彭湘，陳麗，薛琳

（攀枝花市中心醫(yī)院 腎病內(nèi)科，四川 攀枝花617067）

糖尿病腎病是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，也是終末期腎病的主要原因[1]。臨床以早期腎小球、腎小管肥大，晚期腎小球硬化、纖維化等復雜的結(jié)構(gòu)改變?yōu)樘攸c[2]。腎臟的氧化應激、炎癥反應及代謝異常是腎功能惡化的主要原因[3]。腎臟活性氧過多和代謝異常會導致細胞蛋白激酶C 亞型活化[4]，以及細胞核因子-κB（NF-κB）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）過度表達，這些異常的炎癥反應最終導致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化[5]。TGF-β1作為一種與腎纖維化密切相關的細胞因子，可激活腎小管上皮細胞蛋白激酶C 和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終導致腎間質(zhì)纖維化[6]。Toll 樣受體在腎炎的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用[7]。Toll 樣受體可通過激活NF-κB和髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor, MyD88）產(chǎn)生炎癥細胞因子，包括IL-8、IL-6等[8]，在這個過程中，MyD88 起到了腎臟炎癥的放大作用[9]。薏苡仁提取物（Coix seed extract, CES）為禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁提取物，可有效促進新陳代謝，具有促進體內(nèi)血液和水分的新陳代謝、利尿、消水腫等作用[10]。藥理研究表明，CSE 對2 型糖尿病大鼠具有抗氧化和降血糖的生物活性。同時，還有利于糖尿病腎病的腎臟修復，其生物活性與其調(diào)節(jié)血糖、血脂水平及改善腎功能有關[11]。本研究通過復制糖尿病腎病大鼠模型，探討CSE 保護糖尿病腎病大鼠腎臟功能的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑

本研究根據(jù)國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》進行。50 只雄性SPF 級Wistar 大鼠購自浙江省農(nóng)業(yè)科學院[生產(chǎn)許可證：SCXK（浙）2017-0001]。薏苡仁標本由海南醫(yī)學院田建平教授惠贈。兔抗鼠一抗TGF-β1購自英國Abcam 公司，兔抗鼠一抗MyD88 購自美國BioWorld 公司，山羊抗兔二抗IgG 購自英國Abcam 公司。

1.2 CSE的制備

用95%乙醇回流提取1.2 kg 干粉和磨碎的薏苡仁浸膏2 h，將浸出物合并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，再將提取物在80℃真空干燥爐中干燥，獲得102.3 g的薏苡仁提取物，4℃的冰箱中保存供實驗使用。

1.3 實驗方法

大鼠飼養(yǎng)環(huán)境室溫（23±2）℃，相對濕度50%～60%，光照條件：12 h 晝/夜循環(huán)照明。采用單次腹腔注射50 mg/kg 鏈脲佐菌素（STZ）復制糖尿病大鼠模型，注射3 d 后，從大鼠尾靜脈采集血樣，檢測血糖水平。血糖＞250 mg/dL（13.88 mmol/L）的大鼠被認為是糖尿病模型復制成功。以10 只正常大鼠作為對照組（ND 組），剩余40 只糖尿病大鼠隨機分為4 組：糖尿病組（STZ 組）、格列齊特組（GLI 組）、CSE 低劑量組（CSE-L 組） 及高劑量組（CSE-H組），每組各10 只。STZ 組模型復制后給予等量蒸餾水灌胃；GLI 組給予5 mg/kg 格列齊特灌胃；CSE-L組給予400 mg/kg 的CSE 灌胃；CSE-H 組給予800 mg/kg 的CSE 灌胃。將CSE 溶于10%吐溫80溶液中，據(jù)預實驗結(jié)果設定400 mg/kg 的CSE-L 組和800 mg/kg 的CSE-H 組，這兩個劑量是中藥藥效學研究中常用的劑量。所有治療間隔時間為3 d/次，干預6 周。實驗期間所有動物均可自由進食標準大鼠飼料。6 周末將所有大鼠放入代謝籠中進行24 h 尿液采集。所有動物稱重后麻醉，經(jīng)股動脈采集血標本，頸椎脫臼處死大鼠。取右腎稱重，用冷等滲鹽水沖洗，置入-80℃冰箱冷凍保存，進行生化檢測和Western blotting 分析，左腎置于10%甲醇固定，用做組織學檢查。

