林松泉

（廈門惠盈動物科技有限公司，福建 廈門 361023）

仔豬斷奶后發(fā)生應(yīng)激性腹瀉的可能性較大，一般由大腸桿菌引起，具有較高的死亡率。在細(xì)菌性疾病的防治中普遍使用抗生素，而抗生素的使用往往存在毒副作用、菌株耐藥性與藥物殘留等問題[1-3]。根據(jù)農(nóng)業(yè)部第194號公告，從2020年起全面禁抗、限抗，因此研究抗生素替代品具有深遠(yuǎn)意義。

益生菌能有效抑制病原菌，提高動物免疫力，與抗生素相比，具有抗菌活性，卻無抗生素弊端，為優(yōu)選的替抗品之一[4-5]。在中藥發(fā)酵過程中益生菌能利用所分泌的酶類或有機(jī)酸對中藥進(jìn)行炮制，經(jīng)微生物發(fā)酵過后的中藥，不僅中藥活性成分得到保護(hù)，還能有效提高中藥成分的提取率而且能降低中藥的毒副作用[6-8]。

本研究是在“仔豬腹瀉病原菌分離及其防治”[9]的研究基礎(chǔ)上所延伸的后續(xù)研究，通過對發(fā)酵中藥耐受性試驗入篩選最適發(fā)酵菌株，并對該菌株進(jìn)行中藥發(fā)酵，旨在獲得一種中藥發(fā)酵制劑來防治大腸桿菌引發(fā)的腹瀉，從而減少抗生素的使用。

1 材料與方法

1.1 中藥發(fā)酵培養(yǎng)基

金銀花、蒲公英、白頭翁和黃柏均為10 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母浸膏10 g/L，pH 7.2，其中中藥經(jīng)過超微粉碎處理。

1.2 試驗菌株

凝結(jié)芽孢桿菌 GDM1.645（Bacillus coagulans）、植物乳桿菌 GDM1.191（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌GDM1.80（Lactobacillus casei）、嗜酸乳桿菌GDM1.208（Lactobacillus acidophilus）購自廣東省微生物菌種保藏中心，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）為本實驗室分離純化。大腸桿菌[9]（Escherichia coli）分離自腹瀉仔豬腸道。

1.3 試驗藥物

慶大霉素，生產(chǎn)批號：210618，上海沃凱化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；酵母浸膏，生產(chǎn)批號：2020111601DL，安琪酵母股份有限公司產(chǎn)品；無水葡萄糖，生產(chǎn)批號：20210522-1，濰坊盛泰藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；金銀花、蒲公英、白頭翁和黃柏皆為藥店采購。

1.4 試驗動物

28日齡BALB/c小鼠購自武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司；30日齡斷奶仔豬由福建某豬養(yǎng)殖場提供。

1.5 試驗方法

1.5.1 中藥發(fā)酵菌株篩選。采用以中藥發(fā)酵培養(yǎng)基作為中藥耐受性篩選培養(yǎng)基，100 mL三角瓶裝液80 mL，經(jīng)115℃滅菌30 min，分別按5%接種量接入活化后的供試驗用菌株，采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2，36℃厭氧培養(yǎng)48 h。期間取樣檢測24 h及48 h的pH值及活菌數(shù)，活菌數(shù)采用10倍稀釋涂布方法檢測活菌數(shù)。

1.5.2 中藥發(fā)酵制備。以中藥發(fā)酵培養(yǎng)基為配方，采用150 L發(fā)酵罐，制備100 L中藥發(fā)酵液，經(jīng)115℃滅菌蒸煮30 min，冷卻，按5%接入篩選獲得的復(fù)合益生菌菌種培養(yǎng)液，采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2，36℃厭氧培養(yǎng)48 h，灌裝獲得中藥發(fā)酵液，檢測活菌數(shù)。其中，復(fù)合益生菌菌種按體積接種比例為凝結(jié)芽孢桿菌2%、鼠李糖乳桿菌2%、植物乳桿菌1%。

中藥對照為中藥發(fā)酵培養(yǎng)基直接以115℃蒸煮滅菌30 min，冷卻后灌裝。益生菌對照組不加中藥成分，以葡萄糖20 g/L、酵母浸膏10 g/L發(fā)酵復(fù)合益生菌，采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2，36℃厭氧培養(yǎng)48 h后灌裝。

