孫廷宇 王 琦 葉合敏 曾 超 李婧男 李發(fā)琪

高強(qiáng)度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）是一種靶向、無創(chuàng)的腫瘤消融方法，但對于體積較大、血供豐富的腫瘤，其治療時(shí)間相對較長、有效率較低［1］。研究［2］表明，氟碳液滴可以通過HIFU 的熱效應(yīng)在體內(nèi)相變?yōu)槲⑴荩淖兘M織的聲學(xué)特性增強(qiáng)聲散射，以及增強(qiáng)能量在靶區(qū)的聚集，從而提高HIFU 的治療有效率。HIFU 聯(lián)合氟碳液滴增效機(jī)制的應(yīng)用已有文獻(xiàn)［3］報(bào)道，但其體內(nèi)空化活動(dòng)變化及術(shù)后組織再生的病理過程鮮有報(bào)道，同時(shí)空化效應(yīng)過度可能會(huì)造成不必要的損傷［4］。基于此，本實(shí)驗(yàn)對比分析單純HIFU 及其聯(lián)合脂質(zhì)納米氟碳液滴（lipid-perfluorocarbon nanodroplets，L-PFP）消融兔肝的空化活動(dòng)和病理變化，旨在為氟碳液滴用于HIFU 臨床治療肝腫瘤提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔24只（由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.2 kg；本實(shí)驗(yàn)經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：SCXK 2012-0001）。

二、主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.儀器：透射電子顯微鏡（JEM-1400PLUS，日本電子株式會(huì)社）；馬爾文激光粒徑儀（Zeta Sizer 3000HS，英國馬爾文儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，亞榮生化儀器廠）；超聲處理器（VCX150，美國Sonic 公司）；海扶刀?聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)（JC 200，重慶海扶醫(yī)療科技股份有限公司）；被動(dòng)空化檢測（PCD）系統(tǒng)配備的平面壓電換能器（panametrics V309-SU，中心頻率5 MHz，美國泛美公司），超高速數(shù)據(jù)采集卡（PXIe-5122，美國國家儀器公司），LabVIEW開發(fā)平臺(tái)（v2015，美國國家儀器公司）。

2.試劑：棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、磷脂PEG 馬來酰亞胺（DSPE）、膽固醇均購自美國Avanti 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國HyClone 公司；全氟戊烷、氯仿均購自中國阿拉丁公司；戊巴比妥購自北京化學(xué)試劑公司；全氟戊烷（PFP）購自美國Stream Chemical公司。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.L-PFP 的制備：將6 mg DPPC、2 mg DSPE、2 mg膽固醇及5 ml 氯仿加入圓底燒瓶均勻混合，然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加熱蒸發(fā)，直至底部生成均勻的脂質(zhì)薄膜；加入5 ml PBS（pH 值7.4）收集脂質(zhì)體。冰浴下將200 μl PFP 加入脂質(zhì)體中，使用超聲處理器（聲功率130 W，處理時(shí)間120 s，超聲頻率20 kHz，占空比45%）對混合溶液進(jìn)行乳化，制得L-PFP，低溫離心后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.HIFU消融：實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物禁食24 h，隨機(jī)分為對照組（單純HIFU 組）和聯(lián)合組（L-PFP 聯(lián)合HIFU），每組各12只。聯(lián)合組經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥溶液用于麻醉兔（1 ml/kg），注射L-PFP（0.8 ml/kg），1 min后應(yīng)用超聲確定其肝臟位置，并使用聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)以能量900 J的連續(xù)波進(jìn)行HIFU輻照。對照組麻醉后僅以相同參數(shù)進(jìn)行HIFU 輻照。觀察兩組強(qiáng)回聲區(qū)范圍，使用HIFU 自帶的GreyAnalyse 軟件勾畫感興趣區(qū)并計(jì)算灰度變化值。

3.空化檢測：應(yīng)用HIFU 自帶的超聲成像系統(tǒng)對比分析輻照前后兔肝組織的回聲變化；應(yīng)用PCD 系統(tǒng)檢測空化特征信號(hào)，并根據(jù)空化信號(hào)的寬帶噪聲（root mean square，RMS）曲線規(guī)律計(jì)算累積瞬態(tài)空化劑量［5］。

