楊 樂，楊 柳，李 月，劉金秋，任大勇

（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，是人體微生物群的一部分，也是引起食物中毒、菌血癥、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、皮膚和軟組織感染的主要原因[1]，由于其可以定植在人體內(nèi)，當宿主機體免疫紊亂時，作為內(nèi)源性致病菌可能會引起更嚴重的感染[2]。致病菌侵入腸道的第1步是黏附，繼而定植到腸道，在局部產(chǎn)生毒素或者直接侵入組織，引起宿主細胞出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能的變化，從而引發(fā)疾病[3]。

目前在臨床上尚未有基于黏附的靶向治療手段，抗生素是目前治療致病菌最常見的方法，抗生素的普遍使用有力地抑制了致病菌，卻促進了耐藥性細菌的增長。經(jīng)常使用抗生素類藥品會使人體的抵抗力和免疫力下降，還會消滅人體有益菌群，導致體內(nèi)菌群失衡，耐藥細菌乘虛而入[4]。2018年，世界衛(wèi)生組織報道，如果不立即采取行動，到2050年，亞洲每年約有500萬 人死于對抗生素產(chǎn)生耐藥性的細菌感染，比預計每年死于癌癥的人數(shù)還要多[5]。因此，找到其他治療致病菌的方法至關(guān)重要。

大量研究表明，乳酸菌可以在體內(nèi)外很好地抑制致病菌黏附和定植于人體腸道上皮細胞，從而達到治療致病菌感染的作用[6-7]。部分研究表明某些乳酸菌能夠促進致病菌的黏附，Collado等[8-9]研究17 株益生菌對4 種致病菌（中間葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)莢膜梭菌、空腸彎曲菌）黏附的抑制效果，發(fā)現(xiàn)2 株益生性球菌提高了空腸彎曲菌黏附力，1 株雙歧桿菌提高了鼠傷寒沙門氏菌的黏附力；白潔等[10]研究6 株益生菌對2 株致病菌（大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌）黏附人腸道上皮細胞的影響發(fā)現(xiàn)，這6 株益生菌通過競爭和排斥作用反而促進了致病菌黏附。當乳酸菌促進致病菌黏附時，人體腸道內(nèi)致病菌數(shù)量增加，一旦腸黏膜屏障受損，腸道系統(tǒng)功能紊亂，會大大增加致病幾率，但乳酸菌促進黏附的具體機制尚不清楚。因此，本研究以一株前期篩選得到的促進金黃色葡萄球菌黏附的唾液乳桿菌CICC 23174為研究對象，試圖從膜外蛋白角度研究其促進金黃色葡萄球菌黏附的機制，為乳酸菌安全性評價以及乳酸菌的科學使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與動物

唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）CICC 23174、金黃色葡萄球菌金黃亞種（Staphylococcus aureussubsp.aureus）ATCC 8739、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和E. coliBL21（DE3）均由吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院食品與安全毒理學實驗室保存；pET-28a質(zhì)粒購于淼靈質(zhì)粒平臺；pNZ5319質(zhì)粒購于上海海吉浩格生物科技有限公司。

4 只健康SD大鼠（體質(zhì)量（200±20） g）、108 只SPF級健康小鼠（體質(zhì)量（20±2） g、6 周齡、雌雄各半）購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0001，該研究經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學動物保護局和使用委員會批準。

1.1.2 試劑

MRS培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；2×SoSoo Mix Plus 北京擎科生物科技有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、小量膠回收試劑盒 美國Axygen公司；細菌全基因提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；XhoI、SmaI和BamH I 北京NEB公司；番紅染液 北京Solarbio公司。本研究所用引物（表1）和測序結(jié)果均來自于吉林省庫美生物科技有限公司。

表1 實驗設(shè)計引物信息Table 1 Primer sequences used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

Red-96G聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Biotop SC810凝膠成像系統(tǒng) 上海山富科學儀器有限公司；infinite M200酶標儀 瑞士Tecan集團；DYY-11電泳儀、垂直電泳槽、水平電泳槽北京六一儀器廠；5804R離心機、5424R離心機、22331 Hamburg電轉(zhuǎn)儀 德國Eppendorf公司；IX 73熒光倒置顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；XL30 ESEM-FEG場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；紫外-可見分光光度計 島津國際貿(mào)易（上海）有限公司；FDU-1200冷凍干燥機 日本EYELA東京理化器械株式會社。

