張 鑫，肖 妮

(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院病理科，廣東 佛山 528000)

甲狀腺乳頭狀腺癌是常見的甲狀腺癌，惡性程度較低，但其發(fā)展緩慢，較為隱匿，易發(fā)生轉(zhuǎn)移。甲狀腺乳頭狀腺癌發(fā)病機制尚不清楚，細胞的異常增生及細胞凋亡機制與甲狀腺乳頭狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。微小染色體維持蛋白7(minichro-mosome maintenance protein7，MCM7)是DNA復制的起始關(guān)鍵因子，調(diào)控細胞周期，促進細胞分裂[2]，而P27蛋白屬于細胞周期依賴性激酶抑制劑，具有負調(diào)控DNA復制的作用，兩者共同調(diào)節(jié)細胞增殖，MCM7與P27異常表達均可導致細胞異常生長[3]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族一員，能抑制細胞凋亡和維持細胞有絲分裂，有學者發(fā)現(xiàn)其在正常組織中幾乎不表達，而在各種癌癥組織中過表達，在癌癥進展中發(fā)揮重要作用[4]。本研究分析了MCM7在不同甲狀腺組織之間、甲狀腺乳頭狀腺癌不同臨床特征之間的表達情況及其診斷價值，并分析了MCM7與survivin、P27的相關(guān)性，探討甲狀腺乳頭狀腺癌的可能機制，為其診斷治療提供理論支持?，F(xiàn)報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 隨機選取我院2019年1月—2021年3月因甲狀腺疾病行外科手術(shù)切除的病理組織，其中甲狀腺乳頭狀腺癌60例，甲狀腺腺瘤40例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫40例。另選取同期20例甲狀腺正常的死亡尸體解剖的甲狀腺組織。所有患者符合《甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診治指南》[5]中診斷標準。甲狀腺乳頭狀腺癌患者男性11例，女性49例，年齡18～68歲，平均(40.12±8.36)歲。甲狀腺腺瘤患者男性8例，女性32例，年齡19～66歲，平均(41.31±8.12)歲。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者男性9例，女性31例，年齡20～69歲，平均(42.52±7.85)歲。

本研究符合《赫爾辛基宣言》，所有患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2方法 免疫組織化學法檢測甲狀腺組織中MCM7、survivin、P27的表達：組織樣本采用10%甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋，采用石蠟切片機(德國Leica Biosystems公司，Leica RM2125 RTS)連續(xù)切片。采用SP檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，SP0041)對切片進行染色，抗體使用兔抗人MCM7、survivin、P27一抗(美國abcam公司，ab52489、ab76424、ab32034)，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3觀察指標 結(jié)果評價標準[6]：于高倍鏡(×400)下隨機觀察5個視野，每個視野取200個細胞計數(shù)，MCM7、P27蛋白陽性表達定位于細胞核，survivin陽性表達定位于細胞核及細胞質(zhì)，呈黃色、棕黃色、褐色顆粒狀。根據(jù)著色強度(無色：0分、淡黃色：1分、棕黃色：2分、褐色或黑色：3分)、陽性細胞比例(低于10%：1分、11%～50%之間：2分、51%～75%之間：3分、超過75%：4分)判斷陽性表達情況，總分=著色強度得分×陽性細胞比例得分，總分3分及以上為陽性，3分以下為陰性。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；評估價值通過受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve，ROC曲線)評估，曲線下面積(area under curve，AUC)0.5～0.7時評估準確性低，0.7～0.9時有一定準確性，>0.9準確性較高。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1不同甲狀腺組織中MCM7、survivin、P27的表達 不同甲狀腺組織MCM7、survivin、P27表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；甲狀腺乳頭狀癌MCM7陽性表達率為93.33%與甲狀腺腺瘤的27.50%、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的7.50%、正常甲狀腺的0.00%比較，明顯較高(P<0.05)。甲狀腺乳頭狀癌survivin陽性表達率為96.67%與甲狀腺腺瘤的37.50%、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的15.00%、正常甲狀腺的0.00%比較，明顯較高(P<0.05)；甲狀腺乳頭狀癌P27陽性表達率為21.67%與甲狀腺腺瘤的100.00%、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的100.00%、正常甲狀腺的100.00%比較，明顯較低(P<0.05)。見表1～2，圖1。