4.實(shí)驗(yàn)室及病理檢查：兩組兔均于輻照前1 d和輻照后即刻、1 d、3 d、7 d 行心臟采血檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）。分別于HIFU輻照后即刻、1 d、3 d、7 d將消融的兔肝取出體外，觀察大體標(biāo)本。取消融區(qū)、交界區(qū)及周圍區(qū)（距消融區(qū)邊緣3 mm以外）組織，以4%甲醛固定、石蠟包埋、切片，HE 染色后進(jìn)行病理觀察。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以x±s表示，組間兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、L-PFP物化表征

L-PFP 溶液呈乳白色，靜置過夜后分層，上層為透明液體，下層為乳白色沉淀。馬爾文激光粒徑儀測得L-PFP 粒徑為（278.33±26.06）nm，透射電子顯微鏡顯示脂質(zhì)體成功包載PFP（圖1）；制備的L-PFP 24 h 內(nèi)粒徑無明顯變化，穩(wěn)定性良好。

圖1 L-PFP透射電鏡圖

二、HIFU消融情況

使用聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)以900 J能量輻照后，對照組與聯(lián)合組均出現(xiàn)強(qiáng)回聲，輻照區(qū)域邊界清晰，聯(lián)合組強(qiáng)回聲區(qū)范圍大于對照組。對照組和聯(lián)合組灰度變化值分別為45.60±4.07和88.00±7.21，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 對照組與聯(lián)合組輻照前后超聲圖像

三、空化檢測結(jié)果

HIFU輻照過程中兩組RMS均總體增強(qiáng)，且隨時(shí)間波動(dòng)，聯(lián)合組RMS 高于對照組（P＜0.05）。聯(lián)合組累積瞬態(tài)空化劑量為0.69±0.07，顯著高于對照組0.11±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 兩組HIFU輻照過程中RMS變化情況

四、大體標(biāo)本變化情況

聯(lián)合組與對照組病灶輻照后即刻呈現(xiàn)橢圓形，中心區(qū)域可見組織壞死，與正常肝組織分界清晰，交界處可見充血帶，聯(lián)合組消融灶顯著大于對照組。輻照后1 d 兩組中心區(qū)域均呈凝固性壞死，對照組充血帶消失，聯(lián)合組充血帶減??；輻照后3 d 對照組表現(xiàn)為中心組織壞死，周圍出現(xiàn)白色炎癥反應(yīng)帶，聯(lián)合組表現(xiàn)為中心組織壞死，充血帶消失，未見炎癥反應(yīng)帶出現(xiàn)；輻照后7 d 對照組可見消融灶消失，聯(lián)合組可見中心組織壞死，周圍伴一層白色炎癥反應(yīng)帶。見圖4。

圖4 對照組與聯(lián)合組輻照后各時(shí)間點(diǎn)消融灶大體圖

五、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

聯(lián)合組與對照組輻照后即刻、1 d、3 d、7 d ALT 和AST均呈先增高后降低的趨勢，聯(lián)合組輻照后1 d、3 d、7 d ALT 和AST 均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 HIFU輻照前后兔肝功能指標(biāo)變化情況（x±s） U/L

六、病理檢查結(jié)果

聯(lián)合組輻照后即刻消融區(qū)域與正常組織邊界清晰，消融區(qū)域內(nèi)肝組織明顯破壞，肝細(xì)胞完全消失，被大量紅染的蛋白物質(zhì)代替，可見細(xì)胞碎裂；輻照后1 d消融區(qū)域邊界周圍伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，消融區(qū)域與正常組織邊界清晰；輻照后3 d 消融區(qū)域邊界出現(xiàn)條帶狀纖維化，消融區(qū)域與正常組織邊界清晰；輻照后7 d 消融區(qū)域邊緣可見較多正常肝細(xì)胞，并伴有條帶狀纖維化及少量炎性細(xì)胞浸潤。對照組輻照后即刻消融區(qū)域邊界較模糊，可見淤血和局部腫脹，其內(nèi)肝細(xì)胞破壞不徹底；輻照后1 d 可見炎性細(xì)胞浸潤，邊界較清晰；輻照后3 d 消融區(qū)域邊緣可見較多正常肝細(xì)胞，同時(shí)伴有條帶狀纖維化及少量炎性細(xì)胞浸潤；輻照后7 d消融灶消失，恢復(fù)為正常肝組織。見圖5。

