羅淑芳 ，黃博寧 ，何廣銘 ，桂蜀華 ，詹雅嫻 ，張威鵬 ，林寶琴 ＊＊

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 廣州 510405；2.深圳市市場監(jiān)督管理局許可審查中心 深圳 518071；3.廣東一方制藥有限公司 佛山 528244；4.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院 廣州 510006）

深靜脈血栓形成（Deep Vein Thrombosis，DVT）在人群中發(fā)病率高達1.52‰，是心血管疾病死亡的主要原因之一[1-2]。目前抗凝和溶栓為DVT的基本治療方法，可以使用的西藥主要有華法林、肝素、尿激酶和利伐沙班，但這些藥物均有自發(fā)性出血的嚴重不良反應[3-4]。絡脈血瘀濕阻是DVT的主要病機，在中醫(yī)屬“脈痹”、“血瘀證”范疇，因此應以活血化瘀為主要治法[5-6]。中藥具有安全、有效、副作用小的特點，在預防和治療DVT中具有獨特優(yōu)勢。

土鱉蟲又名土鱉、土元、地烏龜，最早記載于《神農本草經》中，《金匱要略》和《本草綱目》等經典著作中均有記述，為鱉蠊科昆蟲冀地瞥Steleophagaplancyi（Boleny）或地鱉（Eupolyphaga sinensisWalker，ESW）的雌蟲干燥體，是中醫(yī)臨床常用的活血化瘀類中藥。其性味咸寒、有小毒、歸肝經。2020年版《中華人民共和國藥典》記載道土鱉蟲破血逐瘀，續(xù)筋接骨，用于跌打損傷、筋傷骨折、血瘀經閉、產后瘀阻腹痛、癥瘕痞塊[7]。

現(xiàn)代藥理研究表明，土鱉蟲具有抗凝血、溶解血栓、抗腫瘤、調節(jié)血脂、促進骨骼愈合、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗缺血缺氧及保護血管內皮細胞等廣泛的藥理作用[8-12]。前人對土鱉蟲抗血栓的研究多集中于土鱉蟲對體外血栓的影響[13-15]。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)土鱉蟲具有纖溶酶原和纖溶酶原激活物質活性的蛋白質具有體外抗血栓作用。黎子蔚等[14]發(fā)現(xiàn)地鱉纖溶活性蛋白具有較強的體外溶栓活性。郎杰等[15]發(fā)現(xiàn)土鱉蟲對體外血栓的形成具有抑制作用。而土鱉蟲的體內抗栓作用及機制研究則少有報道。因此，我們采用狹窄法誘導SD大鼠下腔靜脈血栓形成模型，給藥土鱉蟲以考察其抗體內深靜脈血栓形成的機制。

1 材料

1.1 動物

SPF（Specific Pathogen Free，SPF）級 SD 大鼠，雄性，體質量250-300 g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（粵）2018-0034。

1.2 藥物及試劑

土鱉蟲配方顆粒（廣東一方制藥有限公司生產，批號：8031823，生藥來源：Eupolyphaga sinensisWalker的雌蟲干燥體，提取率：0.22 g顆粒/g生藥，其主要化學成分見圖1）；生理鹽水（佛山雙鶴藥業(yè)有限公司，批號：140911A）；戊巴比妥鈉（德國默克公司，批號：110320）；注射用頭孢曲松鈉（深圳立健藥業(yè)有限公司，批號：14081301）；二磷酸腺苷（ADP，北京雷根生物技術有限公司，批號：0605A18）；肝素鈉（成都市海通藥業(yè)有限公司，批號：180109）；4%多聚甲醛（天津市福晨化學試劑廠，批號：20110211）；硫酸氫氯吡格雷（深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司，批號：22140201）；大鼠白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（美國eBioscience公司，批號：145535023）；大鼠腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α） ELISA試劑盒（聯(lián)科生物科技有限公司，批號：238280121）；山羊血清（康為世紀生物科技有限公司，貨號：CW0130S）；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美國Sigma公司，貨號：D9542）；免疫組化試劑盒（康維世紀有限公司，貨號：CW2069S）；抗TF抗體（英國Abcam公司，貨號：ab151748）；抗CD68抗體（英國 Abcam 公司，貨號：ab31630）；HRP-linked antirabbit IgG（美國CST公司，貨號：7074）；HRP-linked anti-mouse IgG（美國 CST公司，貨號：7076）；Anti-Ly6g 抗體（英國Abcam公司，貨號：ab25024）；抗熒光淬滅劑（碧云天生物科技，貨號：P0126）；Triton-X-100（美國AMRESCO公司，貨號：T0694-100）。

