陳 艷,王振紅*,羅專溪,黃明強(qiáng)

（1.閩南師范大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院,福建 漳州 363000；2.福建省現(xiàn)代分離分析科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 漳州 363000；3.華僑大學(xué)化工學(xué)院,福建 廈門 361021）

隨著工業(yè)化和城市化進(jìn)程的加快，水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象嚴(yán)重，與之伴隨的金屬及有機(jī)污染問題也受到普遍關(guān)注[1-2].原油泄漏、含油固體廢物的隨意棄置與含油污水的肆意排放等均可導(dǎo)致水體微量苯污染[3-7]，張曉慧等[8]研究表明水環(huán)境中苯含量為0.88%[4]，使其成為我國淡水水體的常見污染物.與此同時(shí)Wang等[9]調(diào)查發(fā)現(xiàn)加拿大近地表水和深層地下水中苯系物的濃度可分別達(dá)155 和2.6 μg/L，在1993 至2001年間丹麥近6 000口井水的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)苯占常見有機(jī)污染物的8.8%[10].

苯被我國和美國環(huán)保署列為優(yōu)先污染物[11-12]，其作為有毒物質(zhì)對生態(tài)環(huán)境和人體健康均具有較高危害[4,13].苯作為最簡單的芳香烴苯系物，在水中的最大溶解度為1.8 g/L[6]，對水資源污染風(fēng)險(xiǎn)大[14-15]，是我國水體優(yōu)先污染物之一.美國規(guī)定水中苯的最高允許限值為0.5 mg/L[16]，當(dāng)前我國規(guī)定石油化工行業(yè)、涂料工業(yè)、農(nóng)藥工業(yè)廢水中苯的排放限值為0.1 mg/L，排入地表水中苯的排放限值為0.01 mg/L，排入公共污水處理系統(tǒng)的排放限值為0.5 mg/L，而飲用水源中苯的限值為0.01 mg/L[7].

砷在環(huán)境中分布廣泛，亦是美國環(huán)保署優(yōu)先控制的金屬污染物[11].藍(lán)藻水華爆發(fā)與水體砷污染不僅影響水環(huán)境質(zhì)量而且制約水資源的開發(fā)利用.銅綠微囊藻作為藍(lán)藻水華優(yōu)勢藻種對砷具有高度耐受性，對有機(jī)污染如微量苯污染敏感且適應(yīng)性強(qiáng)[17]，為研究污染物對環(huán)境的影響及去除提供了良好的模型[5].

當(dāng)前我國湖泊水庫等淡水水體在遭受有機(jī)污染的同時(shí)面臨著重金屬的進(jìn)一步威脅.有機(jī)污染物如苯系物及含苯環(huán)類有機(jī)農(nóng)藥等的水生態(tài)效應(yīng)備受關(guān)注，研究表明低濃度的苯會抑制褐藻SMZ 的生長[5]，低濃度氟苯尼考促進(jìn)銅綠微囊藻的生長趨勢[18]，而硝基苯抑制塔瑪藻和巴夫藻的生長，促進(jìn)海鏈藻的增殖[19]，且苯環(huán)類除草劑對藻類的毒性作用顯著[20].與此同時(shí),水中包含微藻等各類微生物對砷的耐受性及在砷生物修復(fù)中的應(yīng)用等相關(guān)研究亦相對深入[21,24,30].而關(guān)于水體微量有機(jī)污染物如苯與砷共存時(shí)的生物效應(yīng)研究相對較少.水中微量苯存在時(shí)對水華藻類的毒性效應(yīng)是否會影響砷的生物適應(yīng)性與砷的生物累積？并由此影響水體的生態(tài)健康及微藻在砷污染修復(fù)中的應(yīng)用？基于此，文中重點(diǎn)探討了水中微量苯存在時(shí)銅綠微囊藻對砷的適應(yīng)性及藻毒素釋放和藻體砷累積特征，以期全面了解和評估苯與砷聯(lián)合暴露下的水生態(tài)環(huán)境效應(yīng)，并為富營養(yǎng)化水體藍(lán)藻水華爆發(fā)的科學(xué)管控及水體砷生物去除提供一定技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 藻種來源及培養(yǎng)

銅綠微囊藻FACHB-905 購自中國科學(xué)院水生物研究所國家淡水藻種庫.用BG11 培養(yǎng)基于溫度為(25±1)℃、光暗比為16 h∶8 h、光強(qiáng)為3 000 lx 的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天振搖3 次.所有工作均在超凈工作臺進(jìn)行.

