李竹青，蔣 磊

（安徽省第二人民醫(yī)院，安徽 合肥 230041）

白前苷B（C21H20O11），又名田基黃苷，槲皮素-7-鼠李糖苷等，在藤黃科植物田基黃H ypericum ja ponicumThunb.的全草及蘿蘑科植物藥用白前Vi ncetoxicum offi?ci naleMoench的葉中含量豐富［1-2］。現(xiàn)代藥理學研究表明，白前苷B具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等作用。其對人舌癌細胞有明顯的殺傷作用，且與藥物濃度呈正相關(guān)［3］，機制為促進T淋巴細胞的分化與成熟，從而增強機體的特異性細胞免疫和免疫調(diào)節(jié)作用。其對單鈉尿酸鹽（MSU）所致大鼠足爪腫脹有較好的抑制作用，能減輕MSU所致家兔急性關(guān)節(jié)炎的炎癥程度，降低高尿酸血癥模型小鼠的血尿酸值［4］。目前研究多集中于中藥植物化學成分的識別和藥理學研究，對藥物代謝動力學關(guān)注較少［5］。本研究中建立了測定大鼠血漿中白前苷B的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法，并闡明其藥物代謝動力學行為［6］?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥與動物

儀器：Agilent 1290型超高效液相色譜（UPLC）儀、Agilent 6460型質(zhì)譜（MS）儀（美國Agilent公司）；VORTEX 4型渦旋混合器（上海達姆實業(yè)有限公司）；Milli-Q型超純水器（美國Millipore公司）；Sorvall ST8型高速離心機（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；MS-TS型電子天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易＜上海＞有限公司）。

試藥：白前苷B（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號為20180216，含量99%）；槲皮素（天津希恩思生化科技有限公司，批號為20180322，含量96%）；二甲基亞砜（DMSO，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為202101013）；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

動物：健康清潔級SD大鼠18只，體質(zhì)量（250±20）g，雌雄各半，均購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（皖）2019-013。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±2）℃、相對濕度（50±15）%，12 h/12 h明暗交替，在空調(diào)房內(nèi)自由進食和飲水7 d。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

1）色譜條件。色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動相：0.2%醋酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～6 min時10%B→18%B，6～7 min時18%B→52%B，7～9 min時52%B→56%B，9～10 min時56%B→68%B，10～11 min時68%B→80%B，11～12 min時80%B→100%B，12～15 min時100%B→10%B，15～17 min時10%B）；流速：0.3 mL/min；柱溫：25°C；進樣量：1μL。

2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子（ESI）源，正、負電離模式，高純度氮氣。采集模式：多反應監(jiān)測模式（MRM）；毛細管電壓為4 000 V（ESI+），3 000 V（ESI-）；噴霧電壓為4 000 V；霧化器氣體（氮氣）壓力：2.8×105Pa；脫溶氣溫度：300℃；流速：10 L/min。

2.2 溶液制備

取白前苷B 10 mg，精密稱定，以DMSO溶解并制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的供試品溶液。取槲皮素對照品1.5 mg，精密稱定，以DMSO溶解并制成150μg/mL的內(nèi)標溶液。

2.3 血漿樣品處理

取大鼠血漿100μL，加入質(zhì)量濃度為1.5μg/mL的內(nèi)標溶液10μL，渦旋振蕩30 s，加入DMSO 200μL，渦旋振蕩5 min，沉淀蛋白。4℃下3 000 r/min離心10 min，精密吸取上清液125μL，10 000 r/min離心10 min，取上清液100μL，用氮氣揮干，所得殘渣以100μL DMSO復溶，渦旋振蕩5 min，4℃下10 000 r/min離心10 min，分離，取上清液，即得血漿樣品溶液。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：分別按2.3項下方法處理空白血漿、空白血漿加白前苷B及內(nèi)標溶液、給藥后血漿，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果白前苷B與槲皮素分離良好，且血漿內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾白前苷B的測定。詳見圖1。