1.3 方法

1.3.1ef-g基因的克隆及重組菌E.coliBL21（DE3）的制備

唾液乳桿菌基因組為模板，利用ef-gF和ef-gR特異性引物進行PCR擴增，小量膠回收試劑盒回收ef-g基因，將ef-g基因與BamH I酶切的pET-28a質(zhì)粒用2×SoSoo Mix Plus試劑盒在50 ℃水浴連接15 min。將pET-ef-g重組質(zhì)粒用化學方法轉(zhuǎn)化到E. coliBL21（DE3）中，含卡那霉素的LB平板篩選，隔天挑取陽性菌落，PCR驗證重組E. coliBL21（DE3）菌株是否構(gòu)建成功。

1.3.2 EF-G蛋白純化及SDS-PAGE分析

重組E. coliBL21（DE3）菌株在200 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)2～3 h，OD600nm達到0.6～0.8時加入終濃度1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyβ-D-thiogalactoside，IPTG），調(diào)節(jié)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)3 h誘導蛋白延伸因子G（elongation factor G，EF-G）表達，回收菌體，超聲破碎，收集上清液，0.22 μm過濾器過濾，通過鎳柱純化，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）驗證EF-G是否正確表達[11]。

1.3.3 EF-G對金黃色葡萄球菌黏附性的影響

提取大鼠腸道黏液，凍干，用碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH 9.6）以1 g/L的比例溶解，4 ℃、5 000×g離心15 min，上清液分裝，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用蛋白包被法驗證EF-G體外促進金黃色葡萄球菌黏附。取200 μL上述腸道黏液溶液于96 孔板中，4 ℃靜置過夜，實驗分為2 組：第1組先加入200 μL 0.15 mg/mL EF-G溶液，4 ℃靜置過夜，加入200 μL含0.05% Tween-20的PBS（PBST）封閉1 h，PBST溶液洗2 次，倒置風干，然后加入200 μL 1×109CFU/mL金黃色葡萄球菌菌液；第2組加入0.15 mg/mL EF-G溶液與1×109CFU/mL金黃色葡萄球菌的混合溶液共200 μL；兩組均以PBS替代EF-G溶液作為對照組。繼續(xù)4 ℃孵育過夜，吸去孔板液體，PBST洗滌2 次，無水乙醇固定10 min，加入50 μL番紅染液染色，PBST洗滌1 次，倒置風干。用倒置顯微鏡觀察番紅染液染色情況，然后測定492 nm波長處測定OD值[12]，評價黏附性EF-G對金黃色葡萄球菌黏附性的影響。

1.3.4ef-g基因敲除表達載體（pNZ-ef-gsx）的構(gòu)建

圖1 pNZ-ef-gsx敲除載體構(gòu)建流程圖Fig. 1 Flow chart of pNZ-ef-gsx knockout vector construction

唾液乳桿菌基因組為模板，利用ef-gsF和ef-gsR引物克隆上游基因ef-gs，ef-gxF和ef-gxR引物克隆下游基因ef-gx。將ef-gs基因與XhoI酶切的pNZ5319質(zhì)粒用2×SoSoo Mix Plus試劑盒在50 ℃水浴連接15 min，得到pNZ-ef-gs重組質(zhì)粒。用上述同樣方法將ef-gx基因與SmaI酶切后的pNZ-ef-gs質(zhì)粒連接，得到pNZ-ef-gsx基因敲除質(zhì)粒，PCR驗證并測序[13-14]，流程見圖1。

1.3.5 唾液乳桿菌Δef-g菌株的制備

提取pNZ-ef-gsx重組質(zhì)粒，在電阻200 Ω、電容25 μF、電場強度2.5 kV/cm條件下[15]用電擊法導入唾液乳桿菌中，通過氯霉素和紅霉素抗性，多次傳代篩選陽性菌株，PCR、SDS-PAGE以及測序驗證唾液乳桿菌Δef-g菌株是否構(gòu)建成功。

1.3.6 唾液乳桿菌Δef-g對金黃色葡萄球菌體外黏附的影響

在600 nm波長下調(diào)整唾液乳桿菌、唾液乳桿菌Δef-g和金黃色葡萄球菌濃度均為1×109CFU/mL。通過黏液蛋白黏附模型方法在體外驗證唾液乳桿菌Δef-g促進金黃色葡萄球菌黏附的效果[16]。