1.2 微量苯存在時(shí)銅綠微囊藻對砷的適應(yīng)性

參照工業(yè)廢水中苯的排放限值，確定苯的試驗(yàn)濃度為0.1 mg/L，探究其與0～1 000.0 mg/L 的不同濃度梯度As(V)（砷酸鈉）共存時(shí)銅綠微囊藻對As(V)的耐受性，各處理均設(shè)3 個(gè)平行.銅綠微囊藻的初始藻密度為1×107cells/mL，并于第0、24、48、72、96 h分別取樣觀測細(xì)胞光密度（OD680）、葉綠素a（Chl-a）和實(shí)際光合產(chǎn)率（Yield）值及96 h 上清液中（過0.45 μm 一次性醋酸纖維素濾膜）的總有機(jī)碳（TOC）和藻毒素（MCs）濃度.

1.3 微量苯對銅綠微囊藻砷累積與MCs釋放的影響

設(shè)定銅綠微囊藻藻液中初始As(V)濃度分別為0、0.1 和1.0 mg/L，然后分別向其添加0.1 mg/L 的微量苯，同時(shí)將不添加苯（0 mg/L）的處理作為對照，初始藻密度約1×107cells/mL，之后將其放置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行為期96 h 的培養(yǎng)（以上處理均設(shè)3 個(gè)平行）.將培養(yǎng)后的藻液經(jīng)離心分離并用超純水清洗后收集藻體，經(jīng)冷凍干燥后測定藻體中的總砷（TAs）含量，同時(shí)上清液過0.45 μm濾膜后分別測定其TOC和MCs濃度.

1.4 測定指標(biāo)與方法

藻細(xì)胞密度以O(shè)D680也即在680 nm 下的光密度值表示.葉綠素a（Chl-a）和實(shí)際光能轉(zhuǎn)化率（Yield）用高級浮游植物熒光儀（PHYTO-PAM，德國Walz）將新鮮藻液暗適應(yīng)10 min 后進(jìn)行測定.總有機(jī)碳（TOC）采用島津TOC分析儀（TOCV-CPH，日本島津）測定.

介質(zhì)中釋出的MCs含量，采用高效液相色譜儀（Agilent 1200），將樣品過0.45 μm濾膜后進(jìn)行測定，具體參考DB42/T 274-2003和chang等[22-23]的方法，流動相為含0.1%三氟乙酸與甲醇，體積比為35∶65，流速1 mL/min，25 ℃時(shí)于波長238 nm 測定.藻體總砷參照王振紅等的方法進(jìn)行處理和分析[24]并使用ICP-MS（Agilent 7800）進(jìn)行測定.

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

藻細(xì)胞比生長率μ用公式(1)計(jì)算[25]：

其中，μ為細(xì)胞比生長率/d；ct和c0分別代表時(shí)間t和初始時(shí)的光密度；t為As(V)添加下的暴露時(shí)間/d.抑制率I用公式(2)計(jì)算[26]：

其中，I為細(xì)胞響應(yīng)值的抑制率/%.使用GraphPad Prism 8.0 擬合計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）值[27]，并進(jìn)行作圖.擬合曲線：

其中，CAs為As(V)的濃度/(mg/L)；Bottom>0；Top< 100.數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件IBM SPSS Statistics 23進(jìn)行Pearson相關(guān)分析和單因素方差分析（ANOVA）.