1.5.3 中藥發(fā)酵抑菌試驗。采用牛津杯法[10]，將大腸桿菌接種于平板活化，挑取菌泥，稀釋至活菌數(shù)約為108CFU·mL-1，吸取1 mL菌懸液加入50℃保溫的100 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中搖勻，傾倒于平板，冷卻凝固后將牛津杯置于平板上，分別往牛津杯中加入中藥發(fā)酵液，中藥對照液及其益生菌對照發(fā)酵液各0.25 mL，4℃冰箱靜置2 h后37℃下培養(yǎng)24 h。觀察有無抑菌圈產(chǎn)生，并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑大小。

1.5.4 動物致病性及治療試驗。隨機(jī)選取120只健康小鼠分成6組，每組20只，分別設(shè)空白對照組、病菌感染組、慶大霉素組、中藥發(fā)酵組、中藥對照組和益生菌對照組。其中除空白對照組外，其余組小鼠腹腔注射大腸桿菌菌濃約為106CFU·mL-1的病菌懸液，用量為0.5 mL/只，對照組注射0.5 mL/只的0.85%無菌生理鹽水。慶大霉素組按1 g/kg用藥量加入日糧及飲水中，而中藥發(fā)酵組、中藥對照組和益生菌對照組在日糧及飲水中按1 g/kg各自加入樣液。6組日常喂食管理一致，飲水自由。如果有個別小鼠死亡，及時取出，連續(xù)觀察7 d，計算小鼠死亡只數(shù)，并剖檢死亡小鼠，取臟器進(jìn)行病菌分離。

1.5.5 仔豬腹瀉預(yù)防試驗。在福建某豬養(yǎng)殖場隨機(jī)選取30日齡斷奶仔豬120只，平均分為4組，雌雄各半。分別設(shè)為空白對照組、中藥發(fā)酵組、中藥對照組和益生菌對照組。中藥發(fā)酵組、中藥對照組和益生菌對照組在日糧及飲水中按1 g/kg各自加入樣液。4組日常喂食管理一致，試驗為期30 d，統(tǒng)計試驗期間腹瀉及死亡仔豬數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel2020整理及標(biāo)準(zhǔn)差分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并采用SPSS22.0軟件中Duncan法進(jìn)行多重比較分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥發(fā)酵菌株篩選

選取5株可以抑制大腸桿菌的益生菌進(jìn)行中藥發(fā)酵培養(yǎng)，測試益生菌對中藥的耐受性，結(jié)果如表1所示。在整個中藥發(fā)酵過程中，5株益生菌發(fā)酵產(chǎn)酸，使中藥發(fā)酵培養(yǎng)基pH呈下降趨勢。在24 h時活菌數(shù)最高的為植物乳桿菌2.6×109CFU·mL-1，而鼠李糖乳桿菌為1.2×109CFU·mL-1，其他3株菌活菌數(shù)皆在107CFU·mL-1范圍內(nèi)，說明這兩株乳酸菌能在該中藥發(fā)酵培養(yǎng)基中良好生長，不受中藥抑制或抑制程度低。在中藥發(fā)酵48 h后，凝結(jié)芽孢桿菌、干酪乳桿菌與嗜酸乳桿菌活菌數(shù)有所提高，以凝結(jié)芽孢桿菌所提升幅度較大，故所受中藥抑制較低。綜合考慮，選取凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌及鼠李糖乳桿菌這3株益生菌作為發(fā)酵中藥的菌株。

表1 益生菌中藥發(fā)酵結(jié)果

2.2 中藥發(fā)酵制備及抑菌試驗結(jié)果

以中藥發(fā)酵培養(yǎng)基為配方，采用凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌及鼠李糖乳桿菌作為發(fā)酵益生菌發(fā)酵中藥，制備中藥發(fā)酵液。經(jīng)檢測，總活菌數(shù)為2.2×109CFU·mL-1，pH 為 3.86。未經(jīng)發(fā)酵的中藥 pH 為 5.64。未加中藥的益生菌發(fā)酵液經(jīng)檢測，總活菌數(shù)為3.5×109CFU·mL-1，pH為3.66，如表2所示。在抑制大腸桿菌中，大腸桿菌對中藥發(fā)酵液及益生菌發(fā)酵液表現(xiàn)高敏感，對純中藥液表現(xiàn)中敏感，說明單純的中藥制劑對抑制大腸桿菌的抑制作用較其他2種制劑弱，且中藥發(fā)酵液的抑制效果略優(yōu)于益生菌發(fā)酵液。