1.4 腎臟組織學檢查

處死大鼠后，完整取出腎臟并稱重。腎組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成4 μm 切片?？酒?，冷卻后低溫凍存。經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化。蘇木精染色30～60 s，沖洗5 min，伊紅染色30 s，沖洗5 min；乙醇梯度脫水，干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干，光學顯微鏡下觀察。

1.5 24 h尿蛋白和血液生化指標的檢測

6 周末時，取每只大鼠24 h 尿液，3 000 r/min離心5 min，采用南京建成生物工程研究所試劑盒對尿蛋白進行測定。于1 周、3 周、6 周時取大鼠尾靜脈血，用1906-05 血糖儀檢測空腹血糖水平。血樣在4℃、7 000 r/min 離心10 min，獲取血漿樣本。血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、谷胱甘肽（GSH）檢測采用南京建成生物工程研究所試劑盒。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒檢測大鼠腎組織中白細胞介素-6（IL-6）水平。

1.6 Western blotting檢測

腎皮質(zhì)用RIPA 緩沖液（pH=7.5）溶解。在10%SDS-PAGE 上（100 V，1.5 h）分離等量的蛋白質(zhì)，在冰冷條件下轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5%脫脂乳在含0.1%吐溫20 的緩沖液中封閉1 h，并在4℃、兔抗鼠一抗TGF-β1（1∶500 稀釋）和兔抗鼠一抗MyD88（1∶500 稀釋）中孵育過夜。用含吐溫20 的Tris 緩沖液洗滌后，與辣根過氧化物酶（HRD）偶聯(lián)的山羊抗兔二抗IgG 共同孵育2 h。將膜放置在Bio-Rad Chemi Doc XRS +化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)上，以GAPDH 作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 軟件。計量資料均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較Dunnet-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織學檢查結(jié)果

病理學檢查結(jié)果顯示，ND 組大鼠腎組織形態(tài)正常，腎皮質(zhì)與髓質(zhì)組織邊界清晰。腎小管上皮細胞排列緊密，未見明顯炎癥反應。STZ 組大鼠腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)可見大量空泡和腫脹，腎小管周圍有較多炎癥細胞浸潤和組織增生。GLI 組、CSE-L 組和CSE-H 組腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，腎皮質(zhì)與髓質(zhì)組織邊界清晰，偶見腎小管上皮細胞胞漿空泡化。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織學檢查結(jié)果 （蘇木精-伊紅染色×200）

2.2 各組大鼠不同時間空腹血糖的比較

各組大鼠不同時間空腹血糖水平的比較，經(jīng)重復測量設計的方差分析，結(jié)果：①各組大鼠在1 周、3 周、6 周的空腹血糖水平差異有統(tǒng)計學意義（F=24.768，P=0.000），6 周時的空腹血糖水平低于1 周、3周時的空腹血糖水平（P＜0.05）。②各組大鼠的空腹血糖水平差異有統(tǒng)計學意義（F=14.308，P=0.000），STZ組空腹血糖水平高于ND組（P＜0.05），CSE-L組、CSE-H 組空腹血糖水平低于STZ 組（P＜0.05）。③各組大鼠空腹血糖水平的變化趨勢差異有統(tǒng)計學意義（F=32.253，P=0.000）。見表1。

表1 各組大鼠不同時間空腹血糖的比較（n=10，mmol/L，±s）

表1 各組大鼠不同時間空腹血糖的比較（n=10，mmol/L，±s）

組別ND組STZ組GLI組CSE-L組CSE-H組1周6.69±1.12 33.09±0.58 29.56±2.24 30.79±4.31 25.72±2.04 3周6.12±1.18 22.23±4.05 16.71±7.85 14.88±6.67 22.10±5.45 6周5.16±0.86 21.28±5.36 9.91±2.15 9.24±2.78 10.89±6.28