表1 不同甲狀腺組織中MCM7的表達Table 1 The expression of MCM7 in different thyroid tissues (例數(shù)，%)

表2 不同甲狀腺組織中survivin、P27的表達Table 2 The expression of survivin and P27 in different thyroid tissues (例數(shù)，%)

圖1 甲狀腺乳頭狀癌組織MCM7、survivin、P27的免疫組織化學圖(SP ×400)

A.甲狀腺乳頭狀癌組織MCM7陽性；B.甲狀腺乳頭狀癌組織survivin陽性；C.甲狀腺乳頭狀癌組織P27陽性

Figure 1 Immunohistochemical plot of MCM7, survivin, and P27 in papillary thyroid carcinoma tissues(SP ×400)

2.2甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7、survivin、P27陽性表達單因素分析 不同性別、年齡的甲狀腺乳頭狀腺癌組織之間MCM7陽性表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，腫瘤直徑>1 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的MCM7陽性表達率與腫瘤直徑≤1 cm、TNM分期Ⅰ～Ⅱ、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移比較，明顯較高(P<0.05)；不同性別、年齡、腫瘤直徑的甲狀腺乳頭狀腺癌組織之間survivin陽性表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的survivin陽性表達率與TNM分期Ⅰ～Ⅱ、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移比較，明顯較高(P<0.05)；不同性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀腺癌組織之間P27陽性表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7、survivin、P27陽性表達單因素分析Table 3 Univariate analysis of positive expression of MCM7, survivin and P27 in papillary thyroid adenocarcinoma tissue (例數(shù)，%)

2.3甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7與survivin、P27的相關(guān)性 甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7表達與survivin表達呈明顯正相關(guān)(P<0.05)；甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7表達與P27表達呈明顯負相關(guān)(P<0.05)。見表4。

2.4MCM7診斷甲狀腺乳頭狀腺癌ROC分析 MCM7診斷甲狀腺乳頭狀腺癌的AUC為0.942(95%CI：0.900～0.984，P<0.001)，診斷甲狀腺乳頭狀腺癌準確性高。根據(jù)最佳臨界值，當MCM7的cut-off值1.5時，約登指數(shù)為0.823，敏感度為93.3%，特異度為89.0%。見圖2。

表4 甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7與survivin、P27的相關(guān)性Table 4 Correlation of MCM7 with survivin and P27 in papillary thyroid adenocarcinoma (例數(shù))

圖1 MCM7診斷甲狀腺乳頭狀腺癌ROC曲線

3 討 論

甲狀腺癌是女性高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀腺癌占80%～90%，發(fā)病率近年來呈升高趨勢。目前臨床主要采用實驗室檢查、超聲影像、細胞病理學進行診斷，但診斷精準仍有一定難度及技術(shù)水平，需大量臨床經(jīng)驗[7]。因此，探討甲狀腺乳頭狀腺癌簡單易行的病理分子診斷指標具有重要價值。細胞周期異常引起的細胞過度增殖是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)，而細胞凋亡被抑制導致癌細胞死亡降低在腫瘤發(fā)展中起重要作用[8]。