2 結(jié)果與討論

2.1 微量苯存在時(shí)銅綠微囊藻對砷的適應(yīng)性

微量苯（0.1 mg/L）存在時(shí)銅綠微囊藻在不同As(V)濃度下的OD680隨時(shí)間的變化如圖1a所示.可以看出：除1 000.0 mg/L As(V)濃度下的OD680與其他各組存在顯著差異（P<0.01）維持在0.10 并略有降低，其平均比生長率μ為(-0.06±0.02)d；0～100.0 mg/L As(V)濃度下的OD680均隨時(shí)間線性上升，96 h 內(nèi)藻細(xì)胞增殖無明顯差異（P>0.05），其平均比生長率μ為(0.57±0.02)d.這與龔艷等[28]研究中發(fā)現(xiàn)的10-3mol·L-1也即75 mg/L 的As(V)對銅綠微囊藻的生長無顯著抑制相一致，說明0.1 mg/L 苯的存在沒有顯著影響銅綠微囊藻對As(V)的適應(yīng)性，該藻在低As(V)（≤100.0 mg/L）環(huán)境下增殖正常.

圖1 微量苯存在時(shí)不同As(V)濃度下銅綠微囊OD680、Chl-a、Yield值隨時(shí)間變化Fig.1 Changes in algal cell optical density(OD680),actual photosynthetic Yield(Yield)and Chlorophyll a(Chl-a)of M.aeruginosa with time in the presence of trace benzene at different As(V)concentrations

微量苯（0.1 mg/L）存在時(shí)銅綠微囊藻在不同As(V)濃度下的Chl-a 隨時(shí)間的變化如圖1b 所示.可以看出：僅1 000.0 mg/L As(V)濃度下的Chl-a 隨時(shí)間下降，表現(xiàn)出與其它濃度間的顯著差異（P<0.01），0～100.0 mg/L As(V)濃度下的Chl-a均隨時(shí)間線性上升，其平均比生長率μ為(0.76±0.13)d，各濃度間無顯著差異（P>0.05），表現(xiàn)出較高的生長潛能，說明低As(V)（≤100.0 mg/L）環(huán)境下微量苯的存在不會顯著降低銅綠微囊藻的Chl-a 含量.這與王靜等[29]研究得出的低濃度的As(V)可提高銅綠微囊藻細(xì)胞Chl-a 的含量，高濃度的As(V)會對微藻產(chǎn)生毒性，造成Chl-a含量顯著下降相一致.

光系統(tǒng)Ⅱ（PS）的最大光量子產(chǎn)率（Yield）可以衡量藻體光合活性，在非脅迫條件下Yield 變化很小，但在脅迫條件下，Yield變化較大，是反映微藻生長環(huán)境良好與否的一個(gè)非常重要的參數(shù)[29].微量苯（0.1 mg/L）存在時(shí)銅綠微囊藻在不同As(V)濃度下的Yield隨時(shí)間的變化如圖1c所示.可以看出：除1 000.0 mg/LAs(V)濃度下的Yield相對較低為(0.17±0.02)，表現(xiàn)出與其它濃度間的顯著差異（P<0.01）外，0～100.0 mg/L As(V)濃度下的Yield 均相對較高為(0.52±0.04)，各濃度間無顯著差異（P>0.05）.這說明0.1 mg/L 微量苯存在時(shí)該藻細(xì)胞的Yield對低As(V)（≤100.0 mg/L）環(huán)境具有較好的適應(yīng)性.

由微量苯環(huán)境下As(V)濃度對銅綠微囊藻的OD680、Chl-a和Yield的Pearson相關(guān)系數(shù)可知，As(V)濃度與OD680、Chl-a和Yield均呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.492，-0.362，-0.821（P<0.01）；OD680和Chl-a之間及其與Yield 間均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.932，0.484，0.337（P<0.01）.這說明微量苯存在時(shí)Yield 不僅可間接反映該藻在不同濃度As(V)環(huán)境下的生長，而且其與OD680和Chl-a 均可響應(yīng)As(V)的脅迫，As(V)濃度的增加可顯著抑制銅綠微囊藻OD680的增殖及Chl-a合成和實(shí)際光能轉(zhuǎn)化率.

