周 謐，龔旭東，徐丹洋，王素素，吳慧峰

（1.江蘇省南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 南通 226006；2.南通三越中藥飲片有限公司，江蘇 南通 226300）

沉香為瑞香科植物白木香Aquilar ia s inensis（Lour.）Gilg含有樹脂的木材，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘功效，為治療氣逆喘息、嘔吐、呃逆、心腹疼痛的要藥［1］。白木香是我國生產(chǎn)中藥沉香的唯一植物資源，為我國特有的珍貴藥用植物，由于自然災(zāi)害和人為破壞，野生資源在不斷減少，被列入國家二級(jí)保護(hù)野生植物。沉香不僅是中醫(yī)臨床常用名貴藥材，還是保健品、高級(jí)香料、化妝品等的原料，由于需求量大，資源緊張，導(dǎo)致市場中沉香藥材價(jià)格迅速上漲，質(zhì)量混亂，以假亂真的現(xiàn)象較嚴(yán)重。沉香表面應(yīng)為黑褐色樹脂與黃白色的木部相間，以往存在用松香浸泡不含或含較少樹脂的白木香使其醇溶性浸出物達(dá)標(biāo)的情況，隨著標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，該類現(xiàn)象明顯減少［2］。但近來在日常抽檢過程中發(fā)現(xiàn)，部分沉香藥材樣品表面與合格品比較顏色偏黃，懷疑存在將劣質(zhì)飲片通過工業(yè)染色劑染色后冒充或摻入優(yōu)質(zhì)飲片的情況［3-7］。為此，本研究中采用薄層色譜（TLC）法、超高效液相色譜-二極管陣列檢測器（UPLCDAD）法依次檢查，開展了沉香藥材中10種非法染色劑檢查方法的研究，并采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS/MS）法對(duì)檢出成分進(jìn)行確認(rèn)［5，8-9］?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Thermo LCQ Fleet型質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司，離子阱質(zhì)譜儀）；CPA225D型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司，精度為十萬分之一）；KQ-500DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

橙黃G對(duì)照品（阿拉丁試劑＜上海＞有限公司，批號(hào)為C1608071）；橙黃I對(duì)照品（批號(hào)為RH100041），甲基橙對(duì)照品（批號(hào)為C00001424），皂黃對(duì)照品（批號(hào)為C00001408），均購自羅恩科技＜北京＞有限公司；甲基黃對(duì)照品（批號(hào)為J6180005），堿性橙21對(duì)照品（批號(hào)為2168K050），亮黃對(duì)照品（批號(hào)為B0410005），均購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；金胺O對(duì)照品（批號(hào)為111770-201603），檸檬黃對(duì)照品（批號(hào)為510004-201401，含量91.0%），日落黃對(duì)照品（批號(hào)為510005-201602，含量86.9%），沉香對(duì)照藥材（批號(hào)為121222-201203），均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（德國Merck公司）；沉香樣品共46批，為日常抽檢或市場購買；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。色素信息見表1。

表1 色素信息Tab.1 The information of illegal dyes

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC法鑒別

鑒別：取藥材樣品粉末2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%乙醇20 mL，超聲（功率500 W，頻率40 kHz，下同）處理20 min，取出，放冷，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。量取10種色素對(duì)照品各適量，加70%乙醇制成每1 mL各約含0.1 mg的混合對(duì)照品溶液Ⅰ。取對(duì)照藥材，加70%乙醇20 mL，超聲處理20 min，取出，放冷，濾過，取續(xù)濾液，即得陰性對(duì)照品溶液。精密吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（6∶2∶4∶0.5，V/V/V/V）為一次展開劑，正丁醇-丙酮-乙酸乙酯-水-氨水（6∶6∶2∶2∶0.5，V/V/V/V/V）為二次展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視（溫度12℃，相對(duì)濕度45%）［10-11］。46批供試品溶液色譜中，有5批疑似檢出檸檬黃和日落黃，陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1。檢測限考察：量取10種色素對(duì)照品各適量，加70%乙醇制成每1 mL中各約含0.01 mg的混合對(duì)照品溶液Ⅱ。同法試驗(yàn)，以清晰可辨斑點(diǎn)的質(zhì)量濃度作為檢測限。結(jié)果橙黃G、橙黃I、甲基橙、甲基黃、堿性橙21、金胺O、亮黃、檸檬黃、日落黃、皂黃的檢測限分別為0.013，0.016，0.010，0.011，0.010，0.010，0.010，0.010，0.009，0.011 mg/g。

圖1 薄層色譜圖1.Mixed reference solution I 2.Negative reference solution 3-11.Test solution（sunset yellow and lemon yellow are suspected in Test solution 7-11）Fig.1 TLC chromatograms