圖1 土鱉蟲配方顆粒特征圖譜

1.3 主要儀器

GXG電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠，型號：JJ3000）；萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司，型號：EL204）；離心機（美國賽洛捷克公司，型號：D3024R）；血小板聚集儀（北京普利生公司，型號：LBY-NJ2）；全自動血凝分析儀（希森美康醫(yī)用電子上海有限公司，型號：SYSMEX CA-510）；全自動血液流變分析儀（北京普利生公司，型號：LBY-N6B）；全自動血液分析儀（日本希森美康醫(yī)用電子有限公司，型號：SYSMEX XT-2000iv）；全波長酶標儀（Thermo Fisher scientific公司，型號：Multiskan FC）；激光共聚焦顯微鏡（上?？柌趟竟芾碛邢薰荆吞枺篖SM800）；正置生物顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：BX53）。

2 方法

2.1 模型制備

手術前各組動物禁食12 h。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（3%，1.2 mL·kg-1，36 mg·kg-1）麻醉。麻醉起效后，腹部剃毛，大鼠仰臥位放置在手術操作臺上，固定四肢，腹部碘酒消毒。沿腹中線劃開腹腔3-4 cm，朝手術者右側方向輕微撥開腹腔臟器，確認左腎靜脈下方與下腔靜脈交界處為結扎點，見圖2。用玻璃分針仔細游離腹主動脈和下腔靜脈，在下腔靜脈下方穿過5-0真絲縫合線，另取0.35 mm×50 mm規(guī)格針灸針與下腔靜脈主干并排，縫合線將下腔靜脈與針灸針一并扎緊，然后謹慎抽出并排的針，完成造模[16]。確認大鼠呼吸平穩(wěn)，將大鼠腹腔臟器復位，滴加約0.5 mL生理鹽水補充術后缺水。3-0真絲縫合線分別縫合皮下組織和皮膚，每層縫合的創(chuàng)口上均灑少許注射用頭孢曲松鈉粉末預防術后感染。

2.2 分組及給藥

將動物分為正常組（Normal）、假手術組（Sham）、模型組（Model）、土鱉蟲低劑量組（0.52 g ESW·kg-1）、土鱉蟲高劑量組（1.04 g ESW·kg-1）、肝素組（HEP）、氯吡格雷組（CLP），共7個組。正常組、假手術組、模型組、土鱉蟲低、高劑量組均按給藥體積10 mL·kg-1·d-1灌胃，正常組和模型組給予蒸餾水。土鱉蟲低和高劑量組給藥劑量分別為0.52和1.04 g生藥·kg-1·d-1，連續(xù)給藥7天，于第6天造模，造模后1 h給藥，第7天給藥后1.5 h取材。肝素鈉組造模后1 h及24 h尾靜脈注射肝素鈉，給藥劑量為200 U·kg-1·d-1，給藥體積為1 mL·kg-1·d-1，末次給藥后1.5 h取材。氯吡格雷組造模前2 h及造模后24 h灌胃給予氯吡格雷，給藥劑量為 25 mg·kg-1·d-1，給藥體積為 10 mL·kg-1·d-1，末次給藥后1.5 h取材。

2.3 血液樣本采集

末次給藥1.5 h后，戊巴比妥麻醉大鼠（3%，1.2 mL·kg-1），開腹，分離腹主動脈，用真空采血管取血。

2.4 檢測指標

2.4.1 血栓濕重

末次給藥1.5 h后，分離下腔靜脈（含血栓），用濾紙吸干殘留血液，分析天平精密稱量質量（mg）。假手術組取血管1.5 cm左右；血栓超過1 cm的切取實際長度；血栓不夠1 cm的切取1 cm。稱重后，將血栓組織置于-80℃冰箱冷凍保存以待檢測。

2.4.2 血小板聚集率的檢測

取3.2%枸櫞酸鈉真空抗凝管收集的抗凝血于1000 r·min-1，25℃下離心10 min，取上清，即得富血小板血漿（Platelet Rich Plasma，PRP）。以生理鹽水作為實驗用貧血小板血漿（Platelet Poor Plasma，PPP）。取200 μL PPP和PRP分別加入到比色皿中，37℃溫育3 min后檢測：先放入PPP調零，然后取出PPP，放入待檢的PRP，加入磁棒攪拌，加入50 μL 10 μmol·L-1ADP誘導血小板聚集，記錄血小板最大聚集率。