實驗組1：取200 μL腸道黏液溶液于96 孔板中，4 ℃靜置過夜，次日分別加入200 μL唾液乳桿菌Δef-g菌液，4 ℃靜置過夜，加入200 μL PBST封閉1 h，PBST洗2 次，倒置風干，加入濃度1×109CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液，4 ℃孵育過夜。取200 μL腸道黏液溶液于96 孔板中，4 ℃靜置過夜，次日加200 μL PBST封閉1 h，PBST溶液洗2 次，倒置風干。實驗組2：同時加入濃度均為1×109CFU/mL的金黃色葡萄球菌和唾液乳桿菌Δef-g各100 μL，4 ℃孵育過夜。兩組均以等體積唾液乳桿菌菌液替代唾液乳桿菌Δef-g菌液為對照組。吸去孔板液體，PBST洗滌2 次，無水乙醇固定10 min，加入50 μL番紅染液染色，PBST洗滌1 次，倒置風干。用倒置顯微鏡觀察番紅染液染色情況，然后測定492 nm波長處測定OD值。

1.3.7 唾液乳桿菌Δef-g對金黃色葡萄球菌體內(nèi)黏附的影響

調(diào)整菌液濃度為1×109CFU/mL，用終濃度20 μmol/L cFDA-SE進行熒光標記[17]。

唾液乳桿菌Δef-g在小鼠腸道內(nèi)的黏附情況：取36 只小鼠，雌雄各半，隨機分成2 組，每組18 只，灌胃體積（以體質(zhì)量計算）0.1 mL/10 g；T1組灌胃熒光標記的唾液乳桿菌，T2組灌胃熒光標記的唾液乳桿菌Δef-g。

唾液乳桿菌Δef-g在體內(nèi)促進金黃色葡萄球菌黏附的效果：小鼠數(shù)量同上，灌胃體積0.1 mL/10 g。J1組灌胃未熒光標記的唾液乳桿菌和熒光標記的金黃色葡萄球菌，J2組灌胃未熒光標記的唾液乳桿菌Δef-g和熒光標記的金黃色葡萄球菌。

掃描電子顯微鏡直接觀察唾液乳桿菌Δef-g在體內(nèi)促進金黃色葡萄球菌黏附的效果：小鼠數(shù)量同上，灌胃體積0.1 mL/10 g，D1組灌胃均未熒光標記的唾液乳桿菌和金黃色葡萄球菌，D2組灌胃均未熒光標記的唾液乳桿菌Δef-g和金黃色葡萄球菌。

以上實驗小鼠均灌胃1 次，分別于灌胃后24、72、120 h，每組避光處死6 只小鼠，取小鼠結(jié)腸2 cm，用1 mL無菌PBS沖洗腸道內(nèi)壁，收集清洗后的PBS，過程中注意避光[18]。熒光倒置顯微鏡觀察熒光標記菌株數(shù)量，結(jié)果以每視野下菌株數(shù)量除以小鼠數(shù)量計。用紫外分光光度計測定熒光強度，發(fā)射波長518 nm、激發(fā)波長488 nm。掃描電子顯微鏡觀察時，將結(jié)腸組織用2.5%戊二醛固定（4 ℃、24 h），PBS無菌溶液清洗3 次。不同體積分數(shù)乙醇溶液梯度脫水，每次10 min，無水乙醇脫水2 次，醋酸異戊酯置換10 min，叔丁醇-無水乙醇（1∶1，V/V）置換10 min，再用叔丁醇I、II各置換20 min，－4 ℃冰箱過夜，噴金后用于觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌E. coli BL21（DE3）的制備及EF-G純化驗證結(jié)果

PCR擴增后1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，ef-g基因正確克隆。pET-ef-g重組質(zhì)粒導入E. coliBL21（DE3）中，卡那霉素篩選，PCR擴增1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。經(jīng)IPTG誘導重組E. coliBL21（DE3）菌株大量表達EF-G，EF-G蛋白分子質(zhì)量約為77 kDa，EF-G條帶位于66.4～97.2 kDa之間，表明EF-G正確表達。