圖5 對照組與聯(lián)合組HIFU輻照后各時(shí)間點(diǎn)肝組織病理圖（HE染色，×100）

討論

HIFU是一種安全、有效、無創(chuàng)的肝腫瘤消融療法，其輻照過程中產(chǎn)生的超聲高回聲和RMS 變化與其引起的空化效應(yīng)密切相關(guān)［6-7］。肝組織血供豐富，消融時(shí)產(chǎn)生的能量易被血流阻擋或隨傳播深度增加發(fā)生聲衰減，以及因靶區(qū)密度不均勻而不易沉積等［8］，嚴(yán)重影響了HIFU 的消融效果。因此，降低聲阻抗，改善組織聲環(huán)境，使超聲能量有效沉積于靶區(qū)，是目前HIFU 研究的熱點(diǎn)。

氟碳液滴常溫下為液態(tài)，當(dāng)溫度升高或超聲輻照時(shí)在體內(nèi)相變?yōu)槲⑴?，可以改變組織的聲學(xué)特性，增強(qiáng)能量沉積，從而增強(qiáng)HIFU 的消融效果［9］。He 等［10］采用載全氟己烷的富勒烯納米球增效HIFU 治療離體牛肝時(shí)發(fā)現(xiàn)，與單純HIFU 組比較，納米球組凝固性壞死體積增大了約1.2 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。丁曉亞等［11］將離體牛肝分為不同濃度包覆PFP 的介孔氧化硅微球組，使用HIFU 輻照后發(fā)現(xiàn)隨著微球濃度增高，凝固性壞死體積也隨之增加。表明氟碳液滴對HIFU 有增效作用，但并未進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證并探討其增效機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)采用薄膜水化法成功制備L-PFP，然后聯(lián)合HIFU 輻照兔肝。結(jié)果表明輻照后對照組和聯(lián)合組灰度變化值分別為45.60±4.07 和88.00±7.21，累積瞬態(tài)空化劑量分別為0.11±0.01 和0.69±0.07，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。表明L-PFP 聯(lián)合HIFU 可以引起更強(qiáng)烈的空化泡群，空化效應(yīng)顯著增強(qiáng)。兩組輻照后1 d ALT 和AST 均較術(shù)前顯著增高且隨時(shí)間降低，聯(lián)合組輻照后1 d、3 d、7 d ALT 和AST 均明顯高于對照組（均P＜0.05），對照組輻照前與輻照后7 d 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明對照組輻照后7 d 時(shí)消融灶損傷修復(fù)完全或損傷不明顯，表明兩組均產(chǎn)生肝組織損傷和修復(fù)，L-PFP 提高了HIFU 對肝組織的損傷效果。本研究大體標(biāo)本及病理檢查顯示，聯(lián)合組較對照組造成消融區(qū)域的肝細(xì)胞損傷和肝淤血現(xiàn)象更嚴(yán)重；隨著時(shí)間推移，兩組均出現(xiàn)充血水腫，并在消融灶周圍形成肉芽組織，纖維組織增生，消融灶縮小。無論是解剖壞死范圍還是損傷修復(fù)時(shí)間，聯(lián)合組均明顯大于對照組，證明L-PFP 在動(dòng)物體內(nèi)對HIFU 消融肝組織有增效作用。

綜上所述，L-PFP 聯(lián)合HIFU 消融時(shí)，空化效應(yīng)顯著增強(qiáng)，對肝臟的消融效果明顯提高，消融灶修復(fù)時(shí)間延長，為探討氟碳液滴增效HIFU 在臨床上的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)僅探討了氟碳液滴對HIFU消融正常兔肝的空化活動(dòng)及病理變化，其對熱效應(yīng)及肝腫瘤模型的影響仍需今后進(jìn)一步研究。