孫曉穎，鄺斌，羅志建，李明星

（1.德陽市人民醫(yī)院 超聲科，四川 德陽618000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 超聲科，四川 瀘州646000）

腎臟缺血再灌注損傷是指腎臟在經(jīng)過一段沒有或缺少有效血液循環(huán)的時間后重新獲得有效的血液循環(huán)，原本能恢復其正常的結構和功能，但卻出現(xiàn)加重損傷的反?，F(xiàn)象，這在臨床中常發(fā)生，發(fā)生率和病死率逐年增加[1-3]。地塞米松是一種強有效的人工合成的皮質類固醇激素，能減輕腎臟缺血再灌注損傷[4-6]。超聲造影是指利用超聲造影劑微泡的強回聲散射來提高超聲對低速血流探測的敏感性，可以定量反映組織微循環(huán)的改變[7]。本研究擬用超聲造影監(jiān)測地塞米松治療大鼠腎臟缺血再灌注損傷，分析不同時間段內及藥物干預后超聲造影時間-強度曲線（time-intensity curve, TIC）的各參數(shù)，探討各參數(shù)是否能反映TIC 的變化，以期為后續(xù)腎臟缺血再灌注損傷相關疾病治療的療效評估提供一個簡便的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8 周齡健康雄性SD 大鼠72 只，體重180～220 g（由西南醫(yī)科大學動物實驗中心提供），隨機分為假手術組、缺血再灌注組、地塞米松組，每組24 只。3 組大鼠分別于再灌注后1 d、3 d、5 d、7 d 進行實驗，每次各6 只。

1.2 主要試劑及儀器

10%水合氯醛（規(guī)格1 mL∶100 mg，購自武漢雙鶴公司），地塞米松（規(guī)格1 mL∶5 mg，購自上海碧云天生物技術有限公司），注射用六氟化硫微泡（聲諾維）（瑞士Bracco Imaging B.V.公司生產，上海博萊科信誼有限責任公司分裝，注冊證號H20080059，規(guī)格：59 mg 六氟化硫），10%的中性甲醛（購自上海碧云天生物技術有限公司）。西門子ACUSON S3000 超聲診斷儀，配9L4 變頻線陣探頭（德國西門子公司）；美國貝克曼庫爾特AU5800 全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的復制 大鼠雙腎區(qū)剃毛，碘伏消毒，10%水合氯醛（2 mL/kg）腹腔注射麻醉。假手術組：術前1 h 腹腔注射等量的0.9%的生理鹽水，采用2.0 mm 手術線結扎大鼠右側腎蒂后切除右側腎臟，分離左側腎蒂但不進行鉗夾處理；缺血再灌注組：術前1 h 腹腔注射等量的0.9%的生理鹽水，切除右側腎臟，動脈夾夾閉左側腎蒂，缺血45 min 后松開動脈夾進行再灌注，恢復血液供應后再將其還納至腹腔并縫合切口；地塞米松組：術前1 h 腹腔注射地塞米松（4 mg/kg），再按缺血再灌注組處理。

1.3.2 超聲造影檢查 分別于再灌注后1 d、3 d、5 d、7 d 4 個時間點麻醉3 組大鼠，獲取大鼠左側腎臟最大冠狀切面，進入造影模式，設定相關參數(shù)：頻率4.0 MHz、深度4 cm、機械指數(shù)（MI）0.1。經(jīng)大鼠尾靜脈快速注入聲諾維0.4 mL/kg，隨即立刻注射0.2 mL 的生理鹽水沖洗，同時啟動超聲診斷儀內置的計時器及錄像，同步連續(xù)采集3 min 動態(tài)圖像。選擇腎門正對處最外層的皮質作為感興趣區(qū)域（region of interest, ROI），設置面積為0.05 mm2的橢圓形放置于此，繪制TIC 曲線，觀察和分析TIC曲線中峰值強度（peak intensity, Peak）、達峰時間（time to peak, TP）、平均通過時間（mean transit time,MTT）及曲線下面積（area under the curve, AUC），所有參數(shù)均測量3 次取平均值。

1.3.3 血肌酐、尿素氮水平檢測 超聲造影檢查結束后，真空采血管取大鼠下腔靜脈血2 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液，送西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，采用貝克曼庫爾特AU5800 全自動生化分析儀檢測血肌酐及尿素氮水平。

1.3.4 腎臟病理檢測 取血結束后，行脊椎脫臼法處死大鼠，快速取大鼠左腎臟，切取1/2 腎臟組織，石蠟包埋，石蠟切片（厚度4 μm）后HE 染色進行病理檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用析因設計的方差分析和單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠腎皮質TIC曲線各參數(shù)比較