細胞周期有四個時期，其中G1期為細胞分裂準備期，主要合成DNA復制所需的核苷酸，S期為DNA合成期，主要合成DNA、組蛋白及相關(guān)酶，G2期主要合成RNA及細胞骨架所需蛋白質(zhì)[9]。DNA的復制、合成需要一個特定的復制起始點，G1早期MCM7與染色體上復制子結(jié)合參與形成復制前復合物，而在G1/S期MCM7被再活化，發(fā)揮DNA解鏈酶功能，最終啟動DNA復制，延伸復制叉[10]。細胞周期中MCM7水平波動變化，G0期表達下降，S期從染色質(zhì)上解離出來到達峰值，M期MCM7呈游離的微小染色體，而在細胞分化、凋亡時下降[11]。MCM7表達水平?jīng)Q定DNA復制能力，高MCM7水平能提高DNA復制速度，增加細胞增殖速度、生長能力。研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀腺癌MCM7陽性表達率明顯高于其他組織，說明甲狀腺乳頭狀腺癌存在明顯的細胞周期異常。腫瘤直徑>1 cm的患者MCM7陽性表達較高，提示MCM7過表達促進癌細胞的生長，TNM分期Ⅲ～Ⅳ的患者陽性高表達，提示MCM7過表達促進甲狀腺乳頭狀腺癌的發(fā)展，淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的患者MCM7陽性高表達，提示MCM7能促進甲狀腺乳頭狀腺癌的浸潤侵襲。

P27基因定位于12號染色體，屬抑癌基因，高度保守性，基因突變概率小，P27作為負性調(diào)控因子參與細胞周期調(diào)控，主要通過抑制CDK4和CDK2的磷酸化抑制cyclin-CDK活性，限制細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換[12]。本研究發(fā)現(xiàn)P27在甲狀腺乳頭狀腺癌組織中陽性表達明顯較少，而正常組織中幾乎均陽性表達，提示可能因P27蛋白需在胞核中才發(fā)揮細胞周期調(diào)節(jié)功能，甲狀腺乳頭狀腺癌細胞可能通過將胞核內(nèi)的P27蛋白泛素化降解減少或者向細胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移抑制其負調(diào)控活性[13]。Survivin基因定位于17號染色體，通常以二聚體的形式存在，屬于IAP家族，是一種細胞凋亡抑制蛋白，抑制活性明顯強于Bcl家族成員，可激活SMAC、p21、受體、線粒體/細胞色素C等通路，直接作用于caspase家族，抑制細胞凋亡。Survivin還可同時調(diào)控細胞周期，與CDK結(jié)合激活cyclin-CDK加快G1/S期轉(zhuǎn)換。Survivin正常生理下在G2/M期表達，參與調(diào)控細胞分裂過程中紡錘體的形成，抑制caspase水解紡錘體，維持有絲分裂持續(xù)進行，促進了細胞增殖，抑制細胞凋亡，余江濤等[14]通過沉默survivin基因能調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達，促進甲狀腺癌細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀腺癌組織中survivin陽性表達明顯高于其他組織，TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的患者陽性表達明顯較高，提示survivin與甲狀腺乳頭狀腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，MCM7與P27呈顯著負相關(guān)，可能與P27基因的羧基末端結(jié)構(gòu)域能與MCM7的保守結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，抑制MCM7，負調(diào)控細胞周期，確保細胞周期中DNA只復制一次，牛廣旭等[15]發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌中P27蛋白的表達下調(diào)，導致MCM7的表達上調(diào)，促進細胞周期異常增生。本研究還發(fā)現(xiàn)MCM7與survivin顯著正相關(guān)，提示可能與survivin過表達抑制了細胞凋亡，使MCM7保持較高水平，促進細胞增殖，兩者可能共同促進甲狀腺乳頭狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過ROC分析結(jié)果顯示，MCM7診斷的AUC為0.942，具有較高的診斷價值，可以作為診斷甲狀腺乳頭狀腺癌的病理分子標志物。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7過表達，可能survivin過表達、P27蛋白低表達使MCM7保持高表達，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，共同參與甲狀腺乳頭狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。MCM7可用于鑒別診斷甲狀腺乳頭狀腺癌，具有較高的準確性，可以作為診斷甲狀腺乳頭狀腺癌的病理分子標志物。本研究不足之處在于研究結(jié)論僅限于臨床理論基礎(chǔ)，還需后續(xù)進一步細胞、動物實驗的驗證。