2.2 EF-G對金黃色葡萄球菌黏附性的影響

番紅染液可以將細胞核染成紅色，菌黏附數(shù)量越多顏色越深，菌黏附數(shù)量越少顏色越淺。由圖2可知，加入0.15 mg/mL EF-G后金黃色葡萄球菌黏附數(shù)量明顯增多，表明EF-G促進了金黃色葡萄球菌的黏附。通過番紅染液對黏附性作初步評價，再通過測定OD492nm對黏附性變化進行定量分析。由圖3可知，先加入EF-G將金黃色葡萄球菌黏附率提高了43%（n=6，P＜0.05），同時加入EF-G使金黃色葡萄球菌黏附率提高了40%（n=6，P＜0.05），對比兩組結(jié)果，先加入EF-G時，金黃色葡萄球菌黏附數(shù)量更多，可能是因為EF-G是金黃色葡萄球菌黏附的特異性識別位點，EF-G與金黃色葡萄球菌混合加入時蛋白占據(jù)了金黃色葡萄球菌表面的黏附位點，使金黃色葡萄球菌黏附率降低。

圖2 EF-G對金黃色葡萄球菌黏附性的影響（番紅染液）Fig. 2 Effect of EF-G on the adhesion of S. aureus as examined by safranin staining

圖3 EF-G對金黃色葡萄球菌黏附性的影響結(jié)果（OD492 nm）Fig. 3 Effect of EF-G on the adhesion of S. aureus as reflected by optical density at 492 nm

2.3 pNZ-ef-gsx基因敲除載體的構(gòu)建及唾液乳桿菌Δef-g菌株的制備

pNZ-ef-gsx重組質(zhì)粒驗證結(jié)果顯示pNZ-ef-gsx敲除載體構(gòu)建成功。通過同源重組的方法將ef-g用氯霉素基因替換，先通過紅霉素抗性篩選，再通過氯霉素抗性篩選，多次傳代培養(yǎng)消除敲除載體，提取基因組，進行測序、PCR和SDS-PAGE驗證，圖4表明唾液乳桿菌Δef-g菌株構(gòu)建成功。

圖4 唾液乳桿菌Δef-g菌株構(gòu)建驗證結(jié)果Fig. 4 Construction and verification of L. salivarius Δef-g strain

2.4 唾液乳桿菌Δef-g對金黃色葡萄球菌體外黏附的影響

由圖5可知，唾液乳桿菌Δef-g組顏色較唾液乳桿菌組顏色淺，結(jié)果表明唾液乳桿菌Δef-g組黏附菌少。與番紅染色觀察結(jié)果一致，如圖6所示，與唾液乳桿菌相比，實驗組1的金黃色葡萄球菌黏附率降低了40%，實驗組2的金黃色葡萄球菌黏附率降低了34%，結(jié)果表明EF-G能夠促進金黃色葡萄球菌黏附。

圖5 唾液乳桿菌Δef-g對金黃色葡萄球菌體外黏附的影響（番紅染色）Fig. 5 Effect of L. salivarius Δef-g on the adhesion of S. aureus in vitro as observed by safranin staining

圖6 唾液乳桿菌Δef-g對金黃色葡萄球菌體外黏附的影響Fig. 6 Effect of L. salivarius Δef-g on the in vitro adhesion of S. aureus as reflected by optical density at 492 nm

2.5 唾液乳桿菌Δef-g對金黃色葡萄球菌體內(nèi)黏附的影響

2.5.1 唾液乳桿菌Δef-g體內(nèi)黏附實驗結(jié)果

對比圖7A、B可知，唾液乳桿菌Δef-g和唾液乳桿菌數(shù)量大致相同，表明EF-G對唾液乳桿菌黏附定植腸道沒有影響。

圖7 唾液乳桿菌Δef-g體內(nèi)黏附實驗顯微鏡觀察結(jié)果Fig. 7 Microscopic observation of L. salivarius Δef-g in vivo adhesion

2.5.2 唾液乳桿菌Δef-g促進致病菌黏附實驗結(jié)果

對比圖8A、B可知，唾液乳桿菌Δef-g組黏附金黃色葡萄球菌數(shù)量較唾液乳桿菌組少，表明唾液乳桿菌EF-G促進金黃色葡萄球菌黏附。

圖8 唾液乳桿菌Δef-g促進金黃色葡萄球菌黏附實驗顯微鏡觀察結(jié)果Fig. 8 Microscopic observation of L. salivarius Δef-g promotion of S. aureus adhesion