圖1 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖1.Vincetoxicoside B 2.Quercetin A.Blank plasma B.Blank plasma containing vincetoxicoside B and quercetin C.Plasma after administration of drugFig.1 UPLC-MS/MS spectrograms

線性關(guān)系考察：制備白前苷B質(zhì)量濃度分別為5，20，50，250，500，2 000，5 000，10 000 ng/mL的系列血漿供試品，按2.3項下方法處理，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄離子強度。采用加權(quán)最小二乘法線性回歸模型，以白前苷B質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標、白前苷B離子強度和槲皮素離子強度比值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.001 3X+0.047 6（r=0.999 6，n=8）。結(jié)果表明，白前苷B質(zhì)量濃度在5～10 000 ng/mL范圍內(nèi)與白前苷B離子強度和內(nèi)標物離子強度比值線性關(guān)系良好。

定量限與檢測限考察：分別精密量取100μL空白血漿，加入稀釋后的供試品溶液，按2.3項下方法處理，按2.1項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，以信噪比為10∶1和3∶1時的質(zhì)量濃度為定量限和檢測限。結(jié)果白前苷B的定量限和檢測限分別為0.05 ng/mL和0.01 ng/mL。

精密度與準確度試驗：分別制備低、中、高質(zhì)量濃度（200，1 600，8 000 ng/mL）的白前苷B血漿樣品，按2.3項下方法處理，按2.1項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄離子強度，并計算日內(nèi)精密度；依法連續(xù)4 d（每天6次）進樣測定，記錄離子強度，計算日間精密度及準確度。結(jié)果日內(nèi)精密度的RSD分別為6.73%，8.96%，7.21%（n=6），日間精密度的R S D分別為5.64%，7.38%，6.53%（n=4），表明該方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：分別制備低、中、高質(zhì)量濃度（200，1 600，8 000 ng/mL）的白前苷B血漿樣品，按2.3項下方法處理，分別在3次凍融循環(huán)、室溫下12 h、-20℃冷凍30 d條件下，按2.1項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄離子強度。結(jié)果的R S D分別為17.51%，9.25%，5.74%；13.85%，8.86%，6.46%；17.12%，10.97%，5.95%（n=6）。表明樣品在不同條件下均較穩(wěn)定。

提取回收試驗與基質(zhì)效應考察：取穩(wěn)定性試驗項下低、中、高質(zhì)量濃度（200，1 600，8 000 ng/mL）的白前苷B血漿樣品，按2.3項下方法處理，按2.1項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄離子強度As（H），并計算各質(zhì)量濃度下As（H）的平均值；另分別取供試品溶液適量，加入DMSO制備成白前苷B質(zhì)量濃度分別為200，1 600，8 000 ng/mL的白前苷B標準品，按2.1項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄離子強度As（D），并計算各質(zhì)量濃度下離子強度As的平均值?；厥章剩?）=As（H）/As（D）×100%。結(jié)果白前苷B低、中、高質(zhì)量濃度的提取回收率分別為92.72%，85.67%，94.73%，RSD分別為6.13%，5.37%，6.95%；低、中、高質(zhì)量濃度的基質(zhì)效應分別為105.73%，96.62%，107.86%，R S D分別為7.76%，5.81%，4.93%，表明該方法符合生物樣品回收率提取要求（＞85%），無明顯的血漿離子抑制或增強現(xiàn)象。

2.5 藥物代謝動力學研究

取18只SD大鼠，隨機分為白前苷B低（50.0 mg/kg）、中（100.0 mg/kg）、高（200.0 mg/kg）劑量組。除自由飲水外，大鼠于實驗前12 h開始禁食。尾靜脈注射白前苷B，分別于給藥前，給藥后5，15，30 min及1，1.5，2，3，4，6，8，10，12，24 h眼眶取血0.5 mL，3 000 r/min離心10 min，分離，得血漿，測定白前苷B的血藥濃度。

