPT特征設(shè)計(jì)并合成了含活潑氫位點(diǎn)的菲并咪唑-熒光素pH熒光探針PIF-1和PIF-2。隨pH值的增加，探針溶液顏色由淺黃色變?yōu)榱咙S色，具有顯著的比色特征。熒光強(qiáng)度隨pH值增加顯著增強(qiáng)，并在一定pH值范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，說明探針PIF-1和PIF-2可實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境pH值的定性和定量檢測(cè)。此外，兩個(gè)探針均具有較好的熒光穩(wěn)定性，且探針PIF-1的熒光響應(yīng)速度明顯優(yōu)于探針PIF-2。核磁滴定結(jié)果證明了探針隨pH變化發(fā)生的脫質(zhì)子化過程。