2.5.3 金黃色葡萄球菌黏附的定量分析結(jié)果

如圖9A、C所示，唾液乳桿菌和唾液乳桿菌Δef-g在小鼠腸道內(nèi)數(shù)量大致相同，結(jié)果表明ef-g基因?qū)ν僖喝闂U菌黏附定植腸道無影響；如圖9B、D所示，唾液乳桿菌組黏附金黃色葡萄球菌數(shù)量較唾液乳桿菌Δef-g組多，與唾液乳桿菌組相比，唾液乳桿菌Δef-g組金黃色葡萄球菌黏附率降低了20%，表明EF-G促進唾液乳桿菌黏附金黃色葡萄球菌。

圖9 唾液乳桿菌Δef-g對金黃色葡萄球菌體內(nèi)黏附影響的定量分析結(jié)果Fig. 9 Effect of L. salivarius Δef-g on the in vivo adhesion of S. aureus

2.5.4 掃描電子顯微鏡觀察唾液乳桿菌Δef-g體內(nèi)促金黃色葡萄球菌黏附效果

圖10 唾液乳桿菌Δef-g體內(nèi)促金黃色葡萄球菌黏附效果掃描電子顯微鏡圖Fig. 10 L. salivarius Δef-g promoted in vivo adhesion of S. aureus as observed by SEM

如圖10A～C所示，一個唾液乳桿菌可促進6～10 個金黃色葡萄球菌黏附于腸道表皮，如圖10D～F所示，一個唾液乳桿菌Δef-g可促進3～5 個金黃色葡萄球菌黏附于腸道表皮，更直觀地表明EF-G促進唾液乳桿菌黏附金黃色葡萄球菌。

3 討 論

定植是致病菌入侵人體腸道的第1步，乳酸菌通過與致病菌競爭細胞黏附位點，從而發(fā)揮其抗感染的作用，然而有研究表明這種通過競爭黏附位點抑制致病菌的黏附，反而會促進致病菌的黏附[19]，Tuomola等[20]也報道了兩株鼠李糖乳桿菌將沙門氏菌的黏附率提高至190%和332%，但具體機制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌膜外蛋白中，具有黏附性的蛋白不一定是已發(fā)現(xiàn)的Slp，還可能是MAPP、EF-Tu、EF-G等[21-22]。EF是乳酸菌膜外蛋白，主要有2 個功能：黏附作用以及作為血纖維蛋白溶酶發(fā)揮結(jié)合蛋白的功能[23-24]。Munro[25]和Palmer[26]等發(fā)現(xiàn)EF-G對于Caco-2細胞也有很好的黏附作用。

本課題組前期研究[27]對唾液乳桿菌表面蛋白進行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，EF-G評分最高，且匹配的肽段最多，其中發(fā)揮黏附功能可能是EF-G，因此本實驗選取EF-G進行研究。本實驗結(jié)果表明，EF-G在體外能夠促進金黃色葡萄球菌的黏附，黏附率較對照組提高了43%；在小鼠腸道內(nèi)唾液乳桿菌Δef-g組金黃色葡萄球菌黏附率較唾液乳桿菌組降低了20%，結(jié)果表明EF-G對金黃色葡萄球菌的黏附具有促進作用，體內(nèi)外實驗結(jié)果相差較大，可能是由于小鼠體內(nèi)環(huán)境復雜，也可能是EF-G缺少影響了唾液乳桿菌生物活性，從而減少了金黃色葡萄球菌黏附，掃描電子顯微鏡結(jié)果也進一步證實了這一結(jié)論。

本實驗結(jié)果證明唾液乳桿菌膜外蛋白中確實存在可以促進金黃色葡萄球菌黏附的蛋白，這與王迪[16]的研究結(jié)果一致，但是膜外蛋白促進金黃色葡萄球菌黏附的具體機制還不明確，可能是膜外蛋白中存在金黃色葡萄球菌的黏附位點[28]，也可能是膜外蛋白通過其他作用力促進了金黃色葡萄球菌黏附[29]，促進黏附的具體機制還需進一步探究。