給藥后的平均血漿濃度-時間曲線見圖2；與低劑量組比較，中、高劑量組的峰濃度（Cmax）、AUC0-∞及AU C0-t均顯著升高（P＜0.05），處理后的藥時數(shù)據(jù)均符合二室模型，以給藥劑量（X，mg/kg）為橫坐標，以低、中、高3個藥時曲線下面積AUC0-t（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=61.579X-4.595（R2=0.999 3）。藥物代謝動力學參數(shù)見表1。

表1 藥物代謝動力學參數(shù)（±s，n=6）Tab.1 Pharmacokinetic parameters（±s，n=6）

表1 藥物代謝動力學參數(shù)（±s，n=6）Tab.1 Pharmacokinetic parameters（±s，n=6）

注：與低劑量組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Note：Compared with those in the low-dose group，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

高劑量組0.62±0.13 3.27±0.37 0.03±0.002 5 376.54±867.31*0.03±0.005 3.52±0.36 12 439.47±2 367.28**12 367.38±2 372.19***參數(shù)t1/2α（h）t1/2β（h）CL［L/（h·g）］C max（ng/mL）V（L/g）MRT（h）AUC0-∞（ng·h/mL）AUC0-t（ng·h/mL）低劑量組0.58±0.16 3.67±0.28 0.03±0.012 2 481.74±683.47 0.03±0.002 3.62±0.38 3 467.49±1 132.53 3 186.76±1 034.29中劑量組0.63±0.24 3.34±0.16 0.03±0.003 3 563.52±759.82*0.03±0.006 3.48±0.46 5 892.85±1 627.14**5 984.67±1 594.27**

圖2 給藥后的平均血漿濃度-時間曲線Fig.2 Mean plasma concentration-time curve after administra?tion of drug

3 討論

白前苷B是含有黃酮醇和吡喃結(jié)構(gòu)的化合物，前期研究表明，白前苷B在吡啶、DMSO等有機溶劑中溶解度較好［7］，故本研究中采用DMSO為溶劑，并以0.2%醋酸水溶液和甲醇為流動相進行液相分離［8］。方法學考察結(jié)果表明，白前苷B和槲皮素間的分離度符合檢測要求，其他內(nèi)源性雜質(zhì)對其檢測無影響，血漿中白前苷B的提取回收率為85.70%～94.70%，基質(zhì)效應可接受范圍為96.60%～107.90%，日內(nèi)、日間精密度和準確度均符合要求，在血漿中較穩(wěn)定，損失在可控范圍內(nèi)。

藥物代謝動力學主要研究藥物在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄等過程，通過定量分析，闡明其在體內(nèi)的代謝動力學過程［9］。白前苷B是中藥有效成分，通過研究其藥物代謝動力學，能更好地觀察中藥在體內(nèi)的代謝過程。大鼠尾靜脈注射低、中、高劑量的白前苷B藥物濃度-時間曲線顯示，其在15 min時達到最大血藥濃度，隨著時間的延長，體內(nèi)藥物濃度逐漸降低，24 h后降至最低。結(jié)果表明，不同劑量下的半衰期（t1/2）變化符合線性動力學表達特征，血漿清除率（C L）為0.03 L/（h·g），清除速率較低，其平均滯留時間（MRT）為3.6 h，引起血藥濃度和滯留時間差異的因素較多，如體脂百分比，血漿體積，器官血流量，藥物代謝酶的表達，與藥物結(jié)合有關(guān)的蛋白質(zhì)及內(nèi)源性物質(zhì)等［10-13］。藥物濃度-時間曲線下面積（AUC）與給藥劑量呈良好線性關(guān)系，表明藥物進入血液循環(huán)系統(tǒng)的量與給藥劑量的相關(guān)性良好［14-16］。

綜上所述，本研究中建立了可測定大鼠血漿中白前苷B血藥濃度的UPLC-MS/MS法，該方法簡單快捷，結(jié)果準確可靠，可用于相關(guān)藥物血藥濃度的檢測及其藥物代謝動力學研究。