2.3 各組大鼠24 h尿蛋白含量、初始體重、最終體重和腎臟重量的比較

各組大鼠24 h 尿蛋白含量、初始體重、最終體重比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），STZ 組24 h 尿蛋白水平高于ND 組（P＜0.05），初始體重、最終體重低于ND 組（P＜0.05），CSE-L 組、CSE-H 組24 h 尿蛋白水平低于STZ 組，初始體重、最終體重高于STZ 組（P＜0.05）。各組大鼠腎臟重量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠24 h尿蛋白含量、初始體重、最終體重和腎臟重量的比較 （n=10，±s）

表2 各組大鼠24 h尿蛋白含量、初始體重、最終體重和腎臟重量的比較 （n=10，±s）

組別ND組STZ組GLI組CSE-L組CSE-H組F 值P 值24 h尿蛋白/（μg/24 h）2 102.0±732.4 3 491.5±1 965.2 241.6±225.8 1 632.5±492.7 1 433.8±433.9 14.300 0.000初始體重/g 238.6±81.8 202.4±18.2 213.6±9.7 203.5±15.4 218.5±8.3 3.340 0.029最終體重/g 384.5±34.2 165.3±20.2 205.7±16.3 209.6±4.2 214.5±7.5 189.900 0.000腎臟重量/g 1.16±1.10 0.92±0.09 1.03±0.07 1.03±0.09 1.04±0.09 0.815 0.521

2.4 各組大鼠腎功能參數(shù)的比較

各組大鼠腎功能參數(shù)的比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。STZ 組Scr、BUN、TC、HDL-C 及IL-6 水平高于ND 組（P＜0.05）；CSE-H組Scr、BUN、TG、TC、HDL-C、GSH 及IL-6 水平低于STZ 組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠腎功能參數(shù)的比較 （n=10，±s）

表3 各組大鼠腎功能參數(shù)的比較 （n=10，±s）

組別ND組STZ組GLI組CSE-L組CSE-H組F 值P 值Scr/（μmol/L）90.13±4.91 125.43±7.06 112.58±12.39 140.83±8.36 107.87±11.69 9.058 0.000 BUN/（nmol/L）4.61±0.98 13.65±3.55 9.78±2.45 13.05±2.58 9.54±2.39 4.252 0.008 TG/（mmol/L）0.07±0.05 0.20±0.05 0.13±0.08 0.12±0.06 0.08±0.01 3.184 0.024 TC/（mmol/L）1.63±0.30 3.89±0.69 2.25±0.22 2.09±0.43 1.53±0.22 5.644 0.002 HDL-C/（mmol/L）0.59±0.12 1.28±0.18 0.80±0.15 1.07±0.13 0.86±0.09 5.524 0.003 GSH/（μmol/L）21.21±0.38 22.90±1.22 19.08±1.45 21.87±1.78 19.12±1.58 1.264 0.041 IL-6/（μg/mL）44.45±5.12 155.35±36.11 52.26±15.86 93±21.34 72.42±14.45 6.234 0.003

2.5 各組大鼠腎組織中TGF-β1和MyD88 蛋白相對表達量的比較

各組大鼠腎組織中TGF-β1和MyD88 蛋白相對表達量的比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），STZ 組腎組織中TGF-β1蛋白相對表達量高于ND 組（P＜0.05），MyD88 蛋白相對表達量低于ND 組（P＜0.05）；CSE-H 組腎組織中TGF-β1蛋白相對表達量低于STZ 組，MyD88 蛋白相對表達量高于STZ 組（P＜0.05）。見表4 和圖2。

圖2 各組大鼠的TGF-β1和MyD88蛋白相對表達量

表4 各組大鼠腎組織中TGF-β1和MyD88蛋白相對表達量的比較 （n=10，±s）

表4 各組大鼠腎組織中TGF-β1和MyD88蛋白相對表達量的比較 （n=10，±s）

組別ND組STZ組GLI組CSE-L組CSE-H組F 值P 值TGF-β1蛋白0.38±0.12 0.84±0.21 0.42±0.15 0.48±0.18 0.79±0.20 15.436 0.000 MyD88蛋白0.85±0.24 0.61±0.16 1.02±0.12 0.87±0.21 0.63±0.18 12.132 0.000