假手術組TIC 曲線表現(xiàn)為迅速達到高峰后又迅速下降至基礎水平，缺血再灌注組與假手術組相比上升和下降速度均有減慢，其中以下降速度減慢最為明顯，而地塞米松組TIC 曲線上升和下降速度均加快（見圖1）。3 組大鼠的腎皮質TIC 曲線各參數(shù)比較，經(jīng)析因設計的方差分析，結果：①再灌注后不同時間點的Peak、TP、MTT、AUC 有差異（F=5.285、166.015、76.977 和54.733，P=0.003、0.000、0.000 和0.000）；②3 組大鼠的Peak、TP、MTT、AUC 有差異（F=17.422、1 034.731、217.961 和170.200，均P=0.000）；③3 組大鼠的Peak、TP、MTT、AUC 隨再灌注后不同時間的變化趨勢有差異（F=3.624、35.752、16.400 和28.800，P=0.004、0.000、0.000 和0.000）。進一步兩兩比較，采用LSD-t檢驗，結果：缺血再灌注與假手術組比較，再灌注后1 d、3 d 缺血再灌注組Peak、AUC 均大于假手術組，TP、MTT 長于假手術組（P＜0.05），再灌注后5 d、7 d 缺血再灌注組Peak 值與假手術組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），AUC 均大于假手術組，TP、MTT 長于假手術組（P＜0.05）；地塞米松組與缺血再灌注組比較，再灌注后1 d、3 d、5 d、7 d 地塞米松組的TP 短于缺血再灌注組（P＜0.05），再灌注后1 d、3 d、7 d 地塞米松組的MTT短于缺血再灌注組（P＜0.05），再灌注后1 d、3 d、5 d、7 d 地塞米松組的AUC 小于缺血再灌注組（P＜0.05）；缺血再灌注組Peak、TP、MTT、AUC均在再灌注后3 d 達到最大值，隨后逐漸降低，再灌注后7 d 達到最低值，但僅4 個時間點的TP 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），再灌注后5 d、7 d 的Peak、TP、MTT、AUC 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；假手術組組內4 個時間點的Peak、TP、MTT、AUC 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 各組大鼠腎皮質血流灌注TIC曲線

表1 各組大鼠腎皮質TIC曲線各參數(shù)比較 （n=6，±s）

表1 各組大鼠腎皮質TIC曲線各參數(shù)比較 （n=6，±s）

注：①與假手術組比較，P ＜0.05；②與缺血再灌注組比較，P ＜0.05；③與缺血再灌注組再灌注后1 d比較，P ＜0.05；④與缺血再灌注組再灌注后3 d比較，P ＜0.05；⑤與缺血再灌注組再灌注后5 d比較，P ＜0.05。

組別假手術組再灌注后1 d Peak/%48.21±3.53 TP/s 16.38±0.76 MTT/s 35.46±4.42 AUC 2 316.00±325.27缺血再灌注組地塞米松組F 值P 值55.58±2.36①57.50±7.99 5.284 0.018 30.78±1.25①24.30±0.62②371.554 0.000 106.1±10.87①76.77±13.97②68.250 0.000 8 034.24±1 063.61①5 962.89±711.06②86.570 0.000組別假手術組再灌注后3 d Peak/%51.73±5.54 TP/s 17.00±1.17 MTT/s 39.21±5.81 AUC 2 758.38±363.37缺血再灌注組地塞米松組F 值P 值66.07±2.83①③50.87±6.34②16.628 0.000 34.83±0.68①③28.10±1.05②499.362 0.000 154.41±15.89①③102.4±12.90②132.326 0.000 13 593.68±1 616.49①③7 010.22±1 032.60②140.757 0.000組別假手術組再灌注后5 d Peak/%48.01±2.80 TP/s 16.74±1.35 MTT/s 39.97±5.81 AUC 2 630.95±452.73缺血再灌注組地塞米松組F 值P 值52.41±6.02 48.27±7.42 1.102 0.358 26.28±0.88①④22.17±0.99②114.574 0.000 76.53±10.84①④64.25±17.36 13.760 0.000 5 499.37±1 053.63①④4 178.10±1 061.06②15.200 0.000組別假手術組再灌注后7 d Peak/%48.30±4.29 TP/s 16.15±1.01 MTT/s 38.43±6.97 AUC 2 553.12±529.72缺血再灌注組地塞米松組F 值P 值52.50±3.34 49.36±5.32 1.488 0.257 22.67±1.26①⑤20.45±1.19②49.240 0.000 63.58±22.95①45.96±5.18②4.977 0.022 4 471.07±1 411.11①3 120.43±576.76②6.709 0.008