2.4.3 凝血功能指標、全血粘度、血常規(guī)的檢測

取3.2%枸櫞酸鈉抗凝血于1400 r·min-1，4℃下離心10 min，將分裝好的血漿用全自動血凝分析儀檢測活化部分凝血活酶時間（Activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原時間（Prothrombin time，PT）。取3.2%枸櫞酸鈉抗凝血用全自動血液流變分析儀檢測全血粘度，取乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）真空抗凝管收集的抗凝血用全自動血液分析儀檢測血常規(guī)。

圖2 下腔靜脈狹窄法誘導DVT模型的形態(tài)學圖像

圖3 土鱉蟲對血栓濕重的影響（，n=10）

圖4 各組下腔靜脈（含血栓）的剖解圖

圖5 土鱉蟲對ADP誘導的血小板聚集率的影響（，n=10）

2.4.4 血清中炎癥因子的檢測

用不含抗凝劑或促凝劑的真空采血管收集血液樣本，于1100 r·min-1，4℃下離心10 min，獲得血清，用ELISA方法分析血清中IL-1β和TNF-α水平。

2.4.5 組織病理學分析

取一部分靜脈壁（含血栓）于4%多聚甲醛中，置于4℃冰箱充分固定48 h以上，常規(guī)石蠟包埋后，進行HE病理切片染色，高倍鏡下（400倍）觀察靜脈壁及血栓中的炎性細胞浸潤程度。并選取5個視野，計數(shù)靜脈壁及血栓內的炎性細胞數(shù)量。

2.4.6 免疫組織化學分析

取一部分靜脈壁（含血栓）以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后，進行組織病理學切片（4 μm）。切片經脫蠟、水化、熱修復后，37℃下加入10%山羊血清封閉30 min，棄去血清，分別加入抗TF的抗體（1∶200）和抗CD68的抗體（1∶200），4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（Phosphate-Buffered Saline，PBS）洗片3次后滴加辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育1 h，PBS洗片3次。使用二氨基聯(lián)苯胺法（3,3'-diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒顯色，顯色后以蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.4.7 免疫熒光分析

從-80℃冰箱中取出靜脈壁（含血栓），冰凍切片（4 μm）于黏性載玻片上，用-20℃預冷丙酮溶液固定15 min，磷酸鹽吐溫緩沖液（Phosphate-Buffered Saline with Tween 20，PBST）洗片3次。室溫下，切片置于1%Triton X-100通透20 min，PBST洗片3次后于37℃下加入10%山羊血清封閉60 min，棄去血清，加入抗Ly6g 的 抗 體（Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）（1∶1000）于37℃下孵育60 min，PBST洗片3次，并用DAPI復染5 min，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并采集熒光圖像。

2.5 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計產品與服務解決方案（Statistical Product and Service Solutions，SPSS）20.0 統(tǒng)計軟件處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，兩兩比較用t檢驗，多組比較用單因素方差分析進行統(tǒng)計學比較。

3 結果

3.1 土鱉蟲對血栓栓重的影響

結果如圖3和圖4所示。正常組和假手術組均沒有血栓形成。與假手術組相比，模型組大鼠栓重顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，土鱉蟲劑量依賴性地降低栓重，高劑量組的血栓抑制率達58.20%（P＜0.01）。

圖6 土鱉蟲對APTT和PT的影響（，n=10）

表1 土鱉蟲對全血粘度的影響（，n=10）

表1 土鱉蟲對全血粘度的影響（，n=10）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與土鱉蟲低劑量組比較， bP＜0.01。

5（s-1）16.54±2.65 16.19±2.75 12.48±2.47**12.69±1.76 16.10±1.68#b 13.73±1.94 14.46±1.92 Groups Normal Sham Model 0.52 g ESW·kg-1 1.04 g ESW·kg-1 HEP CLP Middle share（mPa.s）Low share（mPa.s）High share （mPa.s）200（s-1）5.22±0.38 5.10±0.49 4.28±0.59**4.01±0.26 4.67±0.40b 4.18±0.44 4.25±0.43 150（s-1）5.52±0.39 5.36±0.47 4.23±0.60**4.02±0.23 4.87±0.42#b 4.37±0.46 4.40±0.47 50（s-1）7.14±0.63 6.86±0.88 5.54±0.90**5.07±0.42 6.25±0.59b 5.44±0.69 5.61±0.71 30（s-1）8.37±0.76 8.16±0.94 6.11±1.05**5.92±0.52 7.27±0.67#b 6.33±0.81 6.58±0.82