3 討論

本研究采用STZ 復制糖尿病腎病模型，觀察CSE 對糖尿病大鼠腎臟損傷的保護作用，并通過檢測血清中多種生化指標及腎組織中TG-β1和MyD88蛋白的相對表達量，觀察其對腎臟的生物學效應。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非糖尿病大鼠相比，糖尿病大鼠的空腹血糖水平明顯升高，體重明顯下降。不同劑量的CSE 干預均能顯著降低糖尿病大鼠的血糖和尿蛋白水平，改變Scr、BUN、TG、TC、HDL-C、GSH 及IL-6 水平。以上結(jié)果提示，CSE 降血糖的作用可能與其改善糖脂代謝有關。糖脂代謝紊亂可引起腎臟局部血流動力學改變，導致腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化，發(fā)展為糖尿病腎病[12]。之前研究表明，CSE 可調(diào)節(jié)糖脂代謝異常，預防糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[13]。進一步說明其在治療高脂血癥等領域的潛在臨床價值。糖尿病腎病的早期癥狀主要表現(xiàn)為微量白蛋白尿，病理改變主要表現(xiàn)為腎小球肥大、腎小球細胞外基質(zhì)積聚、基底膜增厚，最后發(fā)展為腎小球硬化和纖維化[14]。在臨床研究中，糖尿病患者一旦出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿癥狀，將不可避免地進展為終末期腎病[15]。糖尿病腎病已成為糖尿病患者重要的死亡原因，因此，研究糖尿病腎病的發(fā)病機制和預防方法具有重要意義[16]。然而，由于糖尿病腎病病因的復雜性，糖尿病腎病發(fā)生的分子機制尚不清楚。CES 常被用來治療消化不良、利尿、炎癥和腸道疾病，主要利用其溫腎、護精止尿、溫脾止瀉的作用。另有研究表明，CSE能降低DN 大鼠的血糖，改善腎功能[17]。

預防糖尿病腎病進展是一項具有挑戰(zhàn)性的臨床目標。細胞因子IL-6 在糖尿病的發(fā)病機制中起重要作用[18]。本研究中，糖尿病組大鼠IL-6 水平升高，CSE 治療6 周后，CSE 組IL-6 水平下降。TGF-β信號通路與機體的各種病理變化密切相關，TGF-β被認為是慢性腎臟病的重要致病因素[19]。TGF-β 水平降低可減少DN 的基質(zhì)降解，誘導足細胞、腎小管上皮細胞和內(nèi)皮細胞凋亡[20]。糖尿病腎組織中TGF-β 的表達增加與腎纖維化有關，抑制其表達可減輕糖尿病動物模型的纖維化[21]。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在糖尿病腎病大鼠腎組織中的表達增加，CSE 800 mg/kg 可明顯抑制DN 大鼠腎組織TGF-β1的上調(diào)，提示高劑量CSE 可能具有減輕DN 腎纖維化的潛在作用。TLR 介導的信號可誘導多種炎癥因子，如IL-1、IL-6、TGF、TNF，從而導致糖尿病腎病大鼠腎小球系膜增生和細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[22]。MyD88 是Toll 樣受體信號通路中的一個關鍵配體[23]，在傳遞上游信息和疾病發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用，本質(zhì)上是一種胞質(zhì)可溶性蛋白，其在先天性和適應性免疫應答中起關鍵作用[24]。同時在白細胞介素和Toll 樣受體信號轉(zhuǎn)導通路中起著至關重要的信號轉(zhuǎn)導作用，該途徑調(diào)節(jié)了許多促炎基因的激活[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，CSE 可提高MyD88 水平，明顯改善腎功能，抑制IL-6 的表達，降低血糖水平，減輕腎臟纖維化和炎癥，這可能是其減輕腎臟炎癥的原因之一[26]。Western blotting 結(jié)果顯示，CSE激活腎臟中的TGF 和Toll 樣受體信號通路。這兩條信號通路可減輕腎間質(zhì)纖維化和腎小管上皮細胞凋亡，從而減少炎癥因子的產(chǎn)生，保護腎功能。

綜上所述，CSE 可抑制糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化進程和炎癥反應，具有良好的腎臟保護作用。