2.2 砷酸鹽對藻的生長脅迫響應(yīng)

為確定0.1 mg/L 苯存在下As(V)對銅綠微囊藻生長的脅迫特征，測定了不同As(V)濃度下銅綠微囊藻的96 h 生長響應(yīng)，并對結(jié)果進(jìn)行非線性回歸—?jiǎng)┝俊憫?yīng)曲線擬合以得出其96 h IC50（圖2）.由OD680、Chl-a、Yield分別得出的96 h IC50如表1所示，結(jié)果表明微量苯存在下As(V)對銅綠微囊藻的毒性數(shù)據(jù)能夠用該響應(yīng)曲線很好地進(jìn)行擬合.由OD680、Chl-a、Yield三個(gè)指標(biāo)的方差分析得出銅綠微囊藻在不同砷濃度下的96 h無可觀測效應(yīng)濃度（NOEC）和最低可觀測效應(yīng)濃度（LOEC）一致，分別為100.0，1 000.0 mg/L.這與先前研究得出的在不含苯時(shí)由OD、Chl-a 和Yield 分別計(jì)算出的As(V)對該藻的96 h NOEC 和LOEC 分別為105和106μg/L 結(jié)論一致[30]，說明0.1 mg/L 苯的存在不影響該藻對As(V)的NOEC 和LOEC.最大允許毒物濃度（MATC）依據(jù)MATC=得出由OD680、Chl-a、Yield 所指示的As(V)的MATC 為316.23 mg/L.

圖2 0.1 mg/L苯下As(V)對銅綠微囊藻96 h的生長脅迫及非線性回歸-劑量-響應(yīng)曲線擬合Fig.2 Nonlinear regression dose-response curve fitting of M.aeruginosaunder growth stress of As(V)at 0.1 mg/L benzene for 96 h

對比有無微量苯存在時(shí)As(V)對銅綠微囊藻的毒性效應(yīng)（表1）數(shù)據(jù)可以得出：不含苯（0 mg/L）時(shí)As(V)對銅綠微囊藻的96 h EC50以O(shè)D680為最高，其次是Chl-a，Yield 最為敏感，較Chl-a 和OD680要低近3 個(gè)數(shù)量級[29].而0.1 mg/L 苯環(huán)境下As(V)對銅綠微囊藻的96 h IC50表現(xiàn)為：Chl-a

表1 有無苯存在時(shí)銅綠微囊藻由各生長指標(biāo)得出的As(V)的96 h IC50(mg/L)Tab.1 96 h IC50(mg/L)of M.aeruginosa As(V)obtained by growth indexes in the presence and absence of benzene

2.3 微量苯與砷共存時(shí)介質(zhì)中的TOC和MCs

微量苯（0.1 mg/L）存在時(shí)銅綠微囊藻在不同As(V)濃度經(jīng)96 h培養(yǎng)后其介質(zhì)中TOC和MCs的含量如圖3所示(圖中字母表示不同處理間的差異顯著性，P<0.05).0.1 mg/L苯存在時(shí)隨As(V)濃度的增加，介質(zhì)中TOC 呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢（圖3a），且以5.0 mg/L 時(shí)的TOC 含量最高，為(0.35±0.03)mg/L，與0.5，1.0，10.0，100.0，1 000.0 mg/L的As(V)處理組無顯著差異（P>0.05）.無砷環(huán)境下0.1 mg/L苯的處理組中TOC含量最低，為(0.18±0.03)mg/L，As(V)的添加促進(jìn)了微量苯環(huán)境中銅綠微囊藻向介質(zhì)中TOC的釋出，說明銅綠微囊藻可通過向外界環(huán)境釋放較多的有機(jī)物來緩解As(V)的毒性，這與Zhang等[32]研究的小球藻胞外高分子物質(zhì)（EPS）能減少細(xì)胞內(nèi)砷吸收的結(jié)論相一致.