表2 土鱉蟲對血細胞數(shù)量的影響（，n=10）

表2 土鱉蟲對血細胞數(shù)量的影響（，n=10）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與土鱉蟲低劑量組比較，bP＜0.01。

PLT（109·L-1）1130.14±130.44 999.74±140.42 873.54±183.01 771.20±195.19 1062.50±117.48#b 958.17±161.28 887.00±180.77 Groups Normal Sham Model 0.52 g ESW/kg 1.04 g ESW/kg HEP CLP WBC（109·L-1）2.40±1.19 3.95±1.14 4.32±2.17 3.74±1.27 4.30±0.76 6.36±4.34 2.29±1.07#RBC（1012·L-1）7.77±0.64 7.33±0.60 6.34±0.53**6.39±0.40 6.71±0.52 5.93±0.42 6.21±0.32 HGB（g·L-1）144.43±12.64 133.63±7.77 119.89±7.89**122.11±3.86 125.83±9.54 112.33±6.53#115.33±5.47

圖7 土鱉蟲對血清中IL-1β和TNF-α水平的影響（，n=10）

圖8 土鱉蟲對TF蛋白在大鼠模型的血栓和靜脈壁表達水平的影響（，n=10）

3.2 土鱉蟲對血小板聚集率的影響

正常組、假手術組和模型組的ADP誘導的血小板最大聚集率沒有差異。與模型組比，氯吡格雷組血小板聚集率顯著降低（P＜0.01），但土鱉蟲對血小板聚集率沒有影響。見圖5。

3.3 土鱉蟲對APTT和PT的影響

結果如圖6所示，與模型組相比，肝素組APTT和PT顯著升高（P＜0.01），但是土鱉蟲對APTT和PT沒有影響。

3.4 土鱉蟲對全血粘度的影響

結果如表1所示，與假手術組相比，模型組大鼠全血粘度均有降低。與模型組相比，土鱉蟲高劑量組中切（150 s-1）、低切（30 s-1）和低切（5 s-1）有顯著升高（P＜0.05）。

3.5 土鱉蟲對血細胞數(shù)量的影響

結果如表2所示，與假手術組相比，模型組紅細胞（Red blood cell，RBC）和血紅蛋白（Hemoglobin，HGB）數(shù)量均減少（P＜0.01）。與模型組相比，土鱉蟲高劑量組血小板（Platelet，PLT）數(shù)量升高了21.63%（P＜0.05）。

3.6 土鱉蟲對血清IL-1β和TNF-α水平的影響

結果如圖7表示，與假手術組相比，模型組大鼠血清中IL-1β（P＜0.05）和TNF-α（P＜0.01）水平均顯著升高。低、高劑量土鱉蟲均顯著降低IL-1β和TNF-α水平。與模型組相比，土鱉蟲低劑量組血清IL-1β和TNF-α 水平分別降低 81.76%（P＜0.01）和 54.27%（P＜0.01）。

3.7 土鱉蟲對TF蛋白表達的影響

結果如圖8所示，TF蛋白在模型大鼠的血栓和靜脈壁中高表達。與模型組相比，低（P＜0.05）和高（P＜0.01）劑量土鱉蟲顯著降低TF蛋白表達水平。

3.8 土鱉蟲對炎性細胞滲出和浸潤的影響

如圖7-11所示，與正常組和假手術組相比，模型組靜脈壁的炎性細胞明顯增多。與模型組相比，各給藥組血管壁炎性細胞均有所減少，土鱉蟲低劑量組和高劑量組炎性細胞抑制率分別為30.91%（P＜0.01）和60.19%（P＜0.01）。與模型組相比，土鱉蟲低劑量組血栓中炎性細胞減少，抑制率為23.92%（P＜0.01），土鱉蟲高劑量組降低尤其明顯，其對炎性細胞抑制率達51.43%（P＜0.01）。