2.2 3組大鼠腎臟病理變化

假手術組腎小管、腎小球清晰顯示，病理形態(tài)學未見明顯改變。與假手術組相比較，缺血再灌注組腎臟均有不同程度的病理損傷，且在再灌注后3 d 時損傷最為嚴重，表現(xiàn)為腎小管管腔擴張明顯，部分腎小管輪廓結構消失，刷狀緣脫落，并可見大量炎癥細胞浸潤，隨后損傷逐漸減輕，在再灌注后7 d 時明顯減輕。而地塞米松組腎臟損傷均有不同程度的減輕。見圖2。

圖2 3組大鼠腎臟病理變化結果（HE 染色×200）

2.3 3組大鼠血肌酐、尿素氮水平比較

3 組大鼠血肌酐、尿素氮水平比較，經(jīng)析因設計的方差分析，結果：①再灌注后不同時間點的血肌酐、尿素氮水平有差異（F=256.337 和152.052，均P=0.000）；②3 組大鼠的血肌酐、尿素氮水平有差異（F=352.433 和213.265，均P=0.000）；③3 組大鼠的血肌酐、尿素氮水平隨再灌注后時間的變化趨勢有差異（F=79.108 和46.941，均P=0.000）。進一步兩兩比較，采用LSD-t檢驗，結果：缺血再灌注組再灌注后3 d 的血肌酐、尿素氮水平與再灌注后1 d 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；再灌注后5 d 的血肌酐、尿素氮水平與再灌注后3 d 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；再灌注后7 d 的尿素氮水平與再灌注后5 d 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠血肌酐、尿素氮比較 （n=6，±s）

表2 3組大鼠血肌酐、尿素氮比較 （n=6，±s）

注：①與假手術組比較，P ＜0.05；②與缺血再灌注組比較，P ＜0.05；③與缺血再灌注組再灌注后1 d比較，P ＜0.05；④與缺血再灌注組再灌注后3 d比較，P ＜0.05；⑤與缺血再灌注組再灌注后5 d比較，P ＜0.05。

組別假手術組再灌注后1 d血肌酐/mol/L 27.60±1.65尿素氮/mmol/L 8.60±0.98再灌注后3 d血肌酐/mol/L 29.92±2.45尿素氮/mmol/L 9.47±1.34再灌注后5 d血肌酐/mol/L 29.10±1.91尿素氮/mmol/L 8.98±1.08再灌注后7 d血肌酐/mol/L 28.48±1.92尿素氮/mmol/L 9.00±1.02缺血再灌注組地塞米松組F 值P值69.33±12.02①41.10±7.83②39.160 0.000 29.11±6.08①14.18±1.28②51.123 0.000 154.28±12.24①③91.53±10.89②253.464 0.000 71.38±12.49①③40.38±5.58②91.304 0.000 52.35±3.75①④37.53±4.60②64.148 0.000 28.30±3.22①④11.08±1.65②141.599 0.000 44.33±6.27①33.75±2.24②24.424 0.000 12.43±1.15①⑤10.13±0.91②17.212 0.000

3 討論

圍手術期術中循環(huán)的暫時中斷會造成腎臟血流灌注量的減少，再灌注時不可避免的會導致腎臟的損傷[8-9]，對于此，臨床尚無確切有效的治療方法[10-11]。目前腎功能早期變化檢測方法的檢測費用高、耗時長，易受外界因素影響[12]，因此，臨床迫切需要尋找一種有效的腎臟缺血再灌注損傷治療方法和簡便、無創(chuàng)的腎功能早期變化檢測手段。既往研究證明地塞米松可減輕腎臟缺血再灌注損傷，但目前關于利用超聲造影來監(jiān)測藥物干預腎臟缺血再灌注損傷療效的研究相對較少，研究的時間點也較為局限，TIC 曲線中相關參數(shù)的參考價值尚無統(tǒng)一的標準。本研究選擇再灌注后1 d、3 d、5 d、7 d 4 個時間點，旨在分析不同時間點及地塞米松干預后TIC 曲線中的各參數(shù)的變化，以期為后續(xù)腎臟缺血再灌注損傷相關疾病的療效評估提供一個有效的檢測方法。