2.2 UPLC-DAD法驗(yàn)證

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC?BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.2 mol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～2 min時(shí)10%A→17%A，2～3 min時(shí)17%A→20%A，3～6 min時(shí)20%A→40%A，6～16 min時(shí)40%A→45%A，16～20 min時(shí)45%A→46%A，20～22 min時(shí)46%A→70%A，22～23 min時(shí)70%A→100%A）；流速：0.2 mL/min；檢測波長：420 nm；柱溫：35℃。

2.2.2 溶液制備

量取10種色素對(duì)照品各適量，加70%乙醇制成每1 mL中各約含0.04 mg的混合對(duì)照品溶液Ⅲ。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液Ⅲ、2.1項(xiàng)下疑似含染色劑的供試品溶液、2.1項(xiàng)下陰性對(duì)照品溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果理論板數(shù)按檸檬黃峰計(jì)不低于3 000［12-14］，陰性對(duì)照在與10種色素對(duì)照品相同保留時(shí)間處無干擾峰，表明專屬性良好。掃描230～630 nm波長范圍的紫外-可見吸收光譜，并進(jìn)行峰純度檢查，結(jié)果峰純度均符合要求。詳見圖2（因篇幅所限，僅以對(duì)照品為例）。

圖2 超高效液相色譜-二極管陣列檢測器圖譜a.HPLC-DAD chromatograms b.UV spectrograms A.Orange I B.Lemon yellow C.Methyl orange D.Sunset yellow E.Methyl yellow F.Brilliant yellow G.Auramine O H.Orange G I.Basic orange 21 J.Metanil yellowFig.2 UPLC-DAD chromatograms

檢測限考察：取混合對(duì)照品溶液Ⅱ，倍比稀釋，并按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比為3∶1時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測限。結(jié)果橙黃G、橙黃I、甲基橙、甲基黃、堿性橙21、金胺O、亮黃、檸檬黃、日落黃、皂黃的檢測限分別為0.39，0.32，0.31，0.22，0.31，0.50，0.29，0.39，0.35，0.34μg/g。

2.2.4 樣品檢測

取混合對(duì)照品溶液Ⅲ，46批樣品的供試品溶液及2.1項(xiàng)下陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果在46批樣品中，有5批疑似檢出檸檬黃和日落黃，且與相應(yīng)對(duì)照品的紫外-可見分光光譜圖完全一致。

2.3 HPLC-MS/MS確認(rèn)

2.3.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：同2.2.1項(xiàng)。質(zhì)譜條件：離子源溫度為350℃，毛細(xì)管溫度為350℃，源電壓為4 000 V，鞘氣流速為35 arb，輔助氣流速為10 arb，離子源為電噴霧離子源；掃描模式為正負(fù)離子，同時(shí)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描、二級(jí)質(zhì)譜全掃描，掃描范圍m/z50～600［13-15］。質(zhì)譜離子信息見表2。

表2 質(zhì)譜離子信息Tab.2 The information of mass spectrum ion

2.3.2 樣品檢測

取混合對(duì)照品溶液Ⅲ，46批樣品的供試品溶液及2.1項(xiàng)下陰性對(duì)照品溶液，按2.3.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定。在疑似染色供試品溶液色譜中，與檸檬黃、日落黃對(duì)照品相應(yīng)色譜峰呈相同的質(zhì)譜特征。結(jié)果顯示，46批樣品中有5批檢出檸檬黃和日落黃。

3 討論

參照蒲黃中金胺O檢查的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法（批準(zhǔn)件編號(hào)為2007007）、紅花中多種色素檢查的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法（批準(zhǔn)件編號(hào)為2013006，2014016），用70%乙醇對(duì)藥材樣品進(jìn)行直接提取，方法簡便快捷。

預(yù)試驗(yàn)中采用了不同展開系統(tǒng)，二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（6∶2∶4∶0.5，V/V/V/V）和正丁醇-丙酮-乙酸乙酯-水-氨水（6∶6∶2∶2∶0.5，V/V/V/V/V）進(jìn)行比較，多種色素的分離效果欠佳，嘗試前一種系統(tǒng)為一次展開劑，后一種系統(tǒng)為二次展開劑，所得薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度佳。對(duì)溫度和相對(duì)濕度等影響因素進(jìn)行了考察，結(jié)果溫度和相對(duì)濕度對(duì)薄層色譜鑒別結(jié)果無明顯影響。

本研究中46批沉香藥材樣品有5批檢出檸檬黃和日落黃。當(dāng)前市場沉香染色情況較嚴(yán)重，檢出的檸檬黃和日落黃這2種染色劑均未見報(bào)道。兩者均為合成染色劑，由苯環(huán)和偶氮基團(tuán)等物質(zhì)縮合而成，在一定條件下可分解產(chǎn)生20多種具有致癌性的芳香胺類物質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致基因變異，進(jìn)而導(dǎo)致病變和誘發(fā)各類惡性腫瘤等［16］。

綜上所述，本研究中所建立的方法可用于沉香中這10種非法染色劑的檢查。