陳威風(fēng)，崔麗偉，常惟丹，朱龍佼，許文濤*

1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450046；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系，北京100083

金黃色葡萄球菌是自然界中最常見的導(dǎo)致細(xì)菌性食物中毒的病原菌之一［1-2］。該菌可寄居于人類的皮膚、鼻孔和胃腸道。食品生產(chǎn)一線的無癥狀工作人員可通過手部接觸或呼吸道分泌物污染食物。該菌本身不致病，但在20～37 ℃條件下由其分泌的腸毒素會引起食物中毒［3-5］。金黃色葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）經(jīng)典類型有SEA、SEB、SEC、SED、SEE，后來又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的有SEG、SHE、SEI、SER、SES、SET、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEU 等［6-8］。其中由SEA 和SEB 引起的食物中毒最常見，其次是SED、SEC和SEE［9-12］。

SEs 比較耐熱，一般的滅菌方式（100 ℃，30 min）無法使其滅活［13］。SEs 性質(zhì)穩(wěn)定，具有顯著耐熱耐酸性，進(jìn)入人體的消化系統(tǒng)后，會引起胃腸炎，導(dǎo)致惡心、腹部疼痛痙攣、出汗和休克等癥狀，由SEs 引起的食物中毒現(xiàn)象引起了社會的廣泛關(guān)注［14-15］。國內(nèi)外用于檢測SEs 的有效方法主要包括色譜法［16］、分子生物學(xué)方法［17-18］以及免疫學(xué)檢測方法［19-20］。然而，利用以上3 種方法對SEs檢測的前提是需要獲得高純度的SEs 標(biāo)準(zhǔn)蛋白，而目前SEs 蛋白的獲取方式主要依靠大規(guī)模菌株培養(yǎng)，這種制取方式需要經(jīng)過復(fù)雜的提純過程，同時還需對提取產(chǎn)物進(jìn)行鑒定等步驟［21-22］。為了能夠更加高效地制備腸毒素純品，張琨等［21］將SEB基因克隆至pET-22b 載體中進(jìn)行表達(dá)，然后通過Ni 柱親和層析和DEAE 陰離子層析柱兩步純化，獲得了表達(dá)量為95.2%的SEB 蛋白。李飛等［23］通過構(gòu)建pET-28a（+）-SEB 融合表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)入BL21 表達(dá)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量較高，但未生成可溶性蛋白。盡管前人利用基因工程的方法制備了腸毒素純品，但都是針對某一種蛋白，而葡萄球菌食物中毒往往不是由單一毒素引起的，如果一次反應(yīng)能同時檢測多種腸毒素將大大減少葡萄球菌食物中毒分析的工作量。因此，為了達(dá)到同步檢測多種毒素的目的，需要首先制備多種腸毒素樣品，為了高效地制備多種腸毒素純品，解決SEs的來源困難問題，本實驗擬擴增SEA～SEE 5種腸毒素基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過親和柱進(jìn)行純化，為進(jìn)一步建立相應(yīng)的快速檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E.coilBL21（DE3）、E.coilTop10、pET-22b 質(zhì)粒、氨芐青霉素鈉（Amp）、異丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）、Ni-NTA瓊脂糖純化樹脂、咪唑、乙二胺四乙酸（EDTA）、二硫蘇糖醇（DTT）、谷胱甘肽（GSSG/GSH）、T4 DNA 連接酶、柱式DNA 膠回收試劑盒、限制酶NcoⅠ、XhoⅠ、一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒、質(zhì)粒DNA 抽提試劑盒、離心式蛋白純化空柱、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、6X 甘油凝膠上樣緩沖液等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-21M高速冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；VORTEX-5 渦旋振蕩器（上海達(dá)姆實業(yè)有限公司）；KW-1000DC 電熱恒溫水浴鍋（金壇市希望儀器有限公司）；ZWY-2102C 恒溫培養(yǎng)搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）；SW-CJ-2F 超凈工作臺（薊州凈化儀器有限公司）；DYY-6C 電泳儀（北京市六一儀器廠）；JY-SPC 電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；Tanon 1600凝膠成像分析系統(tǒng)（北京原平皓生物技術(shù)有限公司）；LHS-250 智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱（鄭州生元儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 SEs 序列的合成 從NCBI 基因數(shù)據(jù)庫中查閱SEA～SEE 基因序列，在其兩端增加NcoⅠ、XhoⅠ兩個酶切位點，合成兩端帶有酶切位點的基因序列。