As(V)濃度為1.0 和1 000.0 mg/L 時(shí)MCs 含量最低，均值為(0.38±0.01)mg/L，其余As(V)濃度時(shí)的MCs含量均呈降低趨勢（圖3b），說明1.0 mg/L As(V)時(shí)MCs的釋出最少，而As(V)濃度為0和100.0 mg/L時(shí)MCs 釋出最多，均值為(0.62±0.02)mg/L，說明這兩種環(huán)境下有利于MCs 的釋出.微量苯存在時(shí)介質(zhì)中MCs含量與As(V)濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.439，與OD680呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為0.458；與Chl-a、Yield 均呈非顯著正相關(guān)（P>0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.341 和0.366；與TOC 呈不顯著負(fù)相關(guān)（P>0.05），相關(guān)系數(shù)為0.399，說明藻細(xì)胞的增殖會產(chǎn)生較多的MCs，而介質(zhì)As(V)濃度和溶解性有機(jī)物的增高一定程度上表現(xiàn)為降低MCs的釋出，這與劉烜瑜等[33]研究得出銅綠微囊藻分泌的EPS可以減少溶液中藻毒素含量的結(jié)論一致，可能的原因是溶解性有機(jī)物（DOM）能介導(dǎo)間接光降解去除地表水中MCs[34]，與研究結(jié)果有機(jī)物含量的增高能減少介質(zhì)中MCs的含量一致.

圖3 微量苯(0.1 mg/L)與不同As(V)濃度共存時(shí)銅綠微囊藻培養(yǎng)介質(zhì)中TOC和MCs的變化Fig.3 Changes of TOC and Microcystins in M.aeruginosa culture medium when trace benzene(0.1 mg/L)coexisted with different As(V)concentrations

2.4 微量苯對銅綠微囊藻砷的累積與MCs釋放的影響

2.4.1 有無微量苯存在時(shí)不同As(V)環(huán)境下介質(zhì)中的TOC和MCs

有無微量苯存在時(shí)銅綠微囊藻在0.1和1.0 mg/LAs(V)環(huán)境下經(jīng)96 h暴露后介質(zhì)中TOC和MCs含量如圖4a 所示(圖中字母表示不同處理間的差異顯著性，P<0.05).可以看出1.0 mg/L As(V)介質(zhì)中TOC 含量最高，為(0.57±0.06)mg/L，其含量高于不含苯與As(V)的正常培養(yǎng)組中的TOC，As(V)的存在一定程度上促進(jìn)了微量苯環(huán)境下介質(zhì)中TOC 的釋出，說明該藻可以通過EPS 的釋放來達(dá)到對高濃度As(V)的解毒[32,35]；0.1 mg/L 苯環(huán)境中的TOC 含量最低，為(0.18±0.03)mg/L，說明微量苯的存在可顯著減少藻體胞外有機(jī)物的釋出，其進(jìn)一步表現(xiàn)為降低含As(V)環(huán)境下藻體向介質(zhì)中釋放的TOC 含量，并削弱了0.1和1.0 mg/L As(V)環(huán)境下介質(zhì)中TOC含量間的顯著差異，一方面可能是由于苯作為有機(jī)物在環(huán)境中的存在限制了同類胞外有機(jī)物的釋出，另一方面苯作為疏水性有機(jī)物通過增強(qiáng)對胞外有機(jī)物的生物吸附作用進(jìn)而使介質(zhì)中TOC 的含量降低，與先前Wang等[36]人研究得出的天然有機(jī)物（NOM）通過疏水相互作用增強(qiáng)與銅綠微囊藻EPS之間的生物吸附結(jié)論一致.