超聲造影劑是一種理想的血流示蹤劑，具有良好的聲學效應和穩(wěn)定性，隨呼吸運動經(jīng)肺排出，不具有腎毒性[13-14]。研究表明，超聲造影可以定量的反映腎臟血流灌注情況，因此被廣泛地應用于各種腎臟疾病的診斷中[15-19]。腎皮質血流灌注約占整個腎臟的90%，因此選擇腎皮質作為ROI 可以反映整個血流腎臟的血流灌注情況[20]。本研究中，Peak 在腎臟損傷最嚴重時（再灌注后3 d）達到最大值，而地塞米松組再灌注后1 d、5 d、7 d 的Peak 值與缺血再灌注組比較，差異無統(tǒng)計學意義，分析原因可能是Peak 代表峰值濃度，是指所選擇ROI 內超聲造影劑達到最大值時的強度，代表是瞬時效應，這與LI 等[21]所得出實驗結果一致，因此Peak值不能完全作為反映腎皮質血流灌注變化的定量指標。缺血再灌注組與假手術組相比，MTT、TP延長，AUC 增加。分析其原因：TP 代表達峰時間，一定程度上取決于腎皮質的血流速度，MTT 代表平均渡越時間，反映超聲造影劑的灌注速度和廓清速度。腎臟缺血再灌注后白細胞大量黏附、滯留，可導致微循環(huán)受損，白細胞和血管內皮細胞的相互作用可導致血管內皮細胞受損，進一步增加血管的通透性，引起組織的水腫[22-23]。此外，組織缺血缺氧時，體內循環(huán)血量減少，興奮交感神經(jīng)，導致腎素的分泌增加，活化血管緊張素，使微循環(huán)收縮，外周阻力升高。這些改變導致腎皮質血流速度延緩，超聲造影劑灌注速度與廓清速度降低，在TIC 曲線中表現(xiàn)為MTT、TP 的延長。AUC 反映的是在一定時間內所選取ROI 內超聲造影劑的累積效應，腎臟缺血再灌注后血管內皮細胞的通透性增加，使大量的炎癥細胞瘀滯于微血管和間質中，瘀滯的炎癥細胞對超聲造影劑仍具有一定的吞噬作用，被吞噬了的微泡可以繼續(xù)保留其聲學活性，形成造影增強的累積效應，最終使AUC 增大[24]。

外源性給予地塞米松后，病理分析發(fā)現(xiàn)地塞米松組腎臟組織病理損傷均有不同程度減輕，血肌酐、尿素氮水平降低，也進一步說明了地塞米松可以減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷。TIC 曲線中相關參數(shù)也表現(xiàn)出一致的趨勢，分析原因可能是外源性給予地塞米松后，減緩了炎癥介質的釋放及炎癥細胞的浸潤[25]，微循環(huán)阻力降低，腎皮質血流灌注速度得到一定程度的改善，超聲造影劑的灌注和廓清速度加快，因此在TIC 曲線中表現(xiàn)為TP、MTT 的縮短。炎癥的抑制使得炎癥細胞對超聲造影劑的吞噬量減少，因此一定時間內超聲造影劑累積量減少，在TIC 曲線上表現(xiàn)為AUC 的減小，進一步從微循環(huán)的角度證明了地塞米松可以有效地減輕腎臟缺血再灌注損傷。腎臟在缺血再灌注后3 d 損傷最為嚴重，此期是一個“危險期”，度過此期時腎臟功能可逐漸恢復，分析TIC 曲線參數(shù)結果發(fā)現(xiàn)TP、MTT 及AUC 與此表現(xiàn)出一致的趨勢。但缺血再灌注組再灌注后5 d、7 d 的MTT、AUC 及血肌酐比較，差異無統(tǒng)計學意義，其原因可能是隨著再灌注時間的延長，腎功能逐漸恢復，MTT、AUC 及血肌酐可能并不能敏感地反映出這些微小的變化，因此還需擴大實驗的樣本量來進一步說明MTT、AUC 及血肌酐在評價腎臟皮質微循環(huán)改變的參考價值。

綜上所述，超聲造影可以定量反映大鼠腎缺血再灌注后不同時間點及藥物干預后腎臟微循環(huán)的改變，其中TP 具有較大參考價值。但本研究樣本量相對較少，且分析的ROI 只是一個二維切面，只能代表腎臟血流灌注的基本情況。下一步將繼續(xù)擴大樣本量、研究時間點及利用三維立體超聲的檢測方法，進一步提高實驗的準確性，以期為臨床監(jiān)測腎臟缺血再灌注損傷相關疾病的療效提供一個簡便有效的方法。