1.3.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 將合成的SEA～SEE 基因產(chǎn)物和載體pET-22b（+）在各自的酶切體系下，于37 ℃的恒溫水浴鍋中分別用NcoⅠ、XhoⅠ酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)2 h，用柱式DNA 膠回收試劑盒回收SEA～SEE 目的片段和載體，之后利用T4 DNA連接酶在16 ℃下的連接體系下混合。將連接液轉(zhuǎn)入到Top10 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含0.1%Amp的LB平板培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.3.3 篩選陽性克隆 挑取白色菌落，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃120 r·min-1搖床充分振蕩培養(yǎng)16 h。用限制酶NcoⅠ、XhoⅠ對陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證，用質(zhì)粒DNA 抽提試劑盒提取質(zhì)粒并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 分別取200 μL 菌液于10 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，加入Amp，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)的BL21（DE3）菌液接種到150 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，加入Amp，16 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），然后分別置于16 ℃和37 ℃振蕩培養(yǎng)。

1.3.5 可溶性目的蛋白的純化 離心誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物，棄上清，向沉淀中加入蛋白質(zhì)提取試劑，用槍頭反復(fù)拍打使其形成均勻的不粘稠懸液后，置于恒溫?fù)u床上振蕩20 min。振蕩后的濁液離心2 次，收集上清液作為可溶性目的蛋白部分。重復(fù)首次離心后的步驟2～3次，將多次上清液合并，以提高可溶性蛋白的提取率。將約3 mL 瓊脂糖純化樹脂小心裝入離心式蛋白層析空柱中，避免產(chǎn)生氣泡，靜置均勻后加入8 倍柱體積的平衡緩沖液A 平衡Ni2+柱；將樣品溶液少量多次地加入層析柱中，使其充分與填料結(jié)合。然后多次分別加入不同濃度的咪唑緩沖液洗脫雜蛋白；最后換收集管，加入5 倍柱體積的洗脫液洗脫目的蛋白并進(jìn)行收集。將純化后的目的蛋白于透析袋中去除咪唑。然后進(jìn)行15% SDS-PAGE 凝膠電泳。

1.3.6 Western blot 實驗 SDS-PAGE 電泳后，將表達(dá)的重組蛋白SEA～SEE 轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上，4 ℃下，經(jīng)5%脫脂奶和1%BSA 的TBST 封閉液封閉過夜、漂洗后，加入1∶500 稀釋的抗His-Tag 抗體孵育，4 ℃過夜。漂洗后，加入1∶10 000 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，放入恒溫振蕩搖床緩慢振蕩50 min，漂洗后，加入底物，5 min 顯色后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中查詢SEA～SEE 基因序列，5種腸毒素基因序列測序結(jié)果表明，SEA、SEB、SEC、SED、SEE 基因序列全長分別為774、798、816、576、639 bp。重組質(zhì)粒經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，產(chǎn)物電泳后在預(yù)期位置處有明顯目的基因條帶（箭頭所示），大小與預(yù)期相符，質(zhì)粒pET-22b 大小與理論值一致（圖1）。后經(jīng)測序顯示，SEA、SEB、SEC、SED、SEE 基因成功構(gòu)建到表達(dá)載體中。

圖1 腸毒素A、B、C、D、E重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果Fig.1 The results of double enzyme digestion of enterotoxin A,B,C,D,E recombinant plasmids