表2 中藥發(fā)酵及抑制大腸桿菌結(jié)果①

2.3 動物致病性及治療試驗

從腹瀉仔豬分離出來的大腸桿菌[1]經(jīng)過菌株毒性及其防治效果的測試試驗，結(jié)果如表3所示。該大腸桿菌具有較強(qiáng)的致病能力，仔豬感染后的前3天內(nèi)出現(xiàn)較高的死亡率，達(dá)90%。在慶大霉素藥物或中藥發(fā)酵制劑的干預(yù)治療下，仔豬死亡率明顯下降，分別為15%與20%，與病菌感染組相比達(dá)到極顯著差異（P＜0.01）。而單純的中藥或益生菌制劑，其治療效果不如中藥發(fā)酵制劑，但也與病菌感染組相比差異顯著（P＜0.05）。

表3 小鼠致病性試驗結(jié)果

中藥發(fā)酵制劑在養(yǎng)殖場的仔豬腹瀉預(yù)防實際運(yùn)用中，試驗結(jié)果如表4所示，在日糧中添加中藥發(fā)酵制劑仔豬腹瀉率與死亡率分別為6.67%及0%，與空白對照組腹瀉率46.67%與死亡率42.86%相比，差異極顯著（P＜0.01）。中藥對照組與益生菌對照組在仔豬預(yù)防腹瀉試驗中，效果不如中藥發(fā)酵組，該結(jié)果與小鼠的試驗結(jié)果也較為一致。

表4 仔豬預(yù)防腹瀉試驗結(jié)果

3 討論

從腹瀉仔豬的小腸內(nèi)容物及糞便中分離出一株大腸桿菌，林松泉的[9]研究表明，該病菌具有較強(qiáng)的致病性，且對大多數(shù)的抗生素具有耐藥性，但對頭孢哌酮、慶大霉素藥物表現(xiàn)敏感，且凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌等乳酸菌對其有良好的抑制作用。經(jīng)過益生菌對中藥的耐受性篩選，獲得3株具有發(fā)酵中藥優(yōu)勢菌株，經(jīng)過48 h厭氧發(fā)酵，獲得中藥發(fā)酵制劑。經(jīng)過動物試驗研究表明，該中藥發(fā)酵制劑能有效防治仔豬腹瀉，并降低其發(fā)病率和死亡率。

中藥運(yùn)用于仔豬腹瀉的治療也有報道，如田明[12]、王俊俊[13]和楊久春等人[14]利用中藥制劑治療仔豬腹瀉，且取得顯著效果。同時有研究表明[15-18]，中藥經(jīng)過微生物發(fā)酵后，其藥用效果明顯優(yōu)于未發(fā)酵。而在本研究中，不管是對大腸桿菌的抑制效果或是在動物性試驗中，中藥發(fā)酵制劑的作用效果皆優(yōu)于未發(fā)酵的純中藥制劑，該結(jié)果與上述觀點(diǎn)一致。

陳新瑤[19]、段雪磊[20]、韓宇等人[21]采用中藥發(fā)酵制劑添加在斷奶仔豬日糧中，能顯著降低仔豬腹瀉率，并提高免疫能力。他們研究所采用的單一中藥成分與本文研究的中藥不同，但在降低仔豬腹瀉率方面皆有良好效果，說明在防治仔豬腹瀉所用中藥具有多樣性。

本研究也有不足之處。所制備的中藥發(fā)酵制劑是針對某養(yǎng)豬場仔豬腹瀉所篩選的大腸桿菌，對防治該場仔豬腹瀉具有良好效果，但該制劑對其他養(yǎng)豬場或其他畜禽動物的防治腹瀉效果未做驗證。后續(xù)將補(bǔ)充該方面研究，較為全面地分析中藥發(fā)酵制劑的特性。

4 結(jié)論

本研究通過凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌及鼠李糖乳桿菌發(fā)酵4種中藥，獲得一種中藥發(fā)酵制劑。經(jīng)過試驗研究表明，該中藥制劑能有效抑制大腸桿菌，防治仔豬腹瀉，降低腹瀉發(fā)生率及死亡率。在仔豬日糧中，添加該中藥發(fā)酵制劑，能減少抗生素的使用，達(dá)到替抗、減抗的目的。