4 討論

圖9 土鱉蟲對炎性細胞浸潤的影響（，n=10）

圖10 土鱉蟲對單核細胞募集的影響（，n=10）

本研究結果顯示高劑量土鱉蟲明顯升高DVT大鼠的血小板數(shù)量，這可能與土鱉蟲抑制血栓形成相關。血小板參與靜脈血栓的形成[17]，土鱉蟲可減少靜脈血栓形成過程中的血小板消耗，使得血液循環(huán)系統(tǒng)中的血小板數(shù)量升高。本研究還發(fā)現(xiàn)土鱉蟲提高DVT大鼠的全血粘度，這可能與其升高血小板數(shù)量密切相關。然而，有研究報道土鱉蟲水提物對正常SD大鼠的全血粘度無明顯影響[18]，水提醇沉法制備土鱉蟲的注射液可以顯著降低正常的大耳白兔的全血粘度[19]。除此之外，本研究結果表明土鱉蟲對ADP誘導的血小板最大聚集率沒有影響，此結果與郎杰等[20]的研究結果基本一致。而王怡等[19]研究發(fā)現(xiàn)對正常大耳白兔給予土鱉蟲后，能明顯抑制改良SCHATZ法檢測的血小板聚集率。許俊杰等[18]發(fā)現(xiàn)土鱉蟲能顯著抑制正常SD大鼠的血小板聚集率。本研究結果與前人的研究結果不一致的原因可能是實驗方法、實驗動物或造模方法不同。

圖11 土鱉蟲對中性粒細胞募集的影響（，n=10）

黃鎮(zhèn)林等[9]發(fā)現(xiàn)土鱉蟲抗凝組分F2-2多肽能顯著延長腎上腺素配合冰浴刺激誘導的大鼠急性血瘀證模型的APTT、PT，而本研究發(fā)現(xiàn)土鱉蟲配方顆粒對下腔靜脈狹窄法誘導的DVT大鼠的APTT、PT沒有影響。研究結果不一致的原因可能是受試物、造模方法不同。土鱉蟲配方顆粒，是采用中醫(yī)傳統(tǒng)的水煎方法提取藥物成分制備成顆粒。土鱉蟲多肽F2-2，是采用酶解法從土鱉蟲中提取獲得[9]。兩者的主要化學成分存在著較大的差異。此外，腎上腺素配合冰浴刺激的急性血瘀證模型的造模機理是源于中醫(yī)理論。中醫(yī)理論認為“寒邪”和“憂郁”為血液高凝（急性血瘀）的病因，冰浴刺激模擬“寒邪”入侵機體，加上注射腎上腺素模擬人體釋放腎上腺素，從而復刻血液高凝模型[21]。然而，下腔靜脈狹窄法誘導大鼠DVT的過程，實際上是血管的狹窄導致局部缺氧缺血引起的局部炎癥所致，其造模機理與傳統(tǒng)認為的血液高凝誘發(fā)血栓形成的觀點不同[22-23]。

DVT形成的三大因素為血流滯緩、血管內皮細胞細胞損傷和血液高凝狀態(tài)[24]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究關注更多的是血栓形成的非高凝階段。已有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子和免疫細胞在DVT的形成和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[25]。通過狹窄大鼠下腔靜脈造成局部缺血缺氧，導致靜脈內皮激活并表達出粘附分子和趨化因子[26]。粘附分子和趨化因子通過介導白細胞-內皮細胞、白細胞-血小板和白細胞-白細胞的粘附，促發(fā)靜脈腔炎性細胞浸潤和靜脈壁炎性細胞滲出[27-30]。此外，中性粒細胞釋放絲氨酸蛋白酶，降解組織因子途徑抑制物和血栓調節(jié)蛋白，也可鈍化抗凝系統(tǒng)功能[31]。由此可見，缺血缺氧最終可通過激活凝血系統(tǒng)和抑制抗凝系統(tǒng)誘導DVT。本實驗對DVT大鼠給予土鱉蟲后，靜脈壁和血栓組織的中性粒細胞和單核細胞數(shù)量以及TF蛋白表達明顯減少，而且血清IL-1β和TNF-α水平均顯著降低，結果提示土鱉蟲可能通過改善炎癥微環(huán)境，修復靜脈內皮損傷，發(fā)揮抗DVT的作用。

值得一提的是，土鱉蟲具有促進纖維蛋白溶解的作用[20]，但本研究尚未解釋土鱉蟲能否作用于纖溶系統(tǒng)而抑制下腔靜脈狹窄法誘導的DVT。此外，血管狹窄造成內皮細胞缺氧而激活釋放大量的活性氧同樣可誘導一系列促血栓反應，最終導致靜脈血栓形成[32]。土鱉蟲能否通過改善內皮細胞氧化應激而抑制DVT仍需進一步的驗證。

綜上所述，土鱉蟲具有顯著抑制DVT的作用，其抗血栓作用很可能與其改善炎癥微環(huán)境和修復內皮損傷有關。但是，土鱉蟲抗血栓作用可能是多方面因素綜合作用的結果?？寡卓赡苤皇峭流M蟲抗血栓作用機制中的一個，并且土鱉蟲修復內皮損傷的分子機制有待深入研究。本研究也為土鱉蟲活血化瘀功效的研究提供了新的思路。