由圖4b MCs 的變化可以看出正常培養(yǎng)的銅綠微囊藻介質(zhì)中MCs 的含量與0.1 mg/L 苯環(huán)境中的MCs含量最高且無顯著差異（P>0.05），為(0.62±0.03)mg/L；微量苯與1.0 mg/L As(V)共存時(shí)介質(zhì)中MCs的含量最低為(0.38±0.01)mg/L，表現(xiàn)出與其他處理組的顯著差異（P<0.05）.As(V)的存在可顯著降低微量苯（1.0 mg/L）環(huán)境中藻毒素的釋出含量，說明As(V)在一定程度可緩解微量苯污染時(shí)藍(lán)藻水華的藻毒素釋出風(fēng)險(xiǎn)，微量苯的存在無顯著改變0.1 mg/L As(V)環(huán)境中MCs的釋出，但降低了1.0 mg/L As(V)環(huán)境中MCs的含量.As(V)的存在可顯著降低微量苯（1.0 mg/L）環(huán)境下MCs的釋出.MCs是環(huán)七肽化合物，需要通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的運(yùn)輸才能通過細(xì)胞膜[37]，有機(jī)物分子會影響微生物的生物膜透過性[38]，故微量苯的添加顯著減少了MCs的釋放.

圖4 有無微量苯存在時(shí)銅綠微囊藻96 h上清液TOC和MCs的變化Fig.4 Changes of TOC and Microcystins in M.aeruginosa 96 h supernatant with or without trace benzene

2.4.2 藻體砷累積

有無微量苯存在時(shí)銅綠微囊藻在0.1 和1.0 mg/L As(V)環(huán)境下經(jīng)96 h 暴露后藻體內(nèi)的TAs含量如圖5所示(圖中字母表示不同處理間的差異顯著性，P<0.05)，無微量苯存在時(shí)藻體TAs含量分別為(40.70±1.46)和(270.80±51.37) μg/g，0.1 mg/L 苯的存在一定程度上促進(jìn)了藻體TAs 含量，使其TAs 含量分別增加46.97%和35.24%，微量苯的存在顯著提升了銅綠微囊藻對這兩種濃度下As(V)的累積（P<0.05）.這可能是由于微量苯的存在使得介質(zhì)中溶解性有機(jī)物（DOM）含量降低，進(jìn)而減少了As-DOM 二元配合物的形成，提高了As(V)的游離度，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞對As(V)的吸收.研究結(jié)果與Zhang等[32]和Naveed等[35]研究得出EPS 的分泌可有效促進(jìn)砷的表面吸附，限制其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的吸收相一致.盡管不同于徐西蒙等研究認(rèn)為的有機(jī)物分子會影響微生物的生物膜透過性，阻礙金屬離子進(jìn)入生物膜，繼而改變其遷移方式[38]，具體分析可能是受苯作為疏水性有機(jī)物能與藻體釋出的EPS相結(jié)合進(jìn)而產(chǎn)生不同效應(yīng)[35].

圖5 有無微量苯存在時(shí)銅綠微囊藻細(xì)胞總砷含量Fig.5 Total arsenic content in M.aeruginosa cells with and without trace benzene

3 結(jié)論

微量苯（0.1 mg/L）存在時(shí)對As(V)濃度低于100 mg/L 時(shí)銅綠微囊藻的增殖和光合作用無顯著影響，但顯著增強(qiáng)了藻體Chl-a 和OD680對As(V)的敏感性，使其IC50顯著降低，Chl-a 成為反應(yīng)銅綠微囊藻對As(V)適應(yīng)性的敏感性響應(yīng)指標(biāo).與無苯環(huán)境下銅綠微囊藻經(jīng)不同濃度As(V)處理相比較，微量苯的存在可顯著促進(jìn)銅綠微囊藻對As(V)的累積，同時(shí)減少了含As(V)環(huán)境下藻體向介質(zhì)中TOC的釋放，降低了環(huán)境中MCs的釋出風(fēng)險(xiǎn).與不含As(V)時(shí)微量苯環(huán)境下銅綠微囊藻向介質(zhì)中釋出的TOC與MCs相比As(V)的存在一定程度上可促進(jìn)微量苯環(huán)境下介質(zhì)中TOC釋出，并顯著降低該環(huán)境下MCs的釋放風(fēng)險(xiǎn).研究結(jié)果對深入了解微量苯污染環(huán)境下含砷水體的水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)及微藻生物處理技術(shù)的應(yīng)用具有重要意義.