2.2 目的蛋白的表達(dá)及鑒定

2.2.1 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 通過SDS-PAGE 結(jié)果顯示，與陰性對照相比，含有重組質(zhì)粒的宿主菌經(jīng)1 mmol·L-1的IPTG 誘導(dǎo)后有明顯的蛋白表達(dá)條帶（圖2），與預(yù)期值一致，初步證明目標(biāo)蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。通過對比，在較低的溫度（16 ℃）下，目標(biāo)蛋白條帶更明顯，表明16 ℃條件更有利于目的基因的表達(dá)。

圖2 SEA、SEB、SEC、SED、SEE表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of SEA,SEB,SEC,SED,SEE expression products

2.2.2 SDS-PAGE 純化結(jié)果分析 為了得到腸毒素A、B、C、D、E的純品，本實驗對誘導(dǎo)后的產(chǎn)物進(jìn)行了純化，通過對純化后的目的蛋白進(jìn)行凝膠電泳驗證，結(jié)果顯示，SEA、SEB、SEC、SED、SEE 分別在約32、31、32、22、30 kD 處有明顯的亮帶（圖3），目標(biāo)條帶較為單一，其大小與預(yù)期值相符，再次證明目標(biāo)蛋白被成功表達(dá)。

圖3 目標(biāo)蛋白SEA、SEB、SEC、SED、SEE 的SDS-PAGE驗證結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE verification results of target protein SEA,SEB,SEC,SED,SEE

2.2.3 Western blot 實驗分析 為了進(jìn)一步驗證目標(biāo)蛋白是否被表達(dá)，本研究進(jìn)行了Western blot實驗，如圖4顯示，目標(biāo)蛋白在預(yù)期條帶位置有條帶出現(xiàn)，表明5 種目標(biāo)蛋白均能夠被成功表達(dá)出來。

圖4 目標(biāo)蛋白SEA、SEB、SEC、SED、SEE的Western blot驗證結(jié)果Fig.4 Western blot verification results of target protein SEA,SEB,SEC,SED,SEE

3 討論

金葡萄球菌腸毒素一旦污染食物鏈將對人們的身體健康造成嚴(yán)重威脅。因此，研究和開發(fā)金黃色葡萄球菌腸毒素快速檢測技術(shù)是當(dāng)前食品安全與控制領(lǐng)域的迫切需求之一，盡管目前用于檢測SEs的方法較多，但都有其局限性，而且大部分是針對單一類型的腸毒素進(jìn)行分析，關(guān)于同時快速分析多種SEs 的方法報道較少，而一次反應(yīng)能同時檢測多種SEs 也可以大大減少食物中毒分析過程的工作量。腸毒素純品是建立在快速檢測方法的基礎(chǔ)上，傳統(tǒng)制備腸毒素的方法主要是從產(chǎn)腸毒素菌株中分離純化而來，這種方法純化效率較低。本研究通過構(gòu)建SEA～SEE 5 種腸毒素基因的重組表達(dá)載體，實現(xiàn)對5 種目的蛋白的表達(dá)和純化。表達(dá)載體的選擇對于目的蛋白的順利表達(dá)至關(guān)重要，pET-22b 載體含有PelB 信號肽序列，能夠?qū)⒈磉_(dá)的目的蛋白定位于細(xì)胞外周質(zhì)腔中，本實驗選擇pET-22b 作為表達(dá)載體，成功地表達(dá)出了5 種腸毒素的可溶性蛋白，通過SDS-PAGE和Western blot 結(jié)果可以看出，盡管均有表達(dá)，但是表達(dá)量存在差異。溫度是影響可溶性蛋白表達(dá)的主要因素之一，37 ℃的表達(dá)條件可以快速制備大量的目的蛋白，但是常常會使一些蛋白累積形成包涵體，而在較低的誘導(dǎo)溫度（16 ℃）下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，可以獲得一定量的可溶性蛋白，由此證明，16 ℃更有利于可溶性活性蛋白的表達(dá)。本研究在一定程度上解決了多種腸毒素標(biāo)準(zhǔn)品來源困難的問題，為以后開發(fā)